Pitt-Hopkinsi sündroomi modelleerimine Drosophila melanogaster is Laura Tamberg Juhendajad: Mari Palgi, PhD ja Tõnis Timmusk, PhD 27.10.2014
Drosophila melanogaster Üks esimesi mudelorganisme Thomas Hunt Morgan - 1910. Kõige laialdasemalt kasutatav eukarüootne mudelorganism
Drosophila eelised Odav ja lihtne kasvatada Paljuneb kiiresti (10 päeva toatemp) Morfoloogiat lihtne uurida (CO 2 ) Kogu genoom sekveneeritud 2000. a Hea geneetiline mudel Stokikeskused ja Drosophila-ala inimeste koostöö
Drosophila elutsükkel www.flickr.com
Geneetilised meetodid Muqit ja Feany, 2002
Pitt-Hopkinsi sündroom PTHS on haruldane häire, mida iseloomustab tõsine vaimne alaareng, autistlik käitumine, näo moonutus, epilepsia, kõhukinnisus ja hingamishäired Hetkel ravi puudub PTHS on põhjustatud heterosügootsetest mutatsioonidest Transcription Factor 4 (TCF4) geenis
TCF4 ja äädikakärbse Daughterless Klass I aluselised heeliks-ling-heeliks (bhlh) valgud ehk E-valgud E-valgud homodimeriseeruvad või heterodimeriseeruvad klass II bhlh valkudega ning seonduvad Ephrussi motiivile (E-motiiv) DNA-l (CANNTG) ja reguleerivad transkriptsiooni
Töö eesmärgid Da ja TCF4 homoloogia kinnitamine Drosophila liinide genereerimine, mis ekspresseerivad Da PTHS GAL4 kontrolli all (upstream activating sequence UAS) Da PTHS üleekspressiooni mõju analüüsimine Drosophila arengus da null embrüonaalse neuronaalse fenotüübi päästmine ekspresseerides Da PTHS
Tulemused
E-valkude aluseline heeliks-lingheeliks domeen on kõrgelt konserveerunud Da ja inimese E-valgud on umbes 35% identsed, suurim homoloogia on TCF4 ja Da vahel 35,54% Da ja inimese E-valkude bhlh domeenid on 75% identsed
Pitt-Hopkinsi sündroomiga seostatud mutatsioonid ja Daughterlessi genereeritud mutatsioonid Mutatsioonid Da-s: - R578H - R580W - R582P - A614V - D515G - R580L Sepp et al., 2012
Muteeritud Daughterlessi valkudel on erinevad transaktivatsiooni võimed HEK293 n=3
da G32 GAL4 ekspressioon on embrüos üldine ja da-intron-gal4 ekspressioon närvisüsteemispetsiifiline
Daughterlessi üleekspressioon kasutades da-intron-gal4 on mitteletaalne Kareda ja osaliselt värvusetu silma põhjustas Da R580W, Da R580L ja Da R582P üleekspressioon
Muteeritud Daughterlessi üleekspressioon da G32 -GAL4-ga on letaalne Arengu kestvus - metsiktüüpi Da ja Da D515G - embrüod - Da R580W, Da R580L ja Da R582P esimese astme vaglad - Da R578H ja Da A614V teise astme vaglad
da 10 null mutandi embrüonaalse neuronaalse fenotüübi päästmine ja da 1 embrüonaalne neuronaalne fenotüüp
Kokkuvõte Mutatsioon in vitro transkriptsiooni aktiveerimi -ne Silmafenotüüp üleekspressioon il da-intron- GAL4-ga Letaalsus üleekspressioonil da G32 -GAL4-ga Letaalsus da null taustas da G32 -GAL4-ga ekspresseerides Embrüonaalse närvisüsteemi fenotüübi päästmine da G32 - GAL4-ga Metsiktüüpi jah ei embrüod embrüod päästab D515G jah ei embrüod embrüod päästab R578H ei ei teise astme vaglad mõned esimese astme R580W ei jah esimese astme vaglad R580L ei jah esimese astme vaglad R582P ei jah esimese astme vaglad vaglad embrüod embrüod embrüod A614V vähenenud ei teise astme vaglad esimese ja teise astme vaglad päästab ei päästa ei päästa ei päästa päästab
Järeldused Da on kõigi inimese E-valkude homoloog Minu uuritud mutatsioonid põhjustavad hüpomorfseid kuni dominant-negatiivseid efekte Samad mutatsioonid TCF4-s põhjustavad samu efekte (Sepp et al., 2012) Seega on Drosophila Da sobilik PTHS modelleerimiseks Võimalikud PTHS mudelid - da-intron-gal4 kontrolli all muteeritud Da üleekspresseerivad liinid - muteeritud Da ekspresseerimine hüpomorfses da 1 taustas
Tänuavaldused Juhendajad Mari Palgi ja Tõnis Timmusk Jürgen Tuvikene, Mari Sepp, Hanna Vihma ja kõik teised neurobioloogia grupist
Tänan tähelepanu eest!