PowerPoint Presentation

Väljavõte

1 Pitt-Hopkinsi sündroomi modelleerimine Drosophila melanogaster is Laura Tamberg Juhendajad: Mari Palgi, PhD ja Tõnis Timmusk, PhD

2 Drosophila melanogaster Üks esimesi mudelorganisme Thomas Hunt Morgan Kõige laialdasemalt kasutatav eukarüootne mudelorganism

3 Drosophila eelised Odav ja lihtne kasvatada Paljuneb kiiresti (10 päeva toatemp) Morfoloogiat lihtne uurida (CO 2 ) Kogu genoom sekveneeritud a Hea geneetiline mudel Stokikeskused ja Drosophila-ala inimeste koostöö

4 Drosophila elutsükkel

5 Geneetilised meetodid Muqit ja Feany, 2002

6 Pitt-Hopkinsi sündroom PTHS on haruldane häire, mida iseloomustab tõsine vaimne alaareng, autistlik käitumine, näo moonutus, epilepsia, kõhukinnisus ja hingamishäired Hetkel ravi puudub PTHS on põhjustatud heterosügootsetest mutatsioonidest Transcription Factor 4 (TCF4) geenis

7 TCF4 ja äädikakärbse Daughterless Klass I aluselised heeliks-ling-heeliks (bhlh) valgud ehk E-valgud E-valgud homodimeriseeruvad või heterodimeriseeruvad klass II bhlh valkudega ning seonduvad Ephrussi motiivile (E-motiiv) DNA-l (CANNTG) ja reguleerivad transkriptsiooni

8 Töö eesmärgid Da ja TCF4 homoloogia kinnitamine Drosophila liinide genereerimine, mis ekspresseerivad Da PTHS GAL4 kontrolli all (upstream activating sequence UAS) Da PTHS üleekspressiooni mõju analüüsimine Drosophila arengus da null embrüonaalse neuronaalse fenotüübi päästmine ekspresseerides Da PTHS

9 Tulemused

10 E-valkude aluseline heeliks-lingheeliks domeen on kõrgelt konserveerunud Da ja inimese E-valgud on umbes 35% identsed, suurim homoloogia on TCF4 ja Da vahel 35,54% Da ja inimese E-valkude bhlh domeenid on 75% identsed

11 Pitt-Hopkinsi sündroomiga seostatud mutatsioonid ja Daughterlessi genereeritud mutatsioonid Mutatsioonid Da-s: - R578H - R580W - R582P - A614V - D515G - R580L Sepp et al., 2012

12 Muteeritud Daughterlessi valkudel on erinevad transaktivatsiooni võimed HEK293 n=3

13 da G32 GAL4 ekspressioon on embrüos üldine ja da-intron-gal4 ekspressioon närvisüsteemispetsiifiline

14 Daughterlessi üleekspressioon kasutades da-intron-gal4 on mitteletaalne Kareda ja osaliselt värvusetu silma põhjustas Da R580W, Da R580L ja Da R582P üleekspressioon

15 Muteeritud Daughterlessi üleekspressioon da G32 -GAL4-ga on letaalne Arengu kestvus - metsiktüüpi Da ja Da D515G - embrüod - Da R580W, Da R580L ja Da R582P esimese astme vaglad - Da R578H ja Da A614V teise astme vaglad

16 da 10 null mutandi embrüonaalse neuronaalse fenotüübi päästmine ja da 1 embrüonaalne neuronaalne fenotüüp

17 Kokkuvõte Mutatsioon in vitro transkriptsiooni aktiveerimi -ne Silmafenotüüp üleekspressioon il da-intron- GAL4-ga Letaalsus üleekspressioonil da G32 -GAL4-ga Letaalsus da null taustas da G32 -GAL4-ga ekspresseerides Embrüonaalse närvisüsteemi fenotüübi päästmine da G32 - GAL4-ga Metsiktüüpi jah ei embrüod embrüod päästab D515G jah ei embrüod embrüod päästab R578H ei ei teise astme vaglad mõned esimese astme R580W ei jah esimese astme vaglad R580L ei jah esimese astme vaglad R582P ei jah esimese astme vaglad vaglad embrüod embrüod embrüod A614V vähenenud ei teise astme vaglad esimese ja teise astme vaglad päästab ei päästa ei päästa ei päästa päästab

18 Järeldused Da on kõigi inimese E-valkude homoloog Minu uuritud mutatsioonid põhjustavad hüpomorfseid kuni dominant-negatiivseid efekte Samad mutatsioonid TCF4-s põhjustavad samu efekte (Sepp et al., 2012) Seega on Drosophila Da sobilik PTHS modelleerimiseks Võimalikud PTHS mudelid - da-intron-gal4 kontrolli all muteeritud Da üleekspresseerivad liinid - muteeritud Da ekspresseerimine hüpomorfses da 1 taustas

19 Tänuavaldused Juhendajad Mari Palgi ja Tõnis Timmusk Jürgen Tuvikene, Mari Sepp, Hanna Vihma ja kõik teised neurobioloogia grupist

20 Tänan tähelepanu eest!