EE - EP 1 979 474 B1 KIRJELDUS [0001] Käesolev leiutis käsitleb eelkõige uusi rekombinantseid telomeraasi pöördtranskriptaase, neid kodeerivaid nukleiinhappemolekule, nimetatud nukleiinhappemolekule sisaldavaid rakke ja nende rakkude kasutamist huvialuse aine tootmiseks. [0002] 1965. aastal avastas L. Hayflick, et rakkude surmahetk on progammeeritud. Vananemise ühe selgitusena esitas ta arvamuse, et inimese raku jagunemiste arv on piiratud (Exp. Cell Res., märts 1965, 37, 614-636). Nüüd on teada, et selle põhjustab telomeeride lühenemine rakkude jagunemise käigus. Kromosoomide otstes paiknevad telomeerid, mis koosnevad konserveerunud, tandemkordustes mittekodeerivast heksameersest DNA järjestusest, mis on seotud ühe- ja kaheahelaliste sidumisvalkudega. Telomeerid vastutavad genoomi stabiilsuse eest ja eriti kromosoomide otste replikatsiooni eest. Kromosoomide otste edukaks replikatsiooniks on vajalik nii unikaalne telomeeristruktuur kui ka spetsiaalne ensüüm telomeraasi pöördtranskriptaas, mis on pöördtranskriptaasse ensümaatilise aktiivsusega nukleoproteiin. Telomeraasi pöördtranskriptaas on suuteline pikendama telomeeri kordusterida, mis võimaldab pikendada komplementaarse tütarahela replikatsiooni. Rakkudes, milles telomeraasi pöördtranskriptaas puudub, lüheneb telomeerne DNA järjestikuste jagunemiste käigus, kuna DNA-d sünteesivad ensüümid ei ole pärast initsieeriva RNA-praimeri eemaldamist suutelised kromosoomide otsi täielikult replitseerima. Paljudes töödes on avaldatud tõendusmaterjali selle kohta, et inimese rakkude eluea pikkuse tähtsaks tunnusjooneks on niinimetatud telomeerikell. Rakkude vananemise telomeeri-hüpoteesi kohaselt on telomeeri lühenemine seotud telomeraasi pöördtranskriptaasi aktiivsuse puudumisega, mis käivitab kromosoomide ebastabiilsuse, mis viib vananemisele ja apoptoosile. Telomeraasi pöördtranskriptaasi aktiivsus on somaatilistes rakuliinides arengu kestel in vivo ja primaarsetes rakkudes in vitro alla reguleeritud ning see korreleerub telomeeride lühenemisega. Vastupidine protsess, telomeraasi pöördtranskriptaasi aktiivsuse ülesreguleerimine või regulatsiooni häiritus, esineb transformeeritud rakkudes ja kasvajates. Telomeraasi pöördtranskriptaasi (telomerase reverse transcriptase, TERT) cdna on kloonitud ja uuritud mitme imetaja ja ühe kahepaikse organismidest (Nakamura jt, Science, 1997, 277, 955-959; Greenberg jt, Oncogene, 1998, 16, 1723-1730). [0003] Kuna TERT üleekspressioon rakus viib nimetatud raku immortaliseerumisele (surematuks muutumisele), on TERT kasutamist pakutud rakuliinide tootmiseks (McSharry jt, J. Gen. Virol., 2001, 82, 855-863). Kuid TERT aktiivsus on piiratud liigiga. Näiteks inimese
2 TERT ei ühildu linnu telomeeri säilitamise masinavärgiga (Michailidis jt, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2005, 335 (1), 240-246). Seetõttu on lindude, täpsemalt partlaste (Anatidae) rakuliinide väljatöötamiseks vajalik TERT, mis toimib nendes konkreetsetes rakkudes. [0004] Delany jt (Delany, M. E., Daniels, L. M., Gene, 15. sept 2004, 339, 61-69) on avaldanud TERT polüpeptiidi, mis on eraldatud kanast (Gallus domesticus) (chtert), kes kuulub faasanlaste (Phasianidae) sugukonda, ja vastava nukleiinhappejärjestuse. Autorid näitavad, et selgroogsete (st kana, inimese, kannuskonna, hiire, roti ja hamstri) TERT polüpeptiidid on spetsiifilistes piirkondades konserveerunud. Selle artikli autorid aga ei avalda ega paku välja, et chtert polüpeptiidi kodeerivat nukleiinhappemolekuli võiks kasutada rakkude immortaliseerimiseks, mis oleksid mõeldud viiruste või huvipakkuvate molekulide tootmiseks. Delany jt isegi ei viita oma huvile kloonida enam lindude TERT valke. [0005] Fragnet jt (Fragnet, L., Kut, E., Rasschaert, D., J. Biol. Chem., 24. juuni 2005, 280 (25), 23502-23515) on avaldanud ülevaateartikli, mis käsitleb viiruste ja telomeraasiaktiivsuse aktivatsiooni vahelist sõltuvust. Autorid märgivad, et telomeraasi aktiivsus võib olla seotud vähi tekkega, ning esitavad telomeraasi aktiivsust kui ühte tegurit paljude teiste hulgas kasvajageneesi paljutegurilises protsessis, mis hõlmab rakutsükli erinevate valkude ja DNA parandamissüsteemide ekspressiooni reguleerimatust. [0006] Eukarüootsed rakuliinid on põhilised rakuliinid viirusvaktsiinide ja paljude biotehnoloogiliste produktide tootmiseks. Rakukultuurides toodetavate bioloogiliste produktide hulka kuuluvad ensüümid, hormoonid, immunobioloogilised produktid (monokloonsed antikehad, interleukiinid, lümfokiinid) ja vähivastased vahendid. Ehkki paljusid lihtsamaid valke saab toota ka bakterirakkude kasutamise abil, tuleb komplekssemaid valke, mis on glükosüülitud, praegu teha eukarüoodirakkudes. [0007] Eriti kasulikud on lindude rakuliinid, kuna paljud farmatseutilistes kompositsioonides kasutatavad viirused on võimelised nendes replitseeruma. Mis veelgi tähelepanuväärsem mitmesugused viirused on võimelised kasvama ainult lindude rakkudes. Selline juhtum on näiteks modifitseeritud Ankara-viirus (Modified Virus Ankara, MVA), mis ei suuda kasvada enamikus imetajarakkudes. Seda poksviirust, mis saadi vaktsiiniaviirusest enam kui 500 ümberkülvi abil kana embrüo fibroblastides (CEF), kasutati seitsmekümnendate aastate alguses immuunpuudulikkusega inimeste vaktsineerimiseks rõugete vastu. Praegu kasutatakse MVA-d peamiselt vektorina geeniravi ja immuunravi eesmärgil. Näiteks kasutatakse MVA-d MUC1 geeni kandva vektorina patsientide vaktsineerimiseks seda antigeeni ekspresseeriva
3 kasvaja vastu (Scholl jt, J. Biomed. Biotechnol., 2003, 3, 194-201). HPV antigeene kodeerivaid MVA-d kandvaid geene kasutatakse ka vektorina raskete tservikaalvigastuste ravimiseks. Viimasel ajal on MVA olnud valitud vektoriks profülaktilise ravi ettevalmistamisel uuesti välja ilmunud haiguste või võimaliku bioloogilise relva, nagu Lääne-Niiluse viirus või antraks, vastu. [0008] Seetõttu on olemas vajadus uue telomeraasi pöördtranskriptaasi järele, mis oleks suuteline immortaliseerima lindude rakke, täpsemalt partlaste rakke. [0009] Kogu selles taotluses kasutatakse inglisekeelseid termineid a ja an selles mõttes, et nende tähendus on vähemalt üks, vähemalt esimene, üks või enam viidatud komponent(i) või etapp(i) või nende komponentide või etappide paljusus, kui just kontekst ei määra selgelt teisiti. Näiteks termin rakk hõlmab rakkude paljusust, kaasa arvatud nende segud. [0010] Termin ja/või hõlmab siin kasutatuna tähendusi ja, või ja kõik või ükskõik missugused teised nimetatud terminiga seotud elementide kombinatsioonid. [0011] Siin kasutatutena on terminid sisaldab ja sisaldavad mõeldud tähendama seda, et produktid, kompositsioonid ja meetodid hõlmavad viidatud komponente või etappe, kuid ei välista teisi. Termin koosneb oluliselt tähendab juhul, kui seda kasutatakse produktide, kompositsioonide ja meetodite määratlemiseks, kõigi teiste olulise tähtsusega komponentide või etappide väljajätmist. Seega ei välista kompositsioon, mis koosneb olulistest loetletud komponentidest, mikrolisandeid ja farmatseutiliselt vastuvõetavaid kandjaid. Termin koosneb tähendab teiste komponentide või etappide väljajätmist, kui tegemist ei ole just mikroelementidega. [0012] Käesolev leiutis käsitleb eraldatud või rekombinantset polüpeptiidi, mis sisaldab aminohappejärjestust, mis on vähemalt 80% ulatuses identne Cairina moschata telomeraasi pöördtranskriptaasi aminohappejärjestusega SEQ ID N o :1. Leiutise eelistatavamas teostuses sisaldab leiutisekohane polüpeptiid aminohappejärjestust, mis on vähemalt 90% ulatuses identne aminohappejärjestusega SEQ ID N o 1. Veelgi eelistatavamas teostuses sisaldab leiutisekohane polüpeptiid aminohappejärjestust, mis on esitatud järjestusega SEQ ID N o :1. [0013] Leiutisekohasel polüpeptiidil on TERT aktiivsus ja see võimaldab partlaste sugukonda kuuluvate rakkude immortaliseerimist. [0014] Siin kasutatuna tähendavad terminid eraldatud ja/või rekombinantne, et selliselt tähistatud nukleiinhappemolekul, DNA, RNA, polüpeptiidid või valgud on sellisel kujul too-
4 detud inimkätega ja eraldatud seega oma natiivsest in vivo rakukeskkonnast. Inimese sekkumise tulemusena on leiutisekohased rekombinantsed DNA-d, RNA-d, polüpeptiidid ja valgud kasulikud sellistel siin kirjeldatud viisidel, kus natiivselt esinev(ad) DNA, RNA, polüpeptiidid või valgud seda ei oleks. [0015] Järgmises teostuses esitab käesolev leiutis eraldatud või rekombinantse nukleiinhappemolekuli, mis kodeerib leiutisekohast polüpeptiidi. [0016] Käesoleva leiutise eelistatavas teostuses sisaldab leiutisekohast polüpeptiidi kodeeriv nukleiinhappemolekul nukleiinhappejärjestust, mis on vähemalt 90% ulatuses identne nukleiinhappejärjestusega SEQ ID N o :2. Eelistatavalt on nimetatud nukleiinhappemolekul vähemalt 95% ulatuses identne nukeiinhappejärjestusega, mis on esitatud järjestusega SEQ ID N o :2. Leiutisekohast polüpeptiidi kodeerivad eelistatavad nukleiinhappemolekulid sisaldavad sama nukleiinhappejärjestust kui järjestusega SEQ ID N o :2 esitatud nukleiinhappejärjestus. [0017] Leiutisekohane nukleiinhappemolekul võib olla RNA, cdna või genoomne järjestus või segatüüpi järjestus. Kui on sobiv, võib see sisaldada ühte või mitut intronit, kusjuures need võivad olla natiivsed, heteroloogsed (näiteks küüliku β-globiini geenide intronid jne.) või sünteetilise päritoluga, et suurendada nukleiinhappe ekspressiooni peremeesrakkudes. [0018] Käesolev leiutis käsitleb ka vektorit, mis kannab leiutisekohast eraldatud või rekombinantset nukleiinhappemolekuli. [0019] Siin kasutatuna on termin vektor mõeldud tähendama plasmiidse või viirusliku päritoluga vektorit ja valikuliselt sellist vektorit, mis on kombineeritud ühe või enama ainega, mis parendavad transfektsiooni efektiivsust ja/või nimetatud vektori stabiilsust ja/või nimetatud vektori kaitset in vivo peremeesorganismi immuunsüsteemi vastu. Selliseid aineid on laialdaselt dokumenteeritud kirjanduses, mis on eriala asjatundjale kättesaadav (vt näiteks Felgner jt, Proc. West Pharmacol. Soc., 1987, 32, 115-121; Hodgson ja Solaiman, Nature Biotechnology, 1996, 14, 339-342; Remy jt, Bioconjugate Chemistry, 1994, 5, 647-654). Illustreerimiseks, kuid ilma piiranguteta, võivad need olla polümeerid, lipiidid, eelkõige katioonsed lipiidid, liposoomid, tuuma- või viirusvalgud või neutraalsed lipiidid. Neid aineid võib kasutada kas üksi või kombineerituna. Nende ühendite näited on konkreetselt kättesaadavad patenditaotlustes WO 98/08489, WO 98/17693, WO 98/34910, WO 98/37916, WO 98/53853, EP 890362 või WO 99/05183. Kombinatsioon, mida võib kaalutleda, on rekombinantne plasmiidvektor, mis on kombineeritud katioonsete lipiididega, mis on eriala asjatundjale teada ja millest paljud on kaubanduslikult kättesaadavad, kuid neid on võimalik konst-
5 rueerida või modifitseerida ka geenitehnoloogia meetodite abil. Näidetena võib märkida plasmiide, mis on tuletatud plasmiididest pbr322 (Gibco BRL), puc (Gibco BRL), pbluescript (Stratagene), ppep4, pcep4 (Invitrogene) või ppoly (Lathe jt Gene, 1987, 57, 193-201). Eelistatavalt sisaldab käesoleva leiutise kontekstis kasutatav plasmiid replikatsiooni alguspunkti, mis tagab replikatsiooni käivitamise teda tootvates rakkudes ja/või peremeesrakkudes (näiteks võib E. coli rakkudes tootmiseks mõeldud plasmiidi jaoks valida ColE1 alguspunkti ning juhul, kui soovitakse, et plasmiid oleks imetaja-peremeesrakkudes isereplitseeruv, valida orip/ebna1 süsteemi; Lupton ja Levine, Mol. Cell Biol., 1985, 5, 2533-2542; Yates jt, Nature, 313, 812-815). Plasmiid võib sisaldada täiendavaid elemente, mis parendavad tema püsimist ja/või stabiilsust antud rakus (cer-järjestus, mis soodustab plasmiidi püsimist monomeersena; Summers ja Sherrat, Cell, 1984, 36, 1097-1103, rakugenoomi integreerimiseks mõeldud järjestused). [0020] Mis puutub viirusvektoritesse, siis on võimalik kaalutleda vektorit, mis pärineb poksviirusest (vaktsiiniaviirus, eelkõige MVA, canarypox jne.), adenoviirusest, retroviirusest, herpesviirusest, alfaviirusest, vahutavast (foamy) viirusest või adenoviirusega assotsieerunud viirusest. Eelistatavalt kasutatakse mittereplitseeruvat viirust. Selles suhtes on adenoviirusvektorid käesoleva leiutise teostamiseks eriti sobivad. [0021] Leiutise eelistatava teostuse kohaselt sisaldab leiutisekohane vektor täiendavalt leiutisekohase nukleiinhappemolekuli peremeesrakus ekspressiooniks vajalikke elemente. [0022] Ekspressiooniks vajalikud elemendid koosnevad elementide komplektist, mis võimaldab nukleotiidjärjestuse transkriptsiooni RNA-ks ja mrna translatsiooni polüpeptiidiks, eelkõige promootorjärjestust ja/või regulatoorseid järjestusi, mis on nimetatud rakus efektiivsed, ning valikuliselt järjestusi, mis on vajalikud nimetatud polüpeptiidi sekretsiooniks või sihtraku pinnal ekspresseerumiseks. Need elemendid võivad olla reguleeritavad või konstitutiivsed. Muidugi on promootor kohandatud valitud vektorile ja peremeesrakule. Näitena võib märkida geenide PGK (fosfoglütseraatkinaas), MT (metallotioneiin, McIvor jt, Mol. Cell Biol., 1987, 7, 838-848), α-1-antitrüpsiini ja CFTR eukarüootseid promootoreid, lihase kreatiinkinaasi, aktiini pulmonaalset pindaktiivset ainet, immunoglobuliini või β-aktiini (Tabin jt, Mol. Cell Biol., 1982, 2, 416-436) kodeerivate geenide promootoreid, SRα promootorit (Takebe jt, Mol. Cell, 1988, 8, 466-472), SV40 viiruse (Simian Virus, ahviviirus) varast promootorit, RSV (Rousi sarkoomiviirus), LTR, MPSV promootorit, TK-HSV-1 promootorit, CMV (tsütomegaloviiruse) varast promootorit, vaktsiiniaviiruse promootoreid
6 p7.5k, ph5r, pk1l, p28, p11 ning adenoviiruse promootoreid E1A ja MLP või nimetatud promootorite kombinatsioone. Kõige enam eelistatav on tsütomegaloviiruse (CMV) varane promootor. [0023] Vastavalt eelistatavale teostusele sisaldab leiutisekohane vektor veel kahte järjestust, mis on homoloogsed rakugenoomi suhtes natiivse sihtmärk-dna piirkonnas sisalduva järjestuseosaga. Nimetatud homoloogsete järjestuste olemasolu võimaldab leiutisekohase nukleiinhappemolekuli saidispetsiifilist insertsiooni sihtmärk-dna järjestusse homoloogse rekombinatsiooni abil. [0024] Termin homoloogne rekombinatsioon tähendab DNA fragmentide vahetust kahe DNA molekuli vahel oluliselt identsete nukleotiidjärjestuste saidis. Eelistatavalt on vektoris olevad homoloogsed järjestused sihtmärkjärjestuse piirkonnaga sada protsenti homoloogsed. Võib aga kasutada ka väiksemat järjestuste homoloogiat. Nii võib kasutada ainult 80% järjestuste homoloogiat. [0025] Vektoris olevad homoloogsed järjestused sisaldavad vähemalt 25 aluspaari; eelistatavad on pikemad, vähemalt 500 aluspaarist ja eelistatavamalt vähemalt 5000 aluspaarist koosnevad järjestused. [0026] Vastavalt leiutise eelistatavamale teostusele on nukleiinhappemolekul ümbritsetud vektoris olevate homoloogsete järjestustega. [0027] Termin ümbitsetud tähendab siin kasutatuna, et üks homoloogsetest järjestustest paikneb leiutisekohase nukleiinhappemolekuli suhtes vastuvoolu ja teine homoloogsetest järjestustest paikneb leiutisekohase nukleiinhappemolekuli suhtes pärivoolu. Siin kasutatuna ei tähenda ümbritsetud tingimata, et kaks homoloogset järjestust on otseselt ühendatud leiutisekohase nukleiinhappemolekuli 3 - või 5 -otsaga; leiutisekohane nukleiinhappemolekul ja homoloogsed järjestused võivad olla eraldatud piiramatu arvu nukleotiididega. [0028] Siin kasutatuna on sihtmärk-dna järjestus piirkond raku genoomis, millele on suunatud vektor homoloogse rekombinatsiooni abil modifitseerimiseks. Sihtmärk-DNA järjestused hõlmavad struktuurigeene (st polüpeptiide kodeerivaid DNA järjestusi, kaasa arvatud eukraüootide puhul intronid ja eksonid), regulatoorseid järjestusi nagu enhaanserjärjestused, promootoreid jne, ning muid huvipakkuvaid genoomipiirkondi. Sihtmärk-DNA järjestus võib olla ka järjestus, millele vektori suunamisel ei ole toimet peremeesgenoomi funktsioneerimisele.
7 [0029] Siin kasutatuna tähendab inserteeritud sihtmärk-dna järjestusse laias mõttes seda, et homoloogse rekombinatsiooni protsess, mis viib leiutisekohase nukleiinhappemolekuli insertsioonile, tekitab sihtmärk-dna järjestuses deletsiooni või katkemise. [0030] Eriala asjatundja on võimeline valima sobiva homoloogse järjestuse, et suunata spetsiifilist DNA järjestust raku genoomi. Näieks võib üks homoloogne järjestus olla homoloogne osaga sihtmärk-dna järjestusest, kuna teine homoloogne järjestus on homoloogne sihtmärkjärjestusest vastuvoolu või pärivoolu paikneva DNA järjestusega. Vastavalt teisele näitele võib üks homoloogsetest järjestustest olla homoloogne sihtmärk-dna järjestusest vastuvoolu paikneva DNA järjestusega, kuna teine homoloogne järjestus on homoloogne sihtmärk-dna järjestusest pärivoolu paikneva DNA järjestusega. Järgmises näites on mõlemad homoloogsed järjestused homoloogsed järjestustega, mis paiknevad sihtmärk-dna järjestuse sees. [0031] Vastavalt leiutise eelistatavale teostusele on sihtmärk-dna järjestuseks HPRT (hüpoksantiini fosforibosüültransferaasi) geen. [0032] Cairina moschata HPRT promootorit ja HPRT geeni sisaldav genoomijärjestus on esitatud järjestusega SEQ ID N o :3. HPRT kodeeriv järjestus algab järjestusega SEQ ID N o :3 esitatud nukleiinhappejärjestuse 8695. asendis ATG koodoniga ning sellest ATG koodonist vastuvoolu jääv järjestus on HPRT promootorjärjestus. [0033] Eriala asjatundja on võimeline valima homoloogseid järjestusi, mis on vajalikud leiutisekohase nukleiinhappe integreerimiseks HPRT geeni. Erinevate lindude kui sama sugukonna liikmete HPRT kodeerivatel genoomsetel järjestustel on kõrge homoloogia; seega on eriala asjatundja võimeline disainima homoloogseid järjestusi, mis on vajalikud teiste lindude rakkude HPRT geenile suunamiseks. [0034] Vastavalt leiutise eelistatavamale teostusele kohandatakse homoloogsed järjestused nii, et leiutisekohane nukleiinhappemolekul inserteeritaks HPRT promootori suhtes pärivoolu. Selles konkreetses teostuses seotakse leiutisekohane nukleiinhappemolekul juhitavalt raku endogeense HPRT romootoriga. Käesoleva leiutise kontekstis on juhitavalt seotud mõeldud tähendama, et nukleiinhappemolekul on seotud promootoriga viisil, mis võimaldab seda rakus ekspresseerida. [0035] Vastavalt sellele konkreetsele teostusele sisaldab leiutisekohane nukleiinhappemolekulist vastuvoolu jääv homoloogne järjestus eelistatavalt nukleiinhappejärjestust, mis on homoloogne vähemalt 500 külgneva aluspaari ulatuses, eelistatavamalt vähemalt 5000 külg-
8 neva aluspaari ulatuses, alates järjestusega SEQ ID N o :3 esitatud nukleiinhappejärjestuse 1. asendis nukleotiidist ja lõpetades 8694. asendis nukleotiidiga eeldusel, et nimetatud homoloogne järjestus ei ole homoloogne nukleiinhappejärjestusega alates järjestusega SEQ ID N o :3 esitatud nukleiinhappejärjestuse 8695. asendis nukleotiidist ja lõpetades 26916. asendis nukleotiidiga. Lisaks on vastuvoolu asetsev homoloogne järjestus eelistatavalt seotud otse leiutisekohase nukleiinhappemolekuli stardikoodoniga. Leiutise veelgi enam eelistatavas teostuses sisaldab leiutisekohasest nukleiinhappemolekulist vastuvoolu jääv homoloogne järjestus nukleiinhappejärjestust alates järjestusega SEQ ID N o :3 esitatud nukleiinhappejärjestuse 1383. asendis nukleotiidist ja lõpetades 8694. asendis nukleotiidiga. Näiteks sisaldab leiutisekohane vektor nukleiinhappejärjestust alates järjestusega SEQ ID N o :4 esitatud nukleiinhappejärjestuse 1. asendis olevast nukleotiidist ja lõpetades 11227. asendis oleva nukleotiidiga. Leiutisekohasest nukleiinhappemolekulist pärivoolu jääv homoloogne järjestus sisaldab eelistatavalt nukleiinhappejärjestust, mis on homoloogne vähemalt 500 külgneva aluspaari ulatuses, eelistatavamalt vähemalt 5000 külgneva aluspaari ulatuses, alates järjestusega SEQ ID N o :3 esitatud nukleiinhappejärjestuse 10581. asendis nukleotiidist ja lõpetades 17800. asendis nukleotiidiga. Eelistatavamalt koosneb leiutise nukleiinhappemolekulist vastuvoolu jääv nimetatud homoloogne järjestus nukleiinhappejärjestusest alates järjestusega SEQ ID N o :3 esitatud nukleiinhappejärjestuse 10581. asendis nukleotiidist ja lõpetades 17800. asendis nukleotiidiga. [0036] Vastavalt eelistatavale teostusele sisaldab leiutisekohane vektor esimest selektsioonimarkerit, kus see esimene selektsioonimarker on positiivse selektsiooni marker ja kus nimetatud esimene selektsioonimarker ja leiutisekohane nukleiinhappemolekul asuvad vektori samas lõigus, kus nimetatud lõik on piiratud homoloogsete järjestustega. [0037] Siin kasutatuna tähendab termin positiivse selektsiooni marker eelkõige sellist produkti kodeerivat geeni, mis võimaldab ainult seda geeni kandvatel rakkudel teatud tingimustes ellu jääda ja/või kasvada. Tüüpilised selektsioonimarkerid kodeerivad valke, mis annavad resistentsuse antibiootikumide või muude toksiinide, näiteks ampitsilliini, neomütsiini, metotreksaadi või tetratsükliini, komplemendi auksotroofse puudulikkuse või nende kriitiliste toitainetega, mis ei ole komplekssöötmest saadavad, varustamise suhtes. Leiutise eelistatavas teostuses kodeerib esimene selektsioonimarker valku, mis annab resistentsuse antibiootikumide suhtes.
9 [0038] Vastavalt leiutise eelistatavamale teostusele on vektoris esimene selektsioonimarker ümbritsetud järjestustega, mis võimaldavad tema supressiooni. Nimetatud järjestused, mis võimaldavad esimese selektsioonimarkeri supressiooni, ei ümbritse leiutisekohast nukleiinhappemolekuli. Kui vektor on rõngakujuline, asuvad esimese selektsioonimarkeri supressiooni võimaldavad järjestused, esimene selektsioonimarker ja leiutisekohane nukleiinhappemolekul samas ülekandevektori lõigus, kus nimetatud lõik on piiratud homoloogsete järjestustega. [0039] Nukleiinhappefragmendi supressiooni võimaldavad järjestused on eriala asjatundjale hästi teada (Nunes-Duby jt, Nucleic Acids Res., 1998, 26, 391-406). Neid järjestusi suudab (suudavad) ära tunda üks või enam spetsiifilist ensüümi, mis indutseerivad nimetatud järjestuste vahel sisalduva nukleiinhappe supressiooni, ning neid ensüüme kutsutakse rekombinaasideks. Näiteks kolm hästi tuntud rekombinaasi, mis võimaldavad nukleiinhappefragmendi supressiooni, on FLP, ISCEI ja Cre rekombinaasid. [0040] Tüüpiline saidispetsiifiline rekombinaas on Cre rekombinaas. Cre on bakteriofaag P1 cre (cyclization recombination, tsükliseerumise ja rekombinatsiooni) geeni 38 kda produkt ja see on Int perekonna saidispetsiifiline DNA rekombinaas (Sternberg, N. jt, J. Mol. Biol., 1986, 187, 197-212). Cre tunneb P1 genoomis ära 34 aluspaarist koosneva saidi, mida kutsutakse loxp-ks (locus of X-over of P1), ja katalüüsib efektiivselt loxp saidipaaride vahelist konservatiivset DNA rekombinatsiooni. loxp sait koosneb kahest 13 aluspaari pikkusest pöördkordusest, mis piiravad külgedelt 8 aluspaari pikkust mittepalindroomset südamikupiirkonda. Kahe otsekorduses loxp saidi vaheline Cre-vahendatud rekombinatsioon annab tulemuseks nendevahelise DNA väljalõikamise kovalentselt suletud rõngana. Ümberpööratud orientatsioonis loxp paaride vaheline Cre-vahendatud rekombinatsioon annab tulemuseks nende vahel oleva DNA ümberpööramise selle väljalõikamise asemel. DNA katkestamine ja ühendamine on piiratud diskreetsete asenditega südamikupiirkonnas ja toimub ahelal DNA ja ensüümvalgu vahelise ajutise fosfotürosiinsideme kaudu. [0041] Teine saidispetsiifiline rekombinaas on I-SceI. I-SceI saab asendada ka mõne teise intronile suunatud endonukleaasi, näiteks I-TliI, I-CeuI, I-CerI, I-PpoI ja PI-PspI. Paljusid neist on loetlenud Belfort ja Roberts (Nucleic Acids Research, 1997, 25, 3379-3388). Paljud neist endonukleaasidest on pärit organellide genoomidest, kus koodonikasutus erineb standardsest tuuma-koodonikasutusest. Selliste geenide kasutamisel nende poolt kodeeritavate endonukleaaside tuumaekspressiooniks võib osutuda vajalikuks kodeeriva järjestuse muut-
10 mine, et neid sobitada tuumageenide koodonikasutusega. I-SceI on kaheahelaline endonukleaas, mis lõikab DNA oma äratundmissaidist. I-SceI tekitab 4 aluspaari pikkuse siksakilise lõike, mille tulemuseks on 3 OH üleulatuvad otsad. [0042] Ensüümi I-SceI äratundmissait on teada. I-SceI äratundmissait on mittesümmeetriline järjestus pikkusega üle 18 aluspaari. 5 TAGGGATAACAGGGTAAT3 3 ATCCCTATTGTCCCATTA5 [0043] Seetõttu sisaldavad leiutise eelistatavas teostuses esimese selektsioonimarkeri supressiooni võimaldavad järjestused I-SceI äratundmissaiti. [0044] Järgmine saidispetsiifiline rekombinaas on Flp rekombinaas. Flp rekombinaas tunneb ära kindla 34 aluspaarist koosneva minimaalse saidi, mis talub oma äratundmisjärjestuses ainult piiratud arvu kõdupositsioone (Jayaram, 1985; Senecoff jt, 1988). Flp rekombinaasi ja FRT järjestuse vahelisi interaktsioone on uuritud (Panigrahi jt, 1992). Jayaram (1985) ja Senecoff jt (1988) on andnud erinevate FRT järjestuste näiteid ning Snaith jt (1996) on kirjeldanud Flp-vahendatud rekombinatsiooni teste erinevatel substraatidel. [0045] Konkreetses teostuses, kus leiutisekohane vektor sisaldab järjestust, mis võimaldab esimese selektsioonimarkeri supressiooni, võib nimetatud vektor eelistatavalt sisaldada esimest homoloogiajärjestust A ja teist homoloogiajärjestust B, kus homoloogiajärjestused A ja B on piisava pikkuse ja piisava homoloogiaga, mis võimaldab nendevahelist homoloogset rekombinatsiooni. Homoloogiajärjestuste A ja B suhtes tähendab piisav homoloogia eelistatavalt järjestusi, mille homoloogia on vähemalt 70%, eelistatavalt vähemalt 80%, eelistatavamalt vähemalt 90%, eriti eelistatavalt vähemalt 95%, väga eelistatavalt vähemalt 99% ja kõige eelistatavamalt 100% nendes homoloogiajärjestustes pikkusega üle vähemalt 20 aluspaari, eelistatavalt vähemalt 50 aluspaari, eriti eelistatavalt vähemalt 100 aluspaari, väga eelistatavalt vähemalt 250 aluspaari ja kõige eelistatavamalt vähemalt 500 aluspaari. Selles teostuses sisaldab leiutisekohane vektor leiutisekohasele nukleiinhappemolekulile 5-3 - orientatsioonis järgnevana esimest homoloogiajärjestust A, esimese selektsioonimarkeri supressiooni võimaldavat järjestust, esimest selektsioonimarkerit, esimese selektsioonimarkeri supressiooni võimaldavat järjestust ja homoloogiajärjestust B.
11 [0046] Vastavalt eelistatavale teostusele sisaldab leiutisekohane vektor teist selektsioonimarkerit, mis ei ole ümbritsetud nimetatud homoloogsete järjestustega, kus nimetatud teine selektsioonimarker on negatiivse selektsiooni marker. Nimetatud teine selektsioonimarker on eriti kasulik juhul, kui leiutisekohane vektor on rõngakujuline. Kui vektor on rõngakujuline, siis tähendab fakt, et teine selektsioonimarker ei ole ümbritsetud nimetatud homoloogsete järjestustega, et teine selektsioonimarker ja leiutisekohane nukleiinhappemolekul ei asu samas ülekandevektori lõigus, kusjuures nimetatud lõik on piiratud homoloogsete järjestustega. [0047] Vastavalt leiutise eelistatavale teostusele sisaldab leiutisekohane vektor kolmandat selektsioonimarkerit, kus nimetatud kolmas selektsioonimarker on negatiivse selektsiooni marker, ning nimetatud kolmas selektsioonimarker paikneb nende järjestuste vahel, mis võimaldavad esimese selektsioonimarkeri supressiooni. Kui vektor on rõngakujuline, siis tähendab fakt, et kolmas selektsioonimarker paikneb nende järjestuste vahel, mis võimaldavad esimese selektsioonimarkeri supressiooni, et kolmas selektsioonimarker ja esimene selektsioonimarker paiknevad samas ülekandevektori lõigus, kusjuures nimetatud lõik on piiratud järjestustega, mis võimaldavad esimese supressioonimarkeri supressiooni. [0048] Siin kasutatuna tähendab termin negatiivse selektsiooni marker eelkõige geeni, mis kodeerib produkti, mis teatud tingimustes tapab need rakud, mis seda geeni kannavad. Need geenid hõlmavad eelkõige suitsiidigeene. Nende geenide poolt kodeeritavad produktid on võimelised muutma eelravimi tsütotoksiliseks ühendiks. Praegu on saadaval palju suitsiidgeeni/eelravimi paare. Konkreetsemalt võib mainida järgmisi paare: - lihtherpesviiruse I tüüpi tümidiinkinaas (HSV-1 TK) ja atsükloviir või gantsikloviir (GCV) (Caruso jt, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 7024-7028; Culver jt, Science, 1992, 256, 1550-1552; Ram jt, Nat. Med., 1997, 3, 1354-1361); - tsütokroom p450 ja tsüklofosfoamiid (Wei jt, Human Gene Therapy, 1994, 5, 969-978); - Escherichia coli (E. coli) puriinnukleosiidfosforülaas ja 6-metüülpuriindesoksüribonukleosiid (Sorscher jt, Gene Therapy, 1994, 1, 223-238); - E. coli guaniinfosforibosüültransferaas ja 6-tioksantiin (Mzoz ja Moolten, Human Gene Therapy, 1993, 4, 589-595) ja - tsütosiindeaminaas (CDaas) ja 5-fluorotsütosiin (5FC),
12 - FCU1 ja 5-fluorotsütosiin (5FC) (WO 99/54481), - FCU1-8 ja 5-fluorotsütosiin (5FC) (WO 2005/007857). [0049] Esimest, teist ja kolmandat selektsioonimarkerit saab kasutada eraldi. Näiteks võib leiutisekohane vektor sisaldada esimest ja kolmandat selektsioonimarkerit, aga mitte teist selektsioonimarkerit, või siis teist ja kolmandat selektsioonimarkerit, aga mitte esimest selektsioonimarkerit. [0050] Vastavalt leiutise eelistatavale teostusele paigutatakse esimene, teine ja/või kolmas selektsioonimarker nende elementide kontrolli alla, mis on vajalikud nende ekspressiooniks peremeesrakkudes. [0051] Ekspressiooniks vajalike elementide hulka kuulub rida elemente, mis võimaldavad nukleotiidjärjestuse transkriptsiooni RNA-ks ja mrna translatsiooni polüpeptiidiks, eelkõige promootorjärjestused ja/või regulatoorsed järjestused, mis on nimetatud rakkudes efektiivsed, ja valikuliselt järjestused, mis on vajalikud, et võimaldada nimetatud polüpeptiidi sekretsiooni või ekspressiooni peremeesrakkude pinnal. Need elemendid võivad olla reguleeritavad või konstitutiivsed. Mõistagi kohandatakse promootor valitud vektorile ja peremeesrakule. Näitena võib märkida geenide PGK (fosfoglütseraatkinaas), MT (metallotioneiin; McIvor jt, Mol. Cell Biol., 1987, 7, 838-848), α-1-antitrüpsiin ja CFTR eukarüootseid promootoreid, lihase kreatiinkinaasi, aktiini pulmonaalse pindaktiivse aine, immunoglobuliini või β-aktiini (Tabin jt, Mol. Cell Biol., 1982, 2, 416-436) promootoreid, Srα promootorit (Takebe jt, Mol. Cell, 1988, 8, 466-472), SV40-viiruse (Simian Virus, ahviviirus) varast promootorit, RSV (Rousi sarkoomiviiruse) LTR, MPSV promootorit, TK-HSV-1 promootorit, CM-viiruse (tsütomegaloviiruse) varast promootorit, vaktsiiniaviiruse promootoreid p7.5k, ph5r, pk1l, p28, p11 ja adenoviiruse promootoreid E1A ja MLP või nimetatud promootorite kombinatsioone. Kõige enam eelistatav on tsütomegaloviiruse (CMV) varane promootor. [0052] Käesolev leiutis käsitleb ka linnurakku, mida on transfekteeritud leiutisekohase nukleiinhappemolekuli või vektoriga, ning sellest pärinevaid linnurakke. Siin kasutatuna tähendab termin pärinevad rakke, mis arenevad või diferentseeruvad rakust, mida on transfekteeritud leiutisekohase nukleiinhappemolekuliga või millel on sellega ühine eellane. Eelistatavalt on nimetatud nukleiinhappemolekul inserteeritud nimetatud primaarraku HPRT geeni.
13 [0053] Käesolev leiutis käsitleb ka leiutisekohaste polüpeptiidide, nukleiinhappemolekulide ja vektorite kasutamist linnuraku immortaliseerimiseks. [0054] Samuti kirjeldatakse linnurakku, mis sisaldab leiutisekohast nukleiinhappemolekuli, kus nimetatud nukleiinhappemolekul on juhitavalt seotud linnuraku endogeense HPRT promootoriga. Juhitavalt seotud on mõeldud tähendama, et nukeliinhappemolekul on seotud promootoriga sellisel viisil, mis võimaldab tema ekspressiooni rakus. Eelistatavas teostuses sisaldab leiutisekohane linnurakk järjestusega SEQ ID N o :4 esitatud nukleiinhappejärjestust. [0055] Käesolev leiutis käsitleb ka linnuraku immortaliseerimismeetodit, mis hõlmab leiutisekohase vektori nimetatud linnurakku transfekteerimise etappi. [0056] Immortaliseeritud rakk tähendab siin kasutatuna rakku, mis on võimeline kasvama söötmes enam kui 35 ümberkülvi vältel. [0057] Termin ümberkülvide arv tähendab seda arvu, mitu korda on rakupopulatsiooni kasvatamisnõust eemaldatud ja sellega alamkultuuri (ümberkülvi) protsessi teostatud selleks, et säilitada rakkudel piisavalt madal tihedus ja stimuleerida nende edasist kasvu. [0058] Siin kasutatuna tähendab termin transfekteeritud leiutisekohase linnuraku püsivat transfektsiooni või ajutist transfektsiooni. [0059] Terminid püsiv transfektsioon või püsivalt transfekteeritud tähendavad võõr- DNA sisestamist transfekteeritava raku genoomi ja sellesse integreerimist. Termin püsiv transfektant tähendab rakku, mille genoomsesse DNA-sse on püsivalt integreeritud võõr- DNA. [0060] Terminid ajutine transfektsioon või ajutiselt transfekteeritud tähendavad võõr- DNA sisestamist rakku, milles võõr-dna ei suuda transfekteeritava raku genoomi integreeruda. Võõr-DNA püsib transfekteeritud raku tuumas mõne päeva. Termin ajutine transfektant tähendab rakke, mis on võõr-dna küll vastu võtnud, kuid ei suuda seda DNA-d integreerida. [0061] Vastavalt leiutise eelistatavale teostusele pärineb leiutisekohane linnurakk partlaste (Anatidae) sugukonnast või faasanlaste (Phasianidae) sugukonnast. Partlaste (Anatidae) hulgas on eriti eelistatavad rakud, mis kuuluvad partide (Cairina) või metspartide (Anas) perekonda. Veelgi eelistatavamalt kuuluvad leiutisekohased rakud muskuspardi (Cairina moschata) või sinikaelpardi (Anas platyrhynchos) liikidesse. [0062] Eelistatavalt pärineb leiutisekohane linnurakk embrüonaalsest organismist. Elusorganismist rakkude eraldamist võimaldavad meetodid on eriala asjatundjale hästi teada. Näiteks
14 saab kasutada näites 2 avaldatud meetodeid. Vastavalt leiutise eelistatavale teostusele eraldatakse primaarsed linnurakud partlaste sugukonda kuuluvast 0 kuni 20 päeva vanusest, eelistatavalt 5 kuni 15 päeva vanusest ja kõige eelistatavamalt 11 kuni 14 päeva vanusest embrüost. [0063] Leiutisekohases protsessis kasutatud vektor võib sisaldada esimest selektsioonimarkerit. Esimese selektsioonimarkeri integreerumine võimaldab selekteerida rakud, millesse on sisestunud leiutisekohane nukleiinhappemolekul. Seega võib leiutisekohane meetod hõlmata täiendavat etappi, kus nimetatud linnurakke kasvatatakse söötmes, mis võimaldab kasvada ainult nendel rakkudel, millesse on sisestunud esimene selektsioonimarker, näiteks söötmes, mis sisaldab antibiootikumi. [0064] Kui leiutisekohases meetodis kasutatav vektor sisaldab järjestusi, mis võimaldavad esimese selektsioonimarkeri supressiooni, võib leiutisekohane meetod hõlmata täiendavat etappi, mis seisneb esimese selektsioonimarkeri supresseerimises nimetatud primaarse linnuraku genoomis. Nimetatud esimese selektsioonimarkeri supresseerimiseks transfekteeritakse linnurakku geeniga, mis kodeerib rekombinaasi, mis on spetsiifiline esimese selektsioonimarkeri supressiooni võimaldavate järjestuste suhtes. Nimetatud geeni rakkudesse transfekteerimist võimaldavad meetodid ja vektorid on eriala asjatundjale hästi teada, näiteks meetod, mis on avaldatud käesoleva taotluse näites 4. [0065] Kui leiutisekohases meetodis kasutatud vektor sisaldab teist selektsioonimarkerit, võib leiutisekohane meetod hõlmata täiendavat etappi, kus linnurakke kasvatatakse söötmes, mis võimaldab kasvada ainult nendel rakkudel, millesse ei ole sisestunud teine selektsioonimarker. Nimetatud etapi võib teostada samaegselt etapiga, kus nimetatud linnurakke kasvatatakse söötmes, mis võimaldab kasvada ainult nendel rakkudel, millesse on sisestunud esimene selektsioonimarker, või sellest etapist eraldi. [0066] Nimetatud teine selektsioonimarker on eriti kasulik juhul, kui leiutisekohases meetodis kasutatav vektor on rõngakujuline. Nimetatud teise selektsioonimarkeri olemasolu võimaldab nende linnurakkude hävitamist, milles homoloogse rekombinatsiooni protsess on viinud ülekandevektori selle lõigu sisestamisele, mis ei sisalda leiutisekohast nukleiinhappemolekuli. [0067] Kui leiutisekohases meetodis kasutatav vektor sisaldab kolmandat selektsioonimarkerit, võib leiutisekohane meetod hõlmata täiendavat etappi, kus nimetatud linnurakku kasvatatakse söötmes, mis ei võimalda kolmandat selektsioonimarkerit sisaldavate rakkude kasva-
15 mist. Näiteks sisaldab sööde, mis ei võimalda kolmanda selektsioonimarkerina kasutavat FCU1 sisaldavate rakkude kasvamist, 5-fluorotsütosiini. [0068] See etapp võimaldab nende linnurakkude selekteerimist, milles on toimunud esimese selektsioonimarkeri supressioon. See tähendab, et esimest selektsioonimarkerit sisaldav etapp viib ka kolmanda selektsioonimarkeri supressioonile. Kolmanda selektsioonimarkeri olemasolu võimaldab nende linnurakkude hävitamist, milles esineb esimene selektsioonimarker. [0069] Täpsemalt käsitleb käesolev leiutis, kuid ei ole sellega piiratud, linnuraku immortaliseerimise meetodit, mis hõlmab järgmisi etappe: linnurakku sellise vektori ülekandmine, mis sisaldab: - leiutisekohast nukleiinhappemolekuli, mis on ümbritsetud homoloogsete järjestustega; - esimest selektsioonimarkerit, kus nimetatud esimene selektsioonimarker on positiivse selektsiooni marker ja kus nimetatud esimene selektsioonimarker on ümbritsetud nimetatud homoloogsete järjestustega; - järjestusi, mis võimaldavad esimese selektsioonimarkeri supressiooni; - teist selektsioonimarkerit, mis ei ole ümbritsetud nimetatud homoloogsete järjestustega, kus nimetatud selektsioonimarker on negatiivse selektsiooni marker; - kolmandat selektsioonimarkerit, kus nimetatud kolmas selektsioonimarker on negatiivse selektsiooni marker ja kus nimetatud kolmas selektsioonimarker paikneb nende järjestuste vahel, mis võimaldavad esimese selektsioonimarkeri supressiooni; nimetatud linnurakkude kasvatamine söötmes, mis võimaldab ainult nende rakkude kasvamist, millesse on sisestunud esimene selektsioonimarker; nimetatud linnurakkude kasvatamine söötmes, mis ei võimalda nende rakkude kasvamist, millesse on sisestunud teine selektioonimarker; esimese selektsioonimarkeri eemaldamine nimetatud linnuraku genoomist; nimetatud linnuraku kasvatamine söötmes, mis ei võimalda kolmandat selektsioonimarkerit sisaldavate rakkude kasvamist. [0070] Eriti eelistatavas teostuses käsitleb leiutis immortaliseeritud linnurakku, mis pärineb loomarakust, mis kuulub muskuspardi (Cairina moschata) liigile ja mis sisaldab muskuspardi
16 PPRT promootori kontrolli all olevat muskuspardi telomeraasi pöördtranskriptaasi, mis on inserteeritud raku HPRT geeni. [0071] Leiutisekohane linnurakk võib täiendavalt sisaldada ühte või enamat nukleiinhappejärjestust, mis võimaldab (võimaldavad) defektse viiruse paljunemist. Defektne viirus tähendab viirust, millest üks või enam tema replikatsiooniks vajalikku viirusgeeni on eemaldatud või muudetud mittefunktsionaalseks. Termin nukleiinhappejärjestus, mis võimaldab defektse viiruse paljunemist tähendab nukleiinhappejärjestust, mis in trans asendab seda funktsiooni (neid funktsioone), mis võimaldab (võimaldavad) defektse viiruse paljunemist. Teiste sõnadega, nimetatud nukleiinhappejärjestus(ed) kodeerib (kodeerivad) valku (valke), mis on vajalik(ud) nimetatud defektse viiruse replikatsiooniks ja kapsiidiga katmiseks. Illustreeriva näitena võib sellise adenoviirusvektori tootmiseks, milles puudub suurem osa E1 piirkonnast, transfekteerida leiutisekohaseid linnurakke kas ajutiselt või püsivalt E1 piirkonda sisaldava nukleiinhappejärjestusega. [0072] Leiutisekohane linnurakk võib sisaldada ka huvialust ainet kodeerivat nukleiinhappejärjestust. Sel juhul saab nimetatud leiutisekohast linnurakku kasutada nimetatud huvialuse aine tootmiseks. Siin kasutatuna võivad huvialuste ainete hulka kuuluda, kuid ei ole nendega piiratud: farmatseutiliselt aktiivsed valgud, näiteks kasvufaktorid, kasvuregulaatorid, antikehad, antigeenid, nende derivaadid, mis on kasulikud immuniseerimiseks või vaktsineerimiseks jne, interleukiinid, insuliin, G-CSF, CM-CSF, hpg-csf, M-CSF või nende kombinatsioonid, interferoonid, näiteks interferoon-α, interferoon-β, interferoon-γ, verehüübimisfaktorid, näiteks faktor VIII, faktor IX või tpa või nende kombinatsioonid. Huvialune aine tähendab ka tööstuslikke ensüüme kasutamiseks näiteks puidu- ja paberitööstuses, tekstiilimuundamises või etanoolitootmises. Lõpuks tähendab huvialune aine ka valgulisandeid või loomasööda väärtust tõstvaid tooteid. [0073] Leiutisekohase protsessi abil saadud linnurakud, leiutisekohased linnurakud ja nendest pärinevad linnurakud on eriti kasulikud elusa, nõrgestatud või rekombinantse viiruse replitseerimiseks. Eelistatavamalt on nimetatud rakud eriti kasulikud poksviiruse (vaktsiiniaviirused, eelkõige MVA, canarypox-viirus jne.), adenoviiruse, retroviiruse, herpesviiruse, alfaviiruse, vahutava viiruse või adenoviirusega assotsieerunud viiruste replitseerimiseks. [0074] Retroviiruste omadus on nakatada jagunevaid rakke ja enamikul juhtudel ka nendesse integreeruda ning selles suhtes on nad eriti sobivad kasutamiseks seoses vähiga. Üldiselt sisaldab leiutisekohane rekombinantne retroviirus LTR järjestusi, kapsiidimoodustamise piir-
17 konda ja leiutisekohast nukleotiidjärjestust, mis paigutatakse retroviiruse LTR või sisemise promootori, nagu sellise promootori, mida on allpool kirjeldatud, kontrolli alla. Retroviirusvektor võib sisaldada modifikatsioone, eelkõige LTR-des (promootorpiirkonna asendamine eukarüootse promootoriga) või kapsiidimoodustamise piirkonnas (asendamine heteroloogse kapsiidimoodustamise piirkonna, näiteks VL30 tüüpi piirkonnaga) (vt Prantsuse patenditaotlusi 94 08300 ja 97 05203). [0075] Adenoviirusvektoris võivad puududa kas kõik või osa vähemalt ühest piirkonnast, mis on replikatsiooniks oluline ning mis valitakse E1, E2, E4 ja L1-L5 piirkondade hulgast. Eelistatav on E1 piirkonna eemaldamine. Seda võib aga kombineerida teis(t)e modifikatsiooni(de)/eemaldamis(t)ega, mis kahjustab (kahjustavad) eelkõige kas tervet E2, E4 ja/või L1-L5 piirkonda või osa sellest. Illustreeriva näitena on eriti soodus suurema osa eemaldamine E1 piirkonnast ja E4 transkriptsiooniühikust. Adenoviirusvektori kloonimismahtuvuse suurendamiseks võib adenoviirusvektoris lisaks puududa kas kogu mitteoluline E3 piirkond või osa sellest. Teise alternatiivi kohaselt on võimalik kasutada minimaalset adenoviirusvektorit, milles on alles kapsiidi moodustamiseks vajalikud järjestused, nimelt 5 - ja 3 -ITRd (Inverted Terminal Repeat, pöördkordused) ja kapsiidimoodustamise piirkond. Erinevad adenoviirusvektorid ja nende valmistamismeetodid on hästi teada (vt näiteks Graham ja Prevect, Methods in Molecular Biology, 1991, 7, 109-128; toim E. J. Murey, The Human Press Inc). [0076] Poksviiruse sugukond hõlmab viirusi alamsugukondadest Chordopoxvirus ja Entomopoxvirus. Nende hulgas on leiutisekohane poksviirus eelistatavalt valitud rühmast, kuhu kuuluvad Orthopox-viirused, Parapox-viirused, Avipox-viirused, Capripox-viirused, Leporipox-viirused, Suipox-iviirused, Molluscipox-viirused, Yatapox-viirused. Eelistatavamas teostuses on leiutisekohane poksviirus Orthopox-viirus. [0077] Orthopox-viirus on eelistatavalt vaktsiiniaviirus ja eelistatavamalt modifitseeritud vaktsiiniaviirus Ankara (MVA), eriti MVA 575 (ECACC V00120707) ja MVA-BN (ECACC V00083008). [0078] Termin rekombinantne viirus viitab siin viirusele, mis sisaldab oma genoomi inserteeritud eksogeenset järjestust. Siin kasutatuna tähendab eksogeenne viirus nukleiinhapet, mis ei esine looduslikult algses viiruses. [0079] Ühes teostuses kodeerib eksogeenne viirus molekuli, millel on otsene või kaudne tsütotoksiline funktsioon. Terminiga otsene või kaudne tsütotoksilisus mõeldakse, et eksogeense järjestuse poolt kodeeritav molekul võib ise olla toksiline (näiteks ritsiin, tuumori
18 nekroosifaktor, interleukiin-2, interferoon-gamma, ribonukleaas, desoksüribonukleaas, pseudomonase eksotoksiin A) või see võib metaboliseeruda, moodustades toksilise produkti, või võib see toimida millelegi muule, moodustades toksilise produkti. Ritsiini cdna järjestuse on avaldanud Lamb jt (Eur. J. Biochem., 1985, 148, 265-270). [0080] Leiutise eelistatavas teostuses on eksogeenseks järjestuseks suitsiidigeeni järjestus. Suitsiidigeen kodeerib valku, mis on võimeline konverteerima suhteliselt mittetoksilise eelravimi toksiliseks ravimiks. Näiteks konverteerib ensüüm tsütosiindeaminaas 5-fluorotsütosiini (5FC) 5-fluorouratsüüliks (5FU) (Mullen jt PNAS, 1922, 89, 33); lihtherpesviiruse tümidiinkinaas sensibiliseerib rakud raviks viirusevastaste vahenditega gantsikloviir (GCV) või atsikloviir (Moolten, Cancer Res., 1986, 46, 5276; Ezzedine jt, New Biol., 1991, 3, 608). Võib kasutada ükskõik missuguse organismi, näiteks E. coli või Saccharomyces cerevisiae, tsütosiindeaminaasi. [0081] Seega, leiutise eelistatavas teostuses kodeerib geen valku, millel on tsütosiindeaminaasi aktiivsus, ning veelgi eelistatavamalt valku, mida on kirjeldatud patenditaotlustes WO 2005/007857 ja WO 99/54481. [0082] Järgmises teostuses kodeerib eksogeenne geen ribosüümi, mis on võimeline lõikama sihtmärk-rna-d või -DNA-d. Lõigatav sihtmärk-rna või -DNA võib olla RNA või DNA, mis on oluline raku funktsioneerimiseks ja selle lõikamise tulemuseks on rakusurm, või lõigatav RNA või DNA võib olla RNA või DNA, mis kodeerib ebasoovitavat valku, näiteks onkogeeni produkti, ja selle RNA või DNA lõikamine võib takistada rakku muutumast vähirakuks. [0083] Järgmises teostuses kodeerib eksogeenne geen antisense RNA-d. [0084] Antisense RNA all mõtleme me RNA molekuli, mis hübridiseerub valku kodeeriva mrna molekuli või mõne teise rakus oleva RNA molekuliga, nagu pre-mrna või trna või mrna, ja sekkub selle ekspressiooni, või hübridiseerub geenijärjestusega ja sekkub selle ekspressiooni. [0085] Leiutise järgmises teostuses asendab eksogeenne järjestus defektse geeni funktsiooni sihtmärkrakus. Imetajatel, kaasa arvatud inimesel, on mitu tuhat pärilikku geneetilist haigust, mis on põhjustatud defektsete geenide poolt. Selliste geneetiliste haiguste näidete hulka kuuluvad tsüstiline fibroos, mille puhul on teada mutatsioonid CFTR geenis; Duchenne i lihasdüstroofia, mille puhul on teada mutatsioonid düstrofiini geenis; sirprakkude haigus, mille
19 puhul on teada mutatsioonid HbA geenis. Paljud vähitüübid on põhjustatud defektsete geenide poolt, eriti protoonkogeenide ja muteerunud kasvaja-supressorgeenide poolt. [0086] Protoonkogeenide näited on ras, src, bcl jne, kasvaja-supressorgeenid on p53 ja Rb. [0087] Leiutise järgmises teostuses kodeerib eksogeenne järjestus kasvajaga seonduvat antigeeni (Tumor Associated Antigen, TAA). TAA tähendab molekuli, mida kasvajarakkudes detekteeritakse suurema sageduse või tihedusega kui sama koetüübi mittekasvajarakkudes. TAA näidete hulka kuuluvad, kui ei ole nendega piiratud, CEA, MART-1, MAGE-1, MAGE-3, GP-100, MUC-1, MUC-2, punktmutatsioone kandev ras-onkogeen, normaalne või punktmutatsioone kandev p53, üleekspresseeritud p53, CA-125, PSA, C-erb/B2, BRCA I, BRCA II, PSMA, türosinaas, TRP-1, TRP-2, NY-ESO-1, TAG72, KSA, HER-2/neu, bcr-abl, pax3-fkhr, ews-fli-1, surviviin ja LRP. Eelistatavama teostuse kohaselt on TAA MUC1. [0088] Rekombinantne viirus võib sisaldada enam kui ühte eksogeenset järjestust ja iga eksogeenne järjestus võib kodeerida enam kui ühte molekuli. Näiteks võib olla kasulik siduda samas rekombinantses poksviiruses TAA-d kodeeriv eksogeenne järjestus tsütokiini kodeeriva eksogeense järjestusega. [0089] Leiutise järgmises teostuses kodeerib eksogeenne järjestus antigeeni. Siin kasutatuna tähendab antigeen ligandi, mis saab seonduda antikehaga; antigeen ise ei pea olema immunogeenne. [0090] Eelistatavalt pärineb antigeen viirusest, nagu näiteks HIV-1 (nagu gp 120 või gp 160) või ükskõik millisest klassi immuupuudulikkuse viirusest, inimese või looma herpesviirusest, nagu gd või selle derivaadid, või varasest valgust (Immediate Early protein), nagu ICP27 HSV1 või HSV2, või pärineb tsütomegaloviirusest (nagu gb või selle derivaadid), Varicella Zoster viirusest (nagu gpi, II või III) või hepatiidiviirusest, nagu B-hepatiidiviirus, näiteks B-hepatiidi pinnaantigeen või selle derivaat, A-hepatiidiviirus, C-hepatiidiviirus (eelistatavalt mitte-struktuurivalk genotüübi 1b tüvest ja) ja E-hepatiidiviirus, või teistest viiruspatogeenidest, nagu respiratoor-süntsütiaalne viirus, inimese papilloomiviirus (eelistatavalt E6 ja E7 valgud HPV16 tüvest) või gripiviirus, või pärineb see bakteriaalsest patogeenist, nagu salmonella, neisseria, borrelia (näiteks OspA või OspB või nende derivaadid) või klamüüdia või bordetella, näiteks P.69, PT ja FHA, või pärineb parasiidist, nagu plasmoodium või toksoplasma. Joonis 1. Vektor, mis sisaldab telomeraasi pöördtranskriptaasi kodeerivat geeni
20 Joonis 2. Telomeraasi pöördtranskriptaasi kodeeriva geeni HPRT geeni saidispetsiifilise inserteerumise skemaatiline esitus Joonis 3. Leiutisekohase protsessi abil saadud immortaliseeritud raku genoomist esimese ja kolmanda selektsioonimarkeri eemaldamise skemaatiline esitus Näited Näide 1. Telomeraasi ekspressioonisüsteem Juhuslik insertsioon [0091] Selleks on kasutatud plasmiidi, mille puudub spetsiifiline järjestuste homoloogia pardi genoomiga (joonis 1). Suunatud insertsioon [0092] On konstrueeritud plasmiid, mis sisaldab kahte 5 kiloaluspaari pikkust fragmenti, mis on homoloogsed Cairina moschata HPRT geeniga ja mis ümbritsevad Cairina moschata telomeraasi pöördtranskriptaasi geeni ja kahte selektsioonimarkerit. Cairina moschata telomeraasi konstitutiivse ekspressiooni adekvaatseks saidiks on valitud HPRT geen, mis kodeerib hüpoksantiini-guaniini fosforibosüültransferaasi. [0093] Need kaks selektsioonimarkerit on FCU1 geen (Erbs jt, Cancer Res., 2000, 60 (14), 3813-3822), mis on CMV promootori kontrolli all (Thomsen jt, PNAS, 1984, 81 (3), 659-663), ja neomütsiiniresistentsuse geen, mis on paigutatud SV40 promootori kontrolli alla. Neomütsiiniresistentsuse ja FCU1 ekspressiooni kassetti ümbritsevad Sce1 lõikamissaidid, mis võimaldavad selektsioonikassetide eemaldamist lõplikust rakuliinist. HPRT geeni õlgadest väljapoole on inserteeritud RSV promootori abil käivitatav HSVTK kodeeriv selektsioonimarker (joonis 2). Näide 2. CEC partii valmistamine 12 päeva vanustest muskuspardi munadest ja alampopulatsioonide kirjeldus [0094] 25 viljastatud SPF muna inkubeeritakse 37,5 o C juures. Munad avatakse pärast 12-päevast inkubatsiooni, järgides kättesaadavat juhendit.