PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. SK analüüsikomplekti kasutamiseks analüüsiseadmes Autostainer Link 48

PD-L1 IHC 28-8 pharmdx SK005 50 analüüsikomplekti kasutamiseks analüüsiseadmes Autostainer Link 48 Sihtotstarbeline kasutamine Kasutamiseks in vitro diagnostikas. PD-L1 IHC 28-8 pharmdx on antikehal Monoclonal Rabbit Anti-PD-L1, Clone 28-8 põhinev kvalitatiivne immunohistokeemiline analüüs valgu PD-L1 tuvastamiseks formaliiniga fikseeritud parafiniseeritud (FFPE) mittelamerakulise mitteväikeserakulise kopsuvähi (NSCLC) ja melanoomi koelõikudes visualiseerimissüsteemiga EnVision FLEX analüüsiseadmes Autostainer Link 48. Valgu PD-L1 ekspressiooni määramiseks leitakse, kui suur osa (protsentides) kasvajarakkudest värvub positiivselt membranoosselt suvalise intensiivsusega. Tootega PD-L1 IHC 28-8 pharmdx tuvastatud valgu PD-L1 ekspressioon NSCLC rakkudes võib ravimit OPDIVO (nivolumaab) saavate patsientide puhul korreleeruda pikema elumusega. Valgu PD-L1 ekspressiooni melanoomis, mida PD-L1 IHC 28-8 pharmdx tuvastab, võidakse kasutada selliste patsientide hindamiseks, kelle raviks kaalutakse OPDIVO (nivolumaabi) ja YERVOY (ipilimumaabi) kombinatsioonravi. Kokkuvõte ja selgitus PD-1 ligandide PD-L1 ja PD-L2 seondumine T-rakkude PD-1 retseptoriga pärsib T-rakkude proliferatsiooni ja tsütokiinide tootmist. Teatud kasvajates toimub PD-1 ligandide ülesregulatsioon ning signaalid sellel signaalirajal võivad panustada T-rakulise aktiivse kasvajavastase immuunjärelevalve pärssimisse (1). OPDIVO (nivolumaab) on inimese immunoglobuliin G4 (IgG4) monoklonaalne antikeha, mis seondub PD-1 retseptoriga ning blokeerib selle interakteerumist ligandidega PD-L1 ja PD-L2, takistades PD-1 signaalirajal immuunreaktsiooni pärssimist, sh kasvajavastase immuunreaktsiooni pärssimist (2). Süngeneetilistes hiire kasvajamudelites kaasnes PD-1 aktiivsuse blokeerimisega kasvaja kasvu aeglustumine (3). OPDIVO antavat kliinilist kasu ja toote PD-L1 IHC 28-8 pharmdx kliinilist kasulikkust on uuritud NSLCLC ja melanoomi puhul Mittelamerakuline NSCLC. Valku PD-L1 ekspresseerivate kasvajarakkude tuvastamine mittelamerakulise mitteväikeserakulise kopsuvähi patsiendiproovist võib osutada võimalusele, et ravi OPDIVO -ga (nivolumaabiga) parandab selle patsiendi elumust. Ettevõtte Bristol-Myers Squibb sponsoreeritud OPDIVO kliinilistes uuringutes osalenud patsientide proove analüüsiti tootega PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. Kliinilises uuringus CA209057 uuriti toote PD-L1 IHC 28-8 pharmdx kliinilist kasulikkust OPDIVO -ga ravitavate mittelamerakulist NSCLC-d põdevate patsientide PDL1-staatuse määramiseks (5, 11). Melanoom. Tsütotoksiline T-lümfotsüütide antigeen 4 (CTLA-4) on T-rakkude aktivatsiooni negatiivne regulaator. YERVOY (ipilimumaab) on monoklonaalne antikeha, mis seondub antigeeniga CTLA-4 ja blokeerib CTLA-4 interaktsiooni selle ligandidega CD80/CD86. On näidatud, et CTLA-4 blokeerimine intensiivistab T-rakkude aktivatsiooni ja proliferatsiooni, panustades seega kasvajavastase immuunreaktsiooni üldisesse tugevnemisse (4). PD-1 ja CTLA-4 pärsivad kasvajavastast immuunreaktsiooni nii komplementaarsete kui ka asendamatute mehhanismidega. OPDIVO on nii monoravina kui ka kombinatsioonis ravimitega OPDIVO ja YERVOY andnud varem ravimata hilises staadiumis melanoomiga patsientidel tulemuseks oluliselt pikema progresseerumiseta elumuse kui YERVOY monoravi (8 10). Ettevõtte Bristol-Myers Squibb sponsoreeritud kliinilistes uuringutes analüüsiti ravimiga OPDIVO ravitud patsientide melanoomikoe proove tootega PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. Kliinilises uuringus CA209067 uuriti toote PD-L1 IHC 28-8 pharmdx kliinilist usaldusväärsust selliste patsientide melanoomi PDL1 ekspressiooni hindamises, kes saavad OPDIVO monoravi, OPDIVO ja YERVOY kombinatsioonravi või YERVOY monoravi. OPDIVO ja YERVOY on ettevõtte Bristol-Myers Squibb kaubamärgid. Meetodi põhimõte PD-L1 IHC 28-8 pharmdx sisaldab optimeeritud reaktiive ja protokolli, mis on vajalikud FFPE proovide IHK värvimiseks, kasutades analüüsiseadet Autostainer Link 48 ja eeltöötlusmoodulit PT Link (6). PD-L1 primaarse monokloonse antikehaga või negatiivse kontrollreaktiiviga (NKR) inkubeerimise järel inkubeeritakse proove primaarse antikeha peremeesliigi spetsiifilise Linker-antikehaga ja seejärel kasutusvalmis visualiseerimisreaktiiviga, mis koosneb polümeersele dekstraanstruktuurile seotud sekundaarse antikeha molekulidest ja mädarõika peroksidaasi molekulidest. Seejärel lisatava kromogeeni ensümaatilise konversiooni tulemusel sadestub antigeeni kohal nähtav reaktsioonisaadus. Kromogeenilise reaktsiooni värv oleneb kromogeeni nähtavust parendava reaktiivi valikust. Proovi võib seejärel kõrvalvärvida ja katta katteklaasiga. Tulemusi tõlgendatakse valgusmikroskoobi abil. Värvimistsüklite valideerimiseks on tootega kaasas kontrollalusklaasid, mis sisaldavad kahte formaliinis fikseeritud parafiniseeritud inimese rakuliini. Kaasasolevad materjalid PD-L1 IHC 28-8 pharmdx (kood SK005) All loetletud materjalidest piisab 50 analüüsi jaoks (50 alusklaasi inkubatsioon PD-L1 primaarse antikehaga ja 50 alusklaasi inkubatsioon vastava negatiivse kontrollreaktiiviga, kokku 100 analüüsialusklaasi). Komplektis on täiendavalt PD-L1 primaarset antikeha 15 rakuliini kontrollalusklaaside värvimiseks. See analüüside arv kehtib tingimusel, et igale alusklaasile lisatakse 2 150 µl igat reaktiivi peale reaktiivi DAB+ ja epitoobi taastamise lahuse Target Retrieval Solution. (129094-002) P03914EE_02/SK00521-2/2016.04 lk 1/17

Komplekti kuuluvatest materjalidest piisab maksimaalselt 15 eraldi värvimistsükliks. Kogus Kirjeldus 1 34,5 ml Peroxidase-Blocking Reagent PEROXIDASE-BLOCKING REAGENT Vesinikperoksiidi, detergenti ja 0,015 mol/l naatriumasiidi sisaldav puhverdatud lahus. 1 19,5 ml Primaarne antikeha: Monoclonal Rabbit Anti-PD-L1, Clone 28-8 MONOCLONAL RABBIT ANTI-PD-L1 CLONE 28-8 Küüliku monoklonaalne anti-pd-l1 stabiliseerivat valku ja 0,015 mol/l naatriumasiidi sisaldavas puhverdatud lahuses. 1 15 ml Negative Control Reagent* NEGATIVE CONTROL REAGENT Küüliku monoklonaalne igg kontrollantikeha stabiliseerivat valku ja 0,015 mol/l naatriumasiidi sisaldavas puhverdatud lahuses. *Küüliku monoklonaalset IgG-d müüakse ettevõtte Cell Signaling Tehnology litsentsi alusel. 1 34,5 ml LINKER, Anti-Rabbit LINKER, ANTI-RABBIT Küüliku immunoglobuliinide vastane hiire sekundaarne antikeha stabiliseerivat valku ja 0,015 mol/l naatriumasiidi sisaldavas puhverdatud lahuses. 1 34,5 ml Visualization Reagent-HRP VISUALIZATION REAGENT-HRP Peroksidaasimolekulidega ning küüliku ja hiire immunoglobuliinide vastaste kitse sekundaarse antikeha molekulidega seotud dekstraan stabiliseerivat valku ja mikroobidevastast ainet sisaldavas puhverdatud lahuses. 15 7,2 ml DAB+ Substrate Buffer DAB+ SUBSTRATE BUFFER Vesinikperoksiidi ja mikroobidevastast ainet sisaldav puhverdatud lahus. 1 5 ml DAB+ Chromogen DAB+ CHROMOGEN 3,3 -diaminobensidiin-tetrahüdrokloriid orgaanilises lahustis. 1 34,5 ml DAB Enhancer DAB ENHANCER Vasksulfaat vees. 6 30 ml EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) EnVision FLEX TARGET RETRIEVAL SOLUTION LOW ph (50X) Detergenti ja mikroobidevastast ainet sisaldav puhverdatud lahus, ph 6,1. 15 alusklaasi Kontrollalusklaasid PD-L1 IHC 28-8 pharmdx CONTROL SLIDES Igal alusklaasil on kahe granuleeritud formaliinis fikseeritud parafiniseeritud rakuliini lõigud: NCI-H226** valgu PD-L1 positiivse ekspressiooniga ja MCF-7 ilma valgu PD-L1 ekspressioonita. PD-L1, SK005 pharmdx XXXXX MCF-7: PD-L1-negatiivne NCI-H226: PD-L1-positiivne **Täname Dr. AF Gazdar ja Dr. JD Minna (NIH) nende panuse eest reaktiivi NCI-H226 (ATCC number: CRL-5826 ) väljatöötamisse (7). (129094-002) P03914EE_02/SK00521-2/2016.04 lk 2/17

Märkus. Kõik komplektis olevad reaktiivid on formuleeritud just selles komplektis kasutamiseks. Selleks et analüüs toimiks toote omadustes kirjeldatud viisil, ei tohi ühtegi reaktiivi asendada, välja arvatud EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) (kood K8005). PD-L1 IHC 28-8 pharmdx on mõeldud kasutamiseks analüüsiseadmes Autostainer Link 48. Lisateavet leiate seadmete Autostainer Link 48 ja PT Link kasutusjuhenditest. Vajalikud materjalid, mida kaasas ei ole PT Link Pre-treatment Module (kood PT100/PT101) Autostainer Link 48 (kood AS480) EnVision FLEX Wash Buffer (20x) (kood K8007) EnVision FLEX Hematoxylin (Link) (kood K8008) Destilleeritud või deioniseeritud vesi (reaktiivi kvaliteediga vesi) Taimer Positiivsed ja negatiivsed koed, mida kasutatakse protsessi kontrolliks (vt jaotis Kvaliteedikontroll ja Tabel 1) Mikroskoobialusklaasid: Dako FLEX IHC Microscope Slides (kood K8020) või laetud alusklaasid Fisherbrand Superfrost Plus Katteklaasid Katteklaaside paigaldamiseks vajalik püsikinnituskeskkond ja lisareaktiivid Valgusmikroskoop (4x 40x suurendusega) Ettevaatusabinõud 1. Kasutamiseks in vitro diagnostikas. 2. Professionaalsetele kasutajatele. 3. See toode sisaldab naatriumasiidi (NaN 3), mis on puhtal kujul väga mürgine kemikaal. Kuigi tootes sisalduvaid kontsentratsioone ei peeta ohtlikuks, võib NaN3 reageerida plii- ja vasktorudega, moodustades äärmiselt plahvatusohtlikke metallasiide. Toodet ära visates loputage äravoolu suure koguse veega, et vältida metallasiidide kogunemist torustikesse (12). 4. Primaarne antikeha, negatiivne kontrollreaktiiv, Linker ja visualiseerimisreaktiiv sisaldavad loomse päritoluga materjali. 5. Proove, nii enne kui ka pärast fikseerimist, ning kõiki nendega kokku puutunud materjale tuleb käsitleda kui võimalikke infektsiooniallikaid ja nende hävitamisel tuleb võtta asjakohased ettevaatusabinõud (13). 6. Kui ei kasutata ettenähtud inkubatsiooniaegu, temperatuure ja meetodeid, võivad tulemused olla valed. 7. Reaktiivid on optimaalselt lahjendatud. Edasise lahjenduse tagajärjel võib antigeeni värvumine väheneda. 8. Tugev valgus võib mõjuda kahjulikult visualiseerimisreaktiivile, vedelale DAB+ kromogeenile ja valmistatud DAB+ substraadikromogeeni lahusele. Ärge hoidke süsteemi komponente ega teostage värvimisprotseduuri tugeva valguse (näiteks otsese päikesevalguse) käes. 9. Parafiinijäägid võivad põhjustada valenegatiivseid tulemusi. 10. Kui kasutatavad reaktiivikogused erinevad soovitatutest, võib PD-L1 nähtav immunoreaktiivsus väheneda. 11. Suurte koelõikude, mis katavad 2/3 alusklaasist, värvimiseks võib olla vaja 3 150 µl reaktiivi. 12. Üldiselt ei ole alla 18-aastastel lubatud selle tootega töötada. Kasutajaid tuleb põhjalikult juhendada õigete töövõtete, toote ohtlike omaduste ning asjakohaste ohutusjuhiste osas. Tutvuge toote ohutuskaardiga (SDS), et saada lisateavet. 13. Kandke asjakohaseid isikukaitsevahendeid, et vältida kokkupuudet silmade ja nahaga. 14. Kasutamata lahus tuleb vastavalt kohalikele, riiklikele ja föderaalsetele nõuetele lõppkäidelda. 15. Ohutuskaart on professionaalsetele kasutajatele nõudmise korral saadaval. Oht DAB+ Chromogen: 1 5% bifenüül-3,3',4,4'-tetraüül-tetra-ammoonium-tetrakloriid H350 Võib põhjustada vähktõbe. H341 Võib põhjustada sünnidefekte. P201 Enne kasutamist lugege erijuhiseid. P202 Mitte käidelda enne ohutusnõuetega tutvumist ja nendest arusaamist. P280 Kanda kaitsekindaid. Kanda kaitseprille/kaitsemaski. Kanda kaitserõivastust. P308 + P313 Kokkupuute või kokkupuutekahtluse korral: Pöörduda arsti poole. P405 Hoida luku taga. P501 Sisu ja mahuti kõrvaldada kooskõlas kõigi kohalike, piirkondlike, riiklike ja rahvusvaheliste õigusaktidega. Hoiatus EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x): 1 5% sidrunhape H319 Ärritab silmi tugevalt. H411 Mürgine veeorganismidele, pikaajaline toime. P280 Kanda kaitseprille/kaitsemaski. P273 Vältige kemikaali sattumist keskkonda. P264 Pärast käitlemist pesta hoolega käsi. P305 + P351 + P338 SILMA SATTUMISE KORRAL: loputada mitme minuti jooksul ettevaatlikult veega. Eemaldada kontaktläätsed, kui neid kasutatakse ja kui neid on kerge eemaldada. Loputada veel kord. P337 + P313 Kui silmade ärritus ei möödu: pöörduda arsti poole. P501 Sisu ja mahuti kõrvaldada kooskõlas kõigi kohalike, piirkondlike, riiklike ja rahvusvaheliste õigusaktidega. (129094-002) P03914EE_02/SK00521-2/2016.04 lk 3/17

Säilitamine Komplekti PD-L1 IHC 28-8 pharmdx kõiki komponente, sh kontrollalusklaase, tuleb säilitada originaalanumas pimedas temperatuuril 2 8 C, kui need ei ole parajasti seadmes Autostainer Link 48. Mitte kasutada komplekti pärast selle karbile märgitud kõlblikkusaja lõppu. Kui reaktiive säilitades ei järgita käesolevas pakendi infolehes toodud tingimusi, peab reaktiivide kasutamiseks sobivust hindama kasutaja. Puuduvad silmaga nähtavad tunnused, mis viitaksid toote ebastabiilsusele. Seetõttu tuleb paralleelselt patsiendi proovidega analüüsida positiivseid ja negatiivseid kontrolle. Proovi ettevalmistamine Proove tuleb käidelda nii, et kude säiliks IHK värvinguks. Kõigi proovide puhul tuleb kasutada standardseid koetöötlusmeetodeid. Parafiini sisestatud koelõigud Kasutuseks sobivad formaliinis fikseeritud parafiniseeritud koed. Soovitatavad käitlemis- ja töötlemistingimused: < 30-minutiline isheemiaaeg enne fiksatiivi sukeldamist ning 24 48 tundi kestev fikseerimine 10% neutraalses puhverdatud formaliinis. Muid fiksaatoreid ei ole hinnatud ja need võivad anda valesid tulemusi. Proovid tuleb lõigata 3 kuni 4 mm paksusteks plokkideks, 10% neutraalses puhverdatud formaliinis fikseerida ja dehüdreerida, selgendada alkoholi-ksüleeni vaheldamisega ning seejärel sulaparafiiniga immutada. Parafiini temperatuur ei tohiks ületada 60 C. Koeproovid tuleb lõigata 4 5 µm lõikudeks. Lõigud tuleb kinnitada laetud alusklaasidele Fisherbrand Superfrost Plus või Dako FLEX IHC Microscope Slides (kood K8020) ning paigutada 1 tunniks 58 ± 2 C ahju. Antigeensuse säilitamiseks tul eb alusklaasidele kinnitatud koelõike säilitada pimedas temperatuuril 2 8 C või toatempe ratuuril kuni 25 C, ning värvida 4 kuu jooksul pär ast lõikamist. Kudede terviklikkuse ja antigeensuse tagamiseks ei tohi pärast kinnitamist alusklaaside säilitamis- ja käitlemiskeskkonna temperatuur kunagi olla kõrgem kui 25 C. Toote PD-L1 IHC 28-8 pharmdx kasutamist dekaltsifitseeritud kudedel ei ole hinnatud ning see pole soovitatav. Reaktiivi ettevalmistus Enne värvimist tuleb ette valmistada järgmised reaktiivid: EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) Valmistage ette piisav kogus 1x epitoobi taastamise lahust Target Retrieval Solution, Low ph, lahjendades 50x kontsentraati 1:50 reaktiivi kvaliteediga veega; 1x epitoobi taastamise lahuse ph peab olema 6,1 ± 0,2. Ühest reaktiivi Target Retrieval Solution, Low ph (50x) 30 ml pudelist saab 1:50 lahjendades valmistada 1,5 L 1x reaktiivi, ehk üks seadme PT Link paagitäis, millest piisab 24 alusklaasi töötlemiseks kasutuskorra kohta. Kolme kasutuskorra järel, aga hiljemalt 5 päeva pärast lahjendamist tuleb 1x epitoobi taastamise lahus kasutusest kõrvaldada. Reaktiivi EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) saab vajaduse korral juurde tellida; selle kood on K8005. EnVision FLEX Wash Buffer (20x) Valmistage ette piisav kogus pesupuhvri lahust, lahjendades kontsentraati Wash Buffer (20x) 1:20 reaktiivi kvaliteediga vees loputusetappideks. Kasutamata 1x lahust tohib temperatuuril 2 8 ºC säilitada kuni üks kuu. Hägususe tekkides visake puhverlahus ära. Lisateavet leiate seadme Autostainer Link 48 kasutusjuhendist. EnVision FLEX Wash Buffer (20x) on tellimiseks saadaval koodiga K8007. DAB+ substraadi-kromogeeni lahus Seda lahust tuleb enne kasutamist hoolikalt segada. Lahusesse tekkinud sade ei mõjutada värvimise kvaliteeti. DAB+ substraadi-kromogeeni lahuse ettevalmistuseks lisage 1 tilk vedelat DAB+ kromogeeni ühele ml DAB+ substraatpuhvrile ja segage. Ettevalmistatud substraadi-kromogeeni lahus püsib stabiilsena 5 päeva, kui seda hoitakse pimedas temperatuuril 2 8 C. Olulised märkused. Kui kasutate korraga terve pudeli reaktiivi DAB+ Substrate Buffer, lisage 9 tilka DAB+ kromogeeni. Etiketil on küll kirjas 7,2 ml, aga see on kasutatav ruumala, mis ei hõlma pudeli tühiruumala. Pudelis oleva reaktiivi Liquid DAB+ Chromogen värv võib varieeruda selgest kuni lillakaspruunini. See ei mõjuta toote omadusi. Lahjendage vastavalt eestoodud juhistele. Kui reaktiivile DAB+ Substrate Buffer lisada liiga palju reaktiivi Liquid DAB+ Chromogen, siis positiivne signaal nõrgeneb. Värvimisprotseduur seadmes Autostainer Link 48 Märkused protseduuride kohta Kasutaja peab hoolikalt lugema siintoodud juhiseid ja tutvuma enne kasutamist kõigi komponentide ja instrumentidega (vt Ettevaatusabinõud). Kõik reaktiivid tuleb enne immunovärvimist tasakaalustada toatemperatuuriga (20 25 C). Samuti tuleb k õik inkubatsioonid teha toatemperatuuril. Ärge laske koelõikudel värvimisprotseduuri ajal ära kuivada. Kuivanud koelõikude mittespetsiifiline värvumine võib olla tavalisest tugevam. Kõik värvimise vajalikud etapid ja inkubatsiooniajad on eelprogrammeeritud värvimissüsteemi Dako Link tarkvaras. Protokollide programmeerimise ning lõikude ja reaktiivide laadimise täpseid juhiseid leiate seadmete Autostainer Link 48 ja PT Link kasutusjuhenditest. (129094-002) P03914EE_02/SK00521-2/2016.04 lk 4/17

Märkus. Süsteemiga kaasasolevad reaktiivid ja juhised on välja töötatud optimaalsete tulemuste saamiseks kasutamisel koos soovitatud reaktiivide ja materjalidega. Reaktiivide edasine lahjendamine või inkubatsiooniaegade või -temperatuuride muutmine võib anda valesid või ebaühtlasi tulemusi. Värvimisprotokoll Valige süsteemi Dako Link rippmenüüst värvimisprotokoll PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. Kõik värvimise vajalikud etapid ja inkubatsiooniajad on eelprogrammeeritud värvimissüsteemi Dako Link tarkvaras. Kui protokolle PD-L1 IHC 28-8 pharmdx ei ole teie serveris, võtke ühendust kohaliku tehnilise hooldusteenistuse esindajaga. Etapp 1. Deparafineerimise, rehüdreerimise ja epitoobi taastamise (kolm ühes) protseduur Soovitatav protseduur Täpsemad juhised leiate PT Linki kasutusjuhendist. Seadistage PT Linki (kood PT100/PT101) etapid Preheat (Eelsoojendus) ja Cool (Jahutamine) väärtusele 65 C. Seadistage Heat (Soojendamine) väärtusele 97 C 20 minuti vältel. Täitke PT Linki paagid (1,5 L paagi kohta) reaktiivi Target Retrieval Solution, Low ph lahjendamisel saadud 1x epitoobi taastamise lahusega; sellest peab piisama koelõikude katmiseks. Eelsoojendage epitoobi taastamise lahus temperatuurile 65 C. Kastke kinnitatud FFPE koelõike sisaldavad Autostaineri restid PT Linki paagis olevasse reaktiivi Target Retrieval Solution, Low ph (1x epitoobi taastamise lahus). Inkubeerige 20 minutit temperatuuril 97 C. Kohe kui epitoobi taastamise inkubeerimine on lõppenud ja lahus on jahtunud temperatuurile 65 C, eema ldage PT Linki paagist kõik Autostaineri alusklaasirestid ja pange Autostaineri rest koos alusklaasidega kohe paaki (nt PT Link Rinse Station, kood PT109), mis on täidetud lahjendatud toatemperatuuril pesupuhvriga (kood K8007). Jätke alusklaasid toatemperatuuril lahjendatud pesupuhvrisse 5 minutiks. Etapp 2. Värvimisprotseduur Deparafineerimise, rehüdreerimise ja epitoobi taastamise (kolm ühes) protseduuri järel asetatakse Autostaineri restid koos alusklaasidega seadmesse Autostainer Link 48. Kontrollige laadimise ajal ja enne tsükli käivitamist, et alusklaasid oleksid puhvriga niisutatud. Seade teostab nüüd värvimisprotseduuri kasutades asjakohast reaktiivi, jälgib inkubatsiooniaega ja loputab alusklaase enne uute reaktiivide kasutamist. Reaktiivide inkubatsiooniajad on eelprogrammeeritud Dako Linki tarkvarasse. Etapp 3. Kõrvalvärvimine Alusklaase tuleb 7 minutit kõrvalvärvida reaktiiviga EnVision FLEX Hematoxylin (Link) (kood K8008). Hematoksüliini inkubatsiooniaeg on protokollis eelprogrammeeritud. Etapp 4. Kinnitamine Vaja on mitte-veepõhist püsikinnituskeskkonda. Märkus. Aja jooksul võib ilmneda mõningane värvitud alusklaaside tuhmumine, mis oleneb muu hulgas järgmistest teguritest: kõrvalvärving, kinnitamismaterjalid ja -meetodid ning alusklaaside säilitamistingimused. Tuhmumise minimeerimiseks säilitage klaase pimedas toatemperatuuril (20 25 C). Kvaliteedikontroll Komplekti PD-L1 IHC 28-8 pharmdx reaktiivid on läbinud immunohistokeemilise kvaliteedikontrolli, milles kasutati ülal kirjeldatud epitoobi taastamise ja värvimise protseduure. Kõrvalekalded soovitatavatest koeproovide fikseerimise, töötlemise ja kinnitamise protseduuridest võivad põhjustada tulemuste tugevat varieerumist. Iga värvimistsükli käigus tuleb kasutada kvaliteedikontrollimaterjale. Need kvaliteedikontrollimaterjalid on nimetatud tabelis 1: H&E-värvitud patsiendikoe proov, labori enda hangitud positiivsed ja negatiivsed kontrollkoed ning Dako tarnitud kontrollalusklaas (15). USAs tutvuge Ameerika patoloogide kolleegiumi (College of American Pathologists, CAP) immunohistokeemia sertifitseerimisprogrammi kuuluvate kvaliteedikontrollijuhistega ning samuti CLSI immunotsütokeemia kvaliteeditagamise kinnitatud juhistega (14). Analüüsi kinnitamine Enne antikeha või värvimissüsteemi esmakordset kasutamist diagnostiliseks protseduuriks peab kasutaja kinnitama antikeha spetsiifilisust, katsetades seda mitmete labori enda hangitud teadaolevate IHK omadustega kudedega (positiivne ja negatiivne värvumine). Lugege toote infolehe käesolevas jaotises eespool kirjeldatud kvaliteedikontrolli protseduure. Neid kvaliteedikontrolli protseduure tuleb korrata iga uue komplektiga või kui on tehtud muudatus analüüsi parameetrites. Võimalike probleemide kirjeldused, põhjused ja soovitatud korrigeerivad toimingud on loetletud tabelis 12. Värvumise tõlgendamine mittelamerakuline NSCLC ja melanoom Alusklaase peab hindama patoloog valgusmikroskoobi abil. PD-L1 immunohistokeemilise värvimise hindamisel ja rakkude loendamisel võib kogu proovi esmaseks hindamiseks kasutada 4x suurendusega objektiivi ja rakkude loendamiseks 10 20x objektiivi (vajaduse korral võib kontrolliks kasutada 40x objektiivi). PD-L1 värvumist iseloomustab pruun reaktsioonisaadus (3,3 -diaminobensidiin, DAB). PD-L1-positiivselt värvunuks loetakse kasvajarakku, mille plasmamebraan on ümbritsevalt ja/või osaliselt lineaarselt ükskõik millise intensiivsusega värvunud. Hinnata tuleb kogu proovi. Hinnata tuleb kõiki PD-L1-värvitud patsiendialusklaasil leiduvaid elujõulisi kasvajarakke ning kõik need tuleb kaasata PD-L1 loendamishindamisse. Värvunud rakkude protsentarvu määramiseks peab PD-L1-värvitud patsiendialusklaasil olema vähemalt 100 elujõulist kasvajarakku. Võimalikku tsütoplasmaatilist värvumist loendamisel ei arvestata. PD-L1-positiivselt võivad värvuda ka mittepatoloogilised rakud ja immuunrakud (nt infiltreeruvad lümfotsüüdid ja makrofaagid), kuid neid ei tohi kaasata proovi PD-L1-positiivsuse hindamiseks tehtavasse loendamisse. (129094-002) P03914EE_02/SK00521-2/2016.04 lk 5/17

MÄRKUS. Melanoomi patsiendiproovide tõlgendamisel võib esineda pruuni melaniinipigmenti. Värvunud plasmamembraanide loendamisel ei tohi melaniini lugeda värvumiseks; melaniinisisalduse tuvastamiseks ja välistamiseks võib olla kasulik võrrelda alusklaasi järjestikuse NCR-iga värvitud alusklaasiga. Kui äärmiselt suur melaniinisisaldus takistab kasvajarakkude plasmamembraani värvumuse hindamist, võib proovi tõlgendamisest välistada ja lugeda määramatuks. Iga värvimistsükli järel tuleb alusklaase uurida tabelis 1 näidatud järjestuses, et otsustada värvimistsükli kehtivuse üle ja võimaldada hinnata proovikoe värvumust. Täiendavaid suuniseid leiate juhendist PD-L1 IHC 28-8 pharmdx Interpretation Manual for Non-Squamous Non-Small Cell Lung Cancer or for Melanoma. Tabel 1: Alusklaaside hindamise soovitatav järjestus Proovid Põhiprintsiip Nõuded 1. H&E Esmalt hinnatakse hematoksüliini ja eosiiniga (H&E) värvitud koeproovi, (Labori enda et hinnata koe histoloogilisi hangitud) omadusi ja säilitamiskvaliteeti. 2. Kontrollalusklaas (Dako tarnitud) Toote PD-L1 IHC 28-8 pharmdx PD-L1 primaarse antikehaga värvitud kontrollalusklaasi tuleb uurida, et kontrollida kõigi reaktiivide ettenähtud viisil toimimist. Kontrollalusklaas sisaldab PD-L1- positiivse rakuliini graanulit ja PD-L1-negatiivse rakuliini graanulit. PD-L1 IHC 28-8 pharmdx -värvimine ja H&E-värvimine tuleb teha sama parafiniseeritud koeploki järjestikuste lõikudega. Koeproovid peavad olema intaktsed, hästi säilinud ja kasvajale tüüpilised. Iga värvimistsükli käigus tuleb üks kontrollalusklaas värvida PD-L1 vastase primaarse antikehaga. NCI-H226 (PD-L1-positiivsete rakuliinide) vastuvõetavuskriteeriumid on järgmised. Membranoosselt värvunud 80% rakkudest keskmise värvumisintensiivsusega 2+. Mittespetsiifiline värvumine intensiivsusega < 1+. MCF-7 (PD-L1-negatiivsete rakuliinide) vastuvõetavuskriteeriumid on järgmised. Spetsiifiline värvumine puudub. Mittespetsiifiline värvumine intensiivsusega < 1+. Pange tähele, et vahel võivad MCF-7 rakugraanulis mõned rakud siiski värvuda. Kohalduvad järgmised vastuvõetavuskriteeriumid: vastuvõetav on MCF-7 rakupelleti piires kokku 10 värvunud plasmamembraaniga rakku või intensiivsusega 1+ tsütoplasmaatiliselt värvunud rakku. 3. Positiivse kontrollkoe alusklaasid (Labori enda hangitud) 4. Negatiivse kontrollkoe alusklaasid (Labori enda hangitud) Järgmisena tuleb uurida PD-L1 primaarse antikehaga ja negatiivse kontrollreaktiiviga värvitud positiivse kontrollkoe alusklaase. Need alusklaasid võimaldavad kontrollida, kas fikseerimise ja epitoobi taastamise protsessid andsid vajaliku tulemuse. Teadaolevalt positiivseid kontrollkudesid tohib kasutada ainult töödeldud kudede ja analüüsireaktiivide toimivuse jälgimiseks, MITTE abivahendina patsiendiproovide spetsiifilisel diagnoosimisel. Järgmisena tuleb uurida PD-L1 primaarse antikehaga ja negatiivse kontrollreaktiiviga värvitud negatiivse kontrollkoe alusklaase (teadaolevalt PD-L1-negatiivsed), et kontrollida primaarse antikeha spetsiifilisust sihtantigeeni suhtes. Teise võimalusena võib negatiivse kontrollkoena kasutada positiivse kontrollkoe negatiivseid osi, kuid selle võimaluse kasutatavust peab kinnitama kasutaja. Kui ühe või mõlema kontroll-rakuliini tulemus ei vasta neile kriteeriumitele, tuleb patsiendiproovide tulemused lugeda kehtetuks. Kontrollmaterjalid peavad olema lahangul/biopsial/kirurgilisel protseduuril saadud patsiendiprooviga samaliigilise kasvaja koeproovid, mis fikseeritakse, töödeldakse ja kinnitatakse nii kiiresti kui võimalik ja samal viisil nagu patsiendiproov(id). Kasutage värvumise tulemuste tõlgendamiseks intaktseid proove, sest degenereerunud rakud ja nekrootiline kude värvuvad sageli mittespetsiifiliselt. Positiivseks kontrollmaterjaliks valitud koed peavad andma PD-L1-värvimisel nõrgalt kuni mõõdukalt positiivse värvumise, et saaks avastada nõrku muutusi analüüsi tundlikkuses. Iga värvimistsükli käigus tuleb kasutada kahte positiivse kontrollkoe alusklaasi. PD-L1-värvitud alusklaas. Täheldatav peaks olema plasmamembraani pruun värvumine. Mittespetsiifiline värvumine peab olema 1+. Negatiivse kontrollreaktiiviga värvitud alusklaas. Membraani värvumine puudub. Mittespetsiifiline värvumine peab olema 1+. Kui positiivsed kontrollkoed ei värvu asjakohaselt positiivselt, tuleb analüüsitud proovide tulemused lugeda kehtetuks. Kontrollmaterjalid peavad olema lahangul/biopsial/kirurgilisel protseduuril saadud patsiendiprooviga samaliigilise kasvaja koeproovid, mis fikseeritakse, töödeldakse ja kinnitatakse nii kiiresti kui võimalik ja samal viisil nagu patsiendiproov(id). Iga värvimistsükli käigus tuleb kasutada kahte negatiivse kontrollkoe alusklaasi. PD-L1-värvitud alusklaas. Kasvajarakkude membraan ei värvu. Mittespetsiifiline värvumine peab olema 1+. Negatiivse kontrollreaktiiviga värvitud alusklaas. Membraani värvumine puudub. Mittespetsiifiline värvumine peab olema 1+. Kui negatiivse kontrollkoe alusklaasidel ilmneb spetsiifiline plasmamembraani värvumus, tuleb patsiendiproovi tulemus lugeda kehtetuks. (129094-002) P03914EE_02/SK00521-2/2016.04 lk 6/17

5. Negatiivse kontrollreaktiiviga värvitud patsiendikoe alusklaas 6. Patsiendikoega alusklaas, mis on värvitud PD-L1 primaarse antikehaga Järgmisena uurige patsiendiproove, mida on värvitud komplekti PD-L1 IHC 28-8 pharmdx negatiivse kontrollreaktiiviga. Negatiivset kontrollreaktiivi kasutatakse primaarse antikeha asemel ning see aitab spetsiifilist värvumist antigeeni asukohas tõlgendada. Uurige kogu patsiendiproovi alusklaasi, mis on värvitud komplekti PD-L1 IHC 28-8 pharmdx PD-L1 primaarse antikehaga. Komplekti PD-L1 IHC 28-8 pharmdx immunoreaktiivsuse kohta leiate täpsemat teavet jaotistest Kokkuvõte ja selgitus, Piirangud ja Toote omadused. Plasmamembraani värvumuse puudumine kinnitab, et primaarne antikeha PD-L1 märgistab spetsiifiliselt sihtantigeeni. Mittespetsiifiline värvumine peab olema 1+. Positiivse värvumisintensiivsuse hindamisel tuleb arvesse võtta võimalikku mittespetsiifilist taustvärvumist, mida on täheldatud sama värvimistsükli negatiivse kontrollreaktiiviga töödeldud alusklaasil. Nagu iga immunohistokeemilise analüüsi puhul, tähendab negatiivne tulemus, et antigeeni ei tuvastatud, aga ei pruugi tingimata tähendada, et antigeen uuritud rakkudes/koes puudus. Hinnata tuleb kõiki PD-L1-värvitud patsiendialusklaasil leiduvaid elujõulisi kasvajarakke ning kõik need tuleb kaasata PD-L1 loendamishindamisse. Värvunud rakkude protsentarvu määramiseks peab PD-L1-värvitud patsiendialusklaasil olema vähemalt 100 elujõulist kasvajarakku. Üldised piirangud 1. Immunohistokeemiline analüüs on mitmeastmeline diagnostiline protseduur, mis vajab spetsiifilist väljaõpet sobivate reaktiivide valimise; koe valimise, fikseerimise ja töötlemise; immunohistokeemilise alusklaasi ettevalmistamise ja värvimistulemuse tõlgendamise alal. 2. Koe värvumine sõltub koe käitlemisest ja töötlemisest enne värvimist. Vale fikseerimine, külmutamine, ülessulatamine, pesemine, kuivatamine, kuumutamine, lõikudeks lõikamine või kontaminatsioon teiste kudede või vedelikega võib põhjustada artefakte, antikehade lõksustumist või valenegatiivseid tulemusi. Vastuolulised tulemused võivad olla tingitud fikseerimis- ja kinnitamismeetodite variatsioonist või koele omastest ebaregulaarsustest. 3. Tugev või mittetäielik kõrvalvärving võib tulemuste tõlgendamist häirida. 4. Positiivset värvumist või selle puudumist tuleb kliiniliselt hinnata muude kliiniliste andmete, morfoloogia ja teiste histopatoloogiliste kriteeriumide kontekstis. Värvumise või selle puudumise kliinilisel tõlgendamisel tuleb kasutada morfoloogilisi uuringuid ja nõuetekohaseid kontrolle ning ka muid diagnostilisi teste. Värvitud alusklaase peab tõlgendama kvalifitseeritud patoloog, kes tunneb konkreetseid antikehi, reaktiive ja kasutatavaid meetodeid. Värvimine tuleb teha sertifitseeritud ja litsentseeritud laboris ning selle läbiviimist peab juhendama patoloog, kes vastutab värvitud alusklaaside ülevaatamise eest ning tagab positiivsete ja negatiivsete kontrollide nõuetekohase kasutamise. 5. B-hepatiidi viirusega nakatunud patsientide koed, mis sisaldavad B-hepatiidi pinnaantigeeni (HBsAg), võivad mädarõika peroksüdaasiga värvuda mittespetsiifiliselt (15). 6. Analüüsitud koetüüpidel ei saa ootamatute reaktsioonide võimalust täielikult välistada antigeeniekspressiooni bioloogilise varieeruvuse tõttu kasvajakudedes või teistes patoloogilistes kudedes. Mis tahes ootamatu reaktsiooni korral võtke ühendust Dako tehnilise toega. 7. Valepositiivsed tulemused võivad ilmneda valkude ja substraadi reaktsioonisaaduste mitteimmunoloogilise seondumise tõttu. See võib olla põhjustatud ka pseudoperoksidaasi aktiivsusest (erütrotsüüdid) ja endogeensest peroksidaasi aktiivsusest (tsütokroom c) (14). 8. Kõnealusesse süsteemi kuuluvad reaktiivid ja kasutusjuhised on välja töötatud analüüsi optimaalse toimivuse tagamiseks. Reaktiivide edasine lahjendamine või inkubatsiooniaegade või -temperatuuride muutmine võib anda valesid või ebaühtlasi tulemusi. Tootespetsiifilised piirangud 1. Valenegatiivne tulemus võib olla seotud aja jooksul koes toimuva antigeeni degradatsiooniga. Alusklaasidele kinnitatud koelõike tuleb säilitada pimedas temperatuuril 2 8 C või toatempe ratuuril kuni 25 C, ning värvida 4 kuu jooksul pär ast lõikamist. Kudede terviklikkuse ja antigeensuse tagamiseks ei tohi pärast kinnitamist alusklaaside säilitamis- ja käitlemiskeskkonna temperatuur kunagi olla kõrgem kui 25 C. 2. Et saada optimaalseid ja korratavaid tulemusi, tuleb PD-L1 valgu epitoobi taastamine teha pärast seda, kui koed on tavaviisil fikseeritud (neutraalses puhverdatud formaliinis) ja parafiniseeritud. 3. Ärge asendage kõnealuse komplekti reaktiive sama toote teise partiisse või teiste tootjate komplektidesse kuuluvate reaktiividega. Ainsaks erandiks onenvision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph 50x, mida saab vajaduse korral juurde tellida koodiga K8005. 4. Värvitud kontroll-rakuliine tohib kasutada ainult värvimistsükli kontrollimiseks ja neid ei tohi kasutada koelõikude värvumisreaktsiooni kvantitatiivseks hindamiseks. 5. Toote PD-L1 IHC 28-8 pharmdx kasutavust koeproovidega, mille fikseerimiseks on kasutatud muid fiksatiive peale 10% neutraalse puhverdatud formaliini, ei ole kontrollitud. 6. Kliinilistes uuringutes, milles kasutati toodet PD-L1 IHC 28-8 pharmdx, loeti aktsepteeritavateks proovitüüpideks ekstsisioon-, intsisioonvõi jämenõelbiopsiaproove. Peennõelaproove või muid tsütoloogilisi proove ei loetud biomarkerite analüüsiks piisavateks ja need välistati toodet PD-L1 IHC 28-8 pharmdx hõlmanud kliinilistest uuringutest. Toimivuse mittekliiniline hindamine PD-L1 IHC 28-8 pharmdx analüüdispetsiifilisus Toote PD-L1 IHC 28-8 pharmdx primaarne antikeha on küüliku monoklonaalne inimese PD-L1 vastane antikeha, kloon 28-8. Antikeha tootmiseks kasutatud immunogeen on puhastatud rekombinantne inimese PD-L1, mis sisaldab inimese PD-L1 rakuvälist domeeni (Phe19-Thr239). PD-L1 primaarse antikehaga IHK värvimisel ei ilmnenud selle ristreaktiivsust hiina hamstri munasarja (CHO) rakkudes eksogeenselt ekspresseeritud PD-L2-ga. PD-L1 IHC 28-8 pharmdx tuvastab spetsiifiliselt FFPE kudede kasvajarakkudes ekspresseerunud membraanivalku PD-L1, mille reaktiivsuse saab täielikult kõrvaldada PD-L1 antigeeni lisamisega. PD-L1 IHC 28-8 pharmdx ei tuvasta PD-L1 membraanivalku PD-L1 kasvajarakkudes, mille PD-L1-geen on knock-out-meetodil välja lülitatud. (129094-002) P03914EE_02/SK00521-2/2016.04 lk 7/17

Mittepatoloogilised koed ja kasvajakoed Tabelis 2 on toodud kokkuvõte antikeha Monoclonal Rabbit Anti-Human PD-L1 immunoreaktiivsusest soovitatud mittepatoloogiliste kudede paneelis. Tabelis 3 on toodud kokkuvõte antikeha Monoclonal Rabbit Anti-Human PD-L1 immunoreaktiivsusest mitme erineva kasvaja kudesid hõlmavas paneelis. Kõik koed olid formaliinis fikseeritud ja parafiini sisestatud ning värvitud tootega PD-L1 IHC 28-8 pharmdx vastavalt käesoleval pakendi infolehel toodud juhistele. PD-L1 IHC 28-8 pharmdx tuvastas valku PD-L1 selliste rakutüüpide plasmamembraanis, mis teadaolevalt ekspresseerivad PD-L1 antigeeni, näiteks immuunrakud ja peamiselt epiteelse päritoluga kasvajarakud. Tabel 2: Toote PD-L1 IHC 28-8 pharmdx mittepatoloogiliste kudedega reaktiivsuse kokkuvõte Koe tüüp (testitute arv) Plasmamembraani positiivne värvumine: Koeelemendid Positiivne tsütoplasmaatiline värvumine: Koeelemendid Eesnääre (2) 0/2 0/2 Emakakael (3) 1/3 epiteel 1/3 epiteel Emakas (3) 0/3 0/3 Harkelund (3) 3/3 säsiepiteel 0/3 Jämesool (3) 2/3 makrofaagid 0/3 Kilpnääre (3) 0/3 0/3 Kops (3) 3/3 alveolaarsed makrofaagid 0/3 Kõrvalkilpnääre (3) 3/3 epiteel 0/3 Käbikeha (3) 1/3 anterioorne adenohüpofüüs 1/3 anterioorne adenohüpofüüs 3/3 posterioorne neurohüpofüüs Luuüdi (3) 3/3 megakarüotsüüdid 3/3 megakarüotsüüdid Magu (3) 0/3 0/3 Maks (3) 2/3 immuunrakud 2/3 immuunrakud Mandlid (3) 3/3 krüptiepiteel 0/3 3/3 germinaaltsenter (immuunrakud) Mesoteelirakud (3) 0/3 0/3 Munandid (3) 0/3 1/3 Leydigi rakud Munasari (3) 0/3 0/3 Nahk (3) 0/3 1/3 epiteel Neer (3) 3/3 torukeste epiteel 3/3 torukeste epiteel Neerupealis (3) 3/3 säsirakud 3/3 säsirakud Närv, perifeerne (3) 0/3 0/3 Pankreas (3) 3/3 epiteel (peamiselt saarekesterakud) 3/3 epiteel (peamiselt saarekesterakud) Peensool (2) 0/2 0/2 Põrn (3) 1/3 makrofaagid 0/3 3/3 litoraalsed rakud Rinnakude (3) 0/3 0/3 Suuraju (3) 0/3 0/3 Söögitoru (3) 0/3 0/3 Südamelihas (3) 0/2 0/2 Süljenääre (3) 0/3 0/3 Väikeaju (3) 0/3 0/3 Vöötlihas (3) 0/2 0/2 Tabel 3: Toote PD-L1 IHC 28-8 pharmdx kasvajakudedega reaktiivsuse kokkuvõte Kasvaja tüüp Asukoht/elund PD-L1-positiivsed / kokku (N = 162) Bronhoalveolaarne kartsinoom, kops 0/1 Eesnääre 2/4 Emakakael, endotservikaalset tüüpi 0/1 Emakas, endomeetrium 1/3 Emakas, heledarakuline 1/1 GI, kopsumetastaasidega 0/1 Jämesool 2/5 Kilpnäärne, follikulaarne 0/1 Kilpnäärne, follikulaarne-papillaarne 0/1 Kilpnäärne, papillaarne 0/3 Kops 2/5 Adenokartsinoom Käärsool, maksametastaasidega 1/1 Käärsool, mutsiinne 0/1 Magu 1/6 Magu, mutsiinne 0/1 Munasari 0/1 Munasari, endomeetrium 0/1 Munasari, mutsiinne 0/1 Munasari, seroosne 0/1 Pankreas 1/2 Pankreas, duktaalne 0/3 Pea ja kael, kõva suulagi 0/1 Peensool 0/2 Pärasool 2/4 Rind, DCIS 0/2 (129094-002) P03914EE_02/SK00521-2/2016.04 lk 8/17

Kasvaja tüüp Asukoht/elund PD-L1-positiivsed / kokku (N = 162) Rind, invasiivne duktaalne 3/7 Rind, invasiivne duktaalne lümfisõlmemetastaasidega 1/1 Sapipõis 2/4 Söögitoru 1/1 Süljenääre/kõrvalsüljenääre 0/2 Ussripik 1/1 Astrotsütoom Suuraju 0/3 Basaalrakuline kartsinoom Nahk 0/1 Embrüo kartsinoom Munand 0/1 Ependümoom Peaaju 0/1 Glioblastoom Peaaju 0/1 Hepatoblastoom Maks 0/1 Hepatotsellulaarne kartsinoom Maks 1/5 Jämesool 0/1 Inerstitsialoom Peensool 0/1 Pärasool 0/1 Kartsinoom Ninaneelu, NPC 0/1 Kordoom Vaagnaõõs 0/1 Emakakael 2/4 Emakas 1/1 Kops 1/3 Lamerakuline kartsinoom Nahk 1/2 Pea ja kael 0/2 Söögitoru 4/7 Söögitoru lamerakuline kartsinoom lümfisõlmemetastaasidega 1/1 Liposarkoom Kõhuõõs, mutsiinne 0/1 Lümfoom Anaplastiline suurerakuline Lümfisõlm 1/1 Difuusne B-rakuline Lümfisõlm 2/4 Hodgkini Lümfisõlm 2/2 Mitte-Hodgkini Lümfisõlm 1/1 Medullaarne kartsinoom Kilpnääre 0/1 Medullablastoom Peaaju 0/1 Ninaõõs 0/1 Melanoom Pärasool 0/1 Meningioom Peaaju 0/2 Mesotelioom Kõhukelme 0/1 Neerupealise koore kartsinoom Neerupealis 0/1 Neerurakuline kartsinoom Heledarakuline Neer 0/6 Papillaarne Neer 0/1 Neuroblastoom Retroperitoneaalne ruum 0/1 Neurofibroom Pehmed koed, alaselg 0/1 Primitiivne neuroektodermaalne Retroperitoneaalne ruum 0/1 Saarekeserakkude kasvaja Pankreas 0/1 Sarkoom Heledarakuline Kõhuõõne sein 0/1 Kondrosarkoom Luu 0/1 Kusepõis 0/1 Leiomüosarkoom Pehmed koed, rindkereõõne sein 0/1 Liposarkoom Kõhuõõs, mutsiinne 0/1 Osteosarkoom Luu 0/2 Eesnääre 0/1 Rabdomüosarkoom Pehmed koed, embrüonaalne 0/1 Retroperitoneaalne ruum 0/1 Sünoviaalsarkoom Vaagnaõõs 0/1 Seminoom Munand 0/2 Jämesool 0/1 Signet ring -rakuline kartsinoom Käärsoole signet ring -rakuline kartsinoom munasarjametastaasidega 0/1 Spermatsütoom Munand 0/2 Suurerakuline kartsinoom Kops 1/1 Kusepõis 3/6 Transitoorrakuline kartsinoom Neer 0/1 Tümoom Keskseinand 1/1 Väikeserakuline kartsinoom Kops 1/2 (129094-002) P03914EE_02/SK00521-2/2016.04 lk 9/17

Analüütiline tundlikkus: mittelamerakuline NSCLC Toote PD-L1 IHC 28-8 pharmdx analüütilist tundlikkust katsetati 112 erineva NSCLC juhtumi FFPE proovidega I kuni IV staadiumis, kasutades kaubanduslikku tootepartiid. PD-L1 ekspressiooni hindamisel värvus 0 100% positiivsetest kasvajarakkudest värvumisintensiivsusega 0 3. Korduvus: mittelamerakuline NSCLC Toote PD-L1 IHC 28-8 pharmdx korduvust hinnati Dako-siseselt. Tulemusandmed on esitatud tabelis 4. Iga hinnatud PD-L1 ekspressiooni taseme kohta määrati negatiivsete tulemuste ühtivusprotsent (NPA), positiivsete tulemust ühtivusprotsent (PPA) ja üldine ühtivusprotsent (OA). NPA, PPA, OA ja vastava 95% Wilsoni skoori usaldusintervalide arvutamisel kasutati võrdlusväärtusena kõige sagedamini esinenud vaatlustulemust ning seetõttu välistati üks selle tulemusega vaatlus paarikaupa võrdlemisest. Tabel 4: PD-L1 IHC 28-8 pharmdx korduvus: mittelamerakuline NSCLC Korduvus Meetod Seadmetevaheline 10 mittelamerakulise NSCLC proovi, millel olid erinevad PD-L1 IHK ekspressiooni väärtused, analüüsiti kolmes replikaadis kolme analüüsiseadmega Autostainer Link 48. Kokku saadi 60 sõltumatut võrdluspaari. Analüüsijatevaheline 12 mittelamerakulise NSCLC proovi, millel olid erinevad PD-L1 IHK ekspressiooni väärtused, analüüsiti kolmes replikaadis kolme analüüsija poolt ühe analüüsiseadmega Autostainer Link 48. Kokku saadi 72 sõltumatut võrdluspaari. Päevadevaheline 10 mittelamerakulise NSCLC proovi, millel olid erinevad PD-L1 IHK ekspressiooni väärtused, analüüsiti kolmes replikaadis viiel mittejärjestikusel päeval ühe analüüsiseadmega Autostainer Link 48. Kokku saadi 80 sõltumatut võrdluspaari. Partiidevaheline Värvimistsükli sisene 20 mittelamerakulise NSCLC proovi, millel olid erinevad PD-L1 IHK ekspressiooni väärtused, analüüsiti kahes replikaadis viie reaktiivipartiiga ühe analüüsiseadmega Autostainer Link 48. Kokku saadi 160 sõltumatut võrdluspaari. 10 mittelamerakulise NSCLC proovi, millel olid erinevad PD-L1 IHK ekspressiooni väärtused, analüüsiti kaheksas replikaadis ühes analüüsiseadme Autostainer Link 48 värvimistsüklis. Kokku saadi 70 sõltumatut võrdluspaari. % ühtivus (95% usaldusvahemik) 1% ekspressioonitase 5% ekspressioonitase 10% ekspressioonitase NPA 100 (82,4, 100) PPA 100 (91,6, 100) OA 100 (94,0, 100) NPA 100 (86,2, 100) PPA 100 (92,6, 100) OA 100 (94,9, 100) NPA 100 (86,2, 100) PPA 100 (93,6, 100) OA 100 (95,4, 100) NPA 100 (94,3, 100) PPA 100 (96,2, 100) OA 100 (97,7, 100) NPA 100 (84,5, 100) PPA 100 (92,7, 100) OA 100 (94,8, 100) NPA 100 (86,2, 100) PPA 100 (90,4, 100) OA 100 (94,0, 100) NPA 100 (91,6, 100) PPA 100 (88,6, 100) OA 100 (94,9, 100) NPA 100 (89,3, 100) PPA 100 (92,6, 100) OA 100 (95,4, 100) NPA 100 (95,4, 100) PPA 100 (95,4, 100) OA 100 (97,7, 100) NPA 100 (87,9, 100) PPA 100 (91,6, 100) OA 100 (94,8, 100) NPA 100 (91,6, 100) PPA 100 (82,4, 100) OA 100 (94,0, 100) NPA 100 (93,4, 100) PPA 100 (82,4, 100) OA 100 (94,9, 100) NPA 98,2 (90,6, 99,7) PPA 100 (86,2, 100) OA 98,8 (93,3, 99,8) NPA 100 (96,4, 100) PPA 100 (93,6, 100) OA 100 (97,7, 100) NPA 100 (92,7, 100) PPA 100 (84,5, 100) OA 100 (94,8, 100) Väline korratavus: mittelamerakuline NSCLC Toote PD-L1 IHC 28-8 pharmdx välist korratavust hinnati kolmes välises katselaboris. Enne värvitud koelõikude hindamist need pimendati ja randomiseeriti. Tulemusandmed on esitatud tabelis 5. Iga hinnatud PD-L1 ekspressiooni taseme kohta määrati negatiivsete tulemuste ühtivusprotsent (NPA), positiivsete tulemust ühtivusprotsent (PPA) ja üldine ühtivusprotsent (OA). NPA, PPA, OA ja vastava 95% Wilsoni skoori usaldusintervalide arvutamisel kasutati võrdlusväärtusena kõige sagedamini esinenud vaatlustulemust ning seetõttu välistati üks selle tulemusega vaatlus paarikaupa võrdlemisest. (129094-002) P03914EE_02/SK00521-2/2016.04 lk 10/17

Tabel 5: Toote PD-L1 IHC 28-8 pharmdx korratavus mittelamerakuline NSCLC analüüsimisel kolmes välises laboris Korratavus Laboritevaheline hindamine (kolm laborit) Laborisisene hindamine Vaatlejatevaheli ne (üks vaatleja igas laboris kolmest) Vaatlejasisene (üks vaatleja igas laboris kolmest) Meetod 10 mittelamerakulise NSCLC proovi, millel olid erinevad PD-L1 IHK ekspressiooni tasemed, analüüsiti viiel mittejärjestikusel päeval. Laboritevahelisse hindamisse kaasati kolmest laborist kokku 140 sõltumatut võrreldavat tulemustepaari. 10 mittelamerakulise NSCLC proovi, millel olid erinevad PD-L1 IHK ekspressiooni tasemed, analüüsiti viiel mittejärjestikusel päeval kolmes laboris. Laborisisesse hindamisse kaasati kolmest laborist kokku 120 sõltumatut võrreldavat tulemustepaari. 15 erinevate PD-L1 IHK ekspressiooni väärtustega mittelamerakulise NSCLC proovi, mis eelnevalt värviti tootega PD-L1 IHC 28-8 pharmdx, hinnati kolme patoloogi poolt, üks igas uuringulaboris kolmest, kolmel mittejärjestikusel päeval. Vaatlejatevahelisse hindamisse kaasati kolmest laborist kokku 120 sõltumatut võrreldavat tulemustepaari. 15 erinevate PD-L1 IHK ekspressiooni väärtustega mittelamerakulise NSCLC proovi, mis eelnevalt värviti tootega PD-L1 IHC 28-8 pharmdx, hinnati kolme patoloogi poolt, üks igas uuringulaboris kolmest, kolmel mittejärjestikusel päeval. Vaatlejasisesse hindamisse kaasati kolmest laborist kokku 90 sõltumatut võrreldavat tulemustepaari. % ühtivus (95% usaldusvahemik) 1% ekspressioonitase NPA 100 (93,6, 100) PPA 98,8 (93,6, 99,8) OA 99,3 (96,1, 99,9) NPA 100 (92,6, 100) PPA 98,6 (92,5, 99,8) OA 99,2 (95,4, 99,9) NPA 96,9 (89,3, 99,1) PPA 100 (93,6, 100) OA 98,3 (94,1, 99,5) NPA 95,8 (86,0, 98,8) PPA 100 (91,6, 100) OA 97,8 (92,3, 99,4) 5% ekspressioonitase NPA 91,4 (82,5, 96,0) PPA 97,1 (90,2, 99,2) OA 94,3 (89,1, 97,1) NPA 96,4 (87,9, 99,0) PPA 95,3 (87,1, 98,4) OA 95,8 (90,6, 98,2) NPA 100 (94,3, 100) PPA 89,3 (78,5, 95,0) OA 95,0 (89,5, 97,7) NPA 100 (93,1, 100) PPA 100 (90,8, 100) OA 100 (95,9, 100) Toimivuse kliiniline hindamine: mittelamerakuline NSCLC Toote PD-L1 IHC 28-8 pharmdx kliinilist kasulikkust hinnati uuringus CA209057 kolmanda faasi randomiseeritud avatud uuringus, milles võrreldi nivolumaab- ja dotsetakseelravi täiskasvanud ( 18 aasta vanustel) patsientidel, kellel oli süvenenud või metastaatiline mittelamerakuline NSCLC pärast eelneva plaatinapreparaati hõlmava dublettkeemiaravi ebaõnnestumist. Kokku randomiseeriti uuringusse 582 osalejat 112 uuringukeskuses 22 riigis (Argentiina, Austraalia, Austria, Brasiilia, Kanada, Tšiili, Tšehhi Vabariik, Prantsusmaa, Saksamaa, Hongkong, Ungari, Itaalia, Mehhiko, Norra, Peruu, Poola, Rumeenia, Vene Föderatsioon, Singapur, Hispaania, Šveits ja Ameerika Ühendriigid). Uuringus osalejad randomiseeriti ravirühmadesse suhtes 1:1 ning stratifitseeriti vastavalt 1) varasemale säilitusravi kasutamisele (oli / ei olnud kasutanud) ja 2) raviliinile (teise liini ravi / kolmanda liini ravi). Uuringueelsed (algseisundi) kasvajakoe proovid võeti enne randomiseerimist ja enne ravi algust, et analüüsida ravi efektiivsust PD-L1 eelmääratletud algseisundi ekspressioonitasemete põhjal (teisene eesmärk). Peamiseks tulemusnäitajaks oli üldelumus (OS). Teisesteks tulemusnäitajateks olid objektiivse ravivastuse määr (ORR), progresseerumiseta elumus (PFS) ja haigusega seotud sümptomite taandumine 12. nädalaks, mõõdetuna kopsuvähi sümptomiskaalal Lung Cancer Symptom Scale (LCSS). Osalejate algseisundi demograafilised ja haigusega seotud omadused olid nivolumaani ja dotsetakseeli rühmades üldiselt sarnased. Keskmine vanus oli 62 aastat (vahemik: 21 kuni 85); 34% osalejatest 65 aastat vanad ja 7% osalejatest 75 aastat vanad. Suurem osa patsientidest olid valgest rassist (92%) ja mehed (55%); algseisundi ECOG-staatus oli 0 (31%) või 1 (69%). Seitsekümmend üheksa protsenti osalejatest olid endised/praegused suitsetajad. Vastavalt uuringusse kaasamise kriteeriumitele võeti kasvajaproovid mittelamerakulistest NSCLC kasvajatest. PD-L1 ekspressiooni sagedused kõigi uuringu CA209057 randomiseeritud osalejate kõigil eelmääratletud algseisundi ekspressioonitasemetel on esitatud tabelis 6. Tabel 6: PD-L1 uuringueelse ekspressiooni sagedus kõigi randomiseeritud mittelamerakulise NSCLC-ga osalejate hulgas CA209057 Võrdluspopulatsiooni PD-L1 ekspressiooni kategooria Nivolumaab 3 mg/kg Dotsetakseel Kokku Üldine 292 290 582 PD-L1 mõõdetav, N (%) 231 (79,1) 224 (77,2) 455 (78,2) PD-L1 ekspressioon 1% 123/231 (53,2) 123/224 (54,9) 246/455 (54,1) PD-L1 ekspressioon < 1% 108/231 (46,8) 101/224 (45,1) 209/455 (45,9) PD-L1 ekspressioon 5% 95/231 (41,1) 86/224 (38,4) 181/455 (39,8) PD-L1 ekspressioon < 5% 136/231 (58,9) 138/224 (61,6) 274/455 (60,2) Baastaseme PD-L1 ekspressioon 10% 86/231 (37,2) 79/224 (35,3) 165/455 (36,3) PD-L1 ekspressioon < 10% 145/231 (62,8) 145/224 (64,7) 290/455 (63,7) PD-L1 mittemõõdetav, N (%) 61 (20,9) 66 (22,8) 127 (21,8) PD-L1 ekspressiooniga (kõigil ekspressioonitasemetel) patsientidel oli OPDIVO rühmas pikem elumus kui dotsetakseeli rühmas, samas kui PD-L1 ekspressioonita patsientide elumus oli mõlemas rühmas sarnane. Nivolumaabi ja dotsetakseeli alamrühmades ilmnes PD-L1 ekspressioonitasemete kaupa analüüsimisel oluline OS-i erinevus. PD-L1 ekspressioonitasemetel 1%, 5%, ja 10% oli OS-i mediaan nivolumaabi rühmas vastavalt 17,1, 18,2 ja 19,4 kuud ning dotsetakseeli rühmas vastavalt 9,0, 8,1 ja 8,0 kuud. Ekspressioonitasemetel < 1%, < 5%, ja < 10% ei ilmnenud ravirühmade vahel OS-i erinevusi; nivolumaabi rühmas oli OS-i mediaan 9,7 kuni 10,4 kuud ning detsetakseeli rühmas 10,1 kuni 10,3 kuud. Stratifitseerimata ohusuhted (HR) ja üldelumuse mediaanid (OS) on esitatud joonisel 1. Alamrühmade PD-L1 ekspressiooni Kaplan-Meieri diagramm on esitatud joonisel 2 ja joonisel 3. (129094-002) P03914EE_02/SK00521-2/2016.04 lk 11/17

Joonis 1. Blobogramm erineva PD-L1 ekspressiooniga mittelamerakulise NSCLC patsientide OS-id CA209057 OS-i mediaan (kuudes) PD-L1 ekspressiooni tase Stratifitseerimata HR OPDIVO Dotserakseel 1% (n = 246) < 1% (n = 209) 5% (n = 181) < 5% (n = 274) 10% (n = 165) < 10% (n = 290) 0,59 17,1 9,0 0,90 10,4 10,1 0,43 18,2 8,1 1,01 9,7 10,1 0,40 19,4 8,0 1,00 9,9 10,3 Märkus. Stratifitseerimata ohusuhe ja selle 95% CI hinnati Coxi proportsionaalsete ohtude mudeliga, kasutades üksiku kovariaadina randomiseeritud haru. Joonis 2. Üldelumus mittelamerakulise NSCLC patsiendid, kelle PD-L1 ekspressioon 1% CA209057 1,0 0,9 0,8 0,7 0,25 0,5 1,0 2,0 Soosib OPDIVO-t Ellujäämise tõenäosus 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 OPDIVO Dotsetakseel 0,0 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 Üldelumus (kuudes) Ohus olijate arv OPDIVO 123 98 86 77 73 65 27 13 5 0 Dotsetakseel 123 102 80 61 44 36 13 4 3 0 (129094-002) P03914EE_02/SK00521-2/2016.04 lk 12/17

Joonis 3. Üldelumus mittelamerakulise NSCLC patsiendid, kelle PD-L1 ekspressioon < 1% CA209057 1,0 0,9 0,8 Ellujäämise tõenäosus 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 OPDIVO Dotsetakseel 0,0 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 Üldelumus (kuudes) Ohus olijate arv OPDIVO 108 82 70 60 48 39 26 17 4 0 Dotsetakseel 101 87 69 53 38 30 13 5 2 0 (129094-002) P03914EE_02/SK00521-2/2016.04 lk 13/17

Analüütiline tundlikkus: melanoom Toote PD-L1 IHC 28-8 pharmdx analüütilist tundlikkust katsetati 104 erineva melanoomi juhtumi FFPE proovidega I kuni IV staadiumis. PD-L1 ekspressiooni hindamisel värvus 0 100% positiivsetest kasvajarakkudest värvumisintensiivsusega 0 3. Korduvus: melanoom Toote PD-L1 IHC 28-8 pharmdx korduvust hinnati Dako-siseselt. Enne värvitud koelõikude hindamist need pimendati ja randomiseeriti. Tulemusandmed on esitatud tabelis 7 ja tabelis 8. Sõltumatute paaride võrdluse põhjal määrati iga hinnatud PD-L1 ekspressiooni taseme kohta keskmine negatiivsete tulemuste ühtivusprotsent (NPA), keskmine positiivsete tulemust ühtivusprotsent (PPA) ja üldine ühtivusprotsent (OA). Tabel 7: PD-L1 IHC 28-8 pharmdx korduvus: melanoom Korduvus Seadmetevaheline Analüüsijatevaheline Päevadevaheline Partiidevaheline Värvimistsükli sisene Meetod 16 melanoomiproovi, millel olid erinevad PD-L1 IHK ekspressiooni väärtused, analüüsiti kolmes replikaadis kolme analüüsiseadmega Autostainer Link 48. Kokku saadi 160 võrdluspaari. 16 melanoomiproovi, millel olid erinevad PD-L1 IHK ekspressiooni väärtused, analüüsiti kolmes replikaadis kolme analüüsija poolt ühe analüüsiseadmega Autostainer Link 48. Kokku saadi 240 võrdluspaari. 16 melanoomiproovi, millel olid erinevad PD-L1 IHK ekspressiooni väärtused, analüüsiti kolmes replikaadis viiel mittejärjestikusel päeval ühe analüüsiseadmega Autostainer Link 48. Kokku saadi 160 võrdluspaari. 16 melanoomiproovi, millel olid erinevad PD-L1 IHK ekspressiooni väärtused, analüüsiti kahes replikaadis kolme reaktiivipartiiga ühe analüüsiseadmega Autostainer Link 48. Kokku saadi 640 võrdluspaari. 16 melanoomiproovi, millel olid erinevad PD-L1 IHK ekspressiooni väärtused, analüüsiti kaheksas replikaadis ühes analüüsiseadme Autostainer Link 48 värvimistsüklis. Kokku saadi 160 võrdluspaari. % ühtivus (95% usaldusvahemik) 1% ekspressioonitase 5% ekspressioonitase ANA 89.5 (83,2, 93,6) APA 90,5 (84,8, 94,2) OA 90,0 (86,0, 92,9) ANA 96.4 (92,9, 98,2) APA 96,8 (93,8, 98,4) OA 96,6 (94,5, 97,9) ANA 95.5 (90,3, 97,9) APA 96,8 (93,1, 98,6) OA 96,3 (93,5, 97,9) ANA 98.6 (97,3, 99,3) APA 98,8 (97,8, 99,4) OA 98,7 (98,0, 99,2) ANA 97.1 (92,6, 98,9) APA 97,7 (94,1, 99,1) OA 97,4 (94,9, 98,7) ANA 90.8 (85,7, 94,2) APA 85,5 (77,6, 90,9) OA 88,8 (84,6, 91,9) ANA 91.3 (87,1, 94,2) APA 88,8 (83,4, 92,6) OA 90,2 (87,0, 92,7) ANA 90.0 (84,0, 93,9) APA 90,0 (84,0, 93,9) OA 90,0 (86,0, 92,9) ANA 92.6 (90,6, 94,2) APA 86,6 (83,1, 89,5) OA 90,5 (88,7, 91,9) ANA 93.6 (89,0, 96,4) APA 89,8 (82,7, 94,2) OA 92,2 (88,4, 94,8) Väline korratavus: melanoom Toote PD-L1 IHC 28-8 pharmdx välist korratavust hinnati kolmes välises katselaboris. Enne värvitud koelõikude hindamist need pimendati ja randomiseeriti. Tulemusandmed on esitatud tabelis 8. Sõltumatute paaride võrdluse põhjal määrati iga hinnatud PD-L1 ekspressiooni taseme kohta keskmine negatiivsete tulemuste ühtivusprotsent (NPA), keskmine positiivsete tulemust ühtivusprotsent (PPA) ja üldine ühtivusprotsent (OA). Tabel 8: Toote PD-L1 IHC 28-8 pharmdx korratavus melanoom analüüsimisel kolmes välises laboris % ühtivus (95% usaldusvahemik) Korratavus Meetod 1% ekspressioonitase 5% ekspressioonitase 18 melanoomiproovi, millel olid erinevad PD-L1 IHK Laboritevaheline ANA 99.3 (98,8, 99,7) ANA 93.8 (92,5, 95,1) ekspressiooni tasemed, analüüsiti viiel mittejärjestikusel hindamine (kolm APA 99,3 (98,8, 99,7) APA 92,7 (91,2, 94,2) päeval. Laboritevahelisse hindamisse kaasati kolmest laborit) OA 99,3 (98,7, 99,7) OA 93,3 (91,9, 94,7) laborist kokku 1350 võrreldavat tulemustepaari. Laborisisene hindamine Vaatlejatevaheline (üks vaatleja igas laboris kolmest) Vaatlejasisene (üks vaatleja igas laboris kolmest) 18 melanoomiproovi, millel olid erinevad PD-L1 IHK ekspressiooni tasemed, analüüsiti viiel mittejärjestikusel päeval kolmes laboris. Laborisisesse hindamisse kaasati kolmest laborist kokku 540 võrreldavat tulemustepaari. 30 erinevate PD-L1 IHK ekspressiooni väärtustega melanoomiproovi, mis eelnevalt värviti tootega PD-L1 IHC 28-8 pharmdx, hinnati kolme patoloogi poolt, üks igas uuringulaboris kolmest, kolmel mittejärjestikusel päeval. Vaatlejatevahelisse hindamisse kaasati kolmest laborist kokku 810 sõltumatut võrreldavat tulemustepaari. 30 erinevate PD-L1 IHK ekspressiooni väärtustega melanoomiproovi, mis eelnevalt värviti tootega PD-L1 IHC 28-8 pharmdx, hinnati kolme patoloogi poolt, üks igas uuringulaboris kolmest, kolmel mittejärjestikusel päeval. Vaatlejasisesse hindamisse kaasati kolmest laborist kokku 270 võrreldavat tulemustepaari. ANA 99.3 (98,4, 99,8) APA 99,3 (98,5, 99,8) OA 99,3 (98,5, 99,8) ANA 90.4 (88,1, 92,5) APA 91,7 (89,7, 93,6) OA 91,1 (89,1, 93,1 ) ANA 99.2 (97,9, 100) APA 99,3 (98,2, 100) OA 99,3 (98,1, 100) ANA 97.3 (95,8, 98,5) APA 96,8 (95,1, 98,2) OA 97,0 (95,6, 98,3) ANA 93.2 (91,3, 94,8) APA 91,9 (89,8, 93,9) OA 92,6 (90,7, 94,3) ANA 97.9 (96,1, 99,4) APA 97,6 (95,4, 99,2) OA 97,8 (95,9, 99,3) (129094-002) P03914EE_02/SK00521-2/2016.04 lk 14/17

Toimivuse kliiniline hindamine: melanoom Toodet PD-L1 IHC 28-8 pharmdx hinnati proovidel, mis võeti patsientidelt, kes osalesid kliinilises uuringus CA209067 (3. faasi randomiseeritud topeltpime uuring nivolumaabi monoravi või nivolumaabi ja ipilimumaabi kombinatsioonravi võrdlemiseks ipilimumaabi monoraviga varem ravimata metastaatilise melanoomiga patsientide raviks). Kokku kaasati uuringusse 1296 patsienti 137 uuringukeskuses 21 riigis (Austraalia, Austria, Belgia, Kanada, Tšehhi Vabariik, Taani, Soome, Prantsusmaa, Saksamaa, Iirimaa, Iisrael, Itaalia, Madalmaad, Uus-Meremaa, Norra, Poola, Hispaania, Rootsi, Šveits, Ühendkuningriik ja Ameerika Ühendriigid). Uuringusse kaasatud 1296 patsiendist 945 randomiseeriti ühte kolmest ravirühmast suhtes 1:1:1 ning stratifitseeriti PD-L1 staatuse (kliinilise uuringu analüüsimeetodi põhjal 5%), BRAF-staatuse ja AJCC M staadiumi järgi. Osalejate algseisundi demograafilised ja haigusega seotud omadused olid ravirühmades üldiselt sarnased. Vanuse mediaan oli 60 aastat (vahemik: 18 kuni 90); 40% osalejatest 65 aastat vanad ja 13% osalejatest 75 aastat vanad. Suurem osa patsientidest olid valgest rassist (97%) mehed (65%). Uuringueelsed (baastaseme) kasvajaproovid võeti melanoomiga patsientidelt; neist 86% metastaasidest. 945 randomiseeritud uuringupatsiendist 915 (97%) puhul tehti analüüs tootega PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. 55 (6%) uuringus osaleja puhul takistas PD-L1 ekspressiooni staatuse hindamist melaniin ning 47 (5%) uuringus osaleja puhul ei määratud PD-L1 ekspressiooni staatust nõusoleku tagasivõtmise või puuduvate proovide tõttu. PD-L1 ekspressiooni staatus määrati 843 (89%) osaleja puhul. PD-L1 ekspressiooni tasemetega 1% ja < 1% osalejate osakaal oli ravirühmade lõikes tasakaalustatud. Uuringus CA209067 osalejate PD-L1 ekspressiooni staatused koos testi PD-L1 IHC pharmdx tulemustega on esitatud tabelis 9. Tabel 9: PD-L1 ekspressiooni sagedus kõigi randomiseeritud melanoomiga osalejate hulgas CA209067 Osalejate arv, n (%) nivolumaab nivolumaab + ipilimumaab ipilimumaab Mõõdetava PD-L1 väärtusega 288 278 277 osalejad a PD-L1 ekspressiooni tase: 1% 171 (59,4) 155 (55,8) 164 (59,2) < 1% 117 (40,6) 123 (44,2) 113 (40,8) 5% 80 (27,8) 68 (24,5) 75 (27,1) < 5% 208 (72,2) 210 (75,5) 202 (72,9) a Ainult mõõdetavate PD-L1 tulemuste arv; ei hõlma määramatute PD-L1 tulemuste arvu Nivolumaab ning nivolumaabi-ipilumaabi kombinatsioon andsid kõigis PD-L1 ekspressiooni alamrühmades võrreldes ipilumaabi monoraviga parema PFS-i. Nivolumaabi-ipilumaabi kombinatsioonravi ja nivolumaabi monoravi võrdlus ei olnud uuringu põhieesmärk ja seetõttu ei hõlmanud uuringu metoodika selle erinevuse tuvastamist. Siiski ilmnes madalate PD-L1 ekspressiooni tasemetega osalejate hulgas nivolumaabi-ipilimumaabi rühmas parem PFS kui nivolumaabi rühmas. Kõrgete PD-L1 ekspressiooni tasemetega patsientide hulgas oli PFS nivolumaabi rühmas ning nivolumaabi-ipilumaabi kombinatsioonravi rühmas võrreldav. Mõlema PD-L1 ekspressiooni staatuse definitsiooni (membranoosse ekspressiooniga 1% või 5% kasvajarakkudest) puhul ilmnes nivolumaabi-ipilimumaabi ravirühmas kõrgem ORR kui ipilimumaabi ravirühmas. 1% või 5% kasvajarakkude membranoosse ekspressiooniga osalejatel, keda raviti nivolumaabiga või nivolumaabi-ipilimumaabiga, oli kõrgem ORR kui < 1% või < 5% kasvajarakkude membranoosse ekspressiooniga osalejatel, kes said sama ravi. Ipilimumaabi rühmas olid PD-L1 ekspressiooniga alamrühmade ORR-id võrreldavad sõltumata PD-L1 ekspressiooni definitsioonist (membranoosne ekspressioon 1% või 5% kasvajarakkudest). Lisaks täheldati sõltumata PD-L1 ekspressiooni tasemest nivolumaabi-ipilimumaabi kombinatsioonravi puhul kõrgemat ORR-i kui nivolumaabi monoravi rühmas. Selles uuringus tehtud PD-L1 ekspressiooni analüüside põhjal võib öelda, et nivolumaabi-ipilimumaabi kombinatsioonravi annab võrreldes nivolumaabi monoraviga suurima eelise juhul, kui PD-L1 ekspressioon < 5%. PD-L1 ekspressiooni võib kasutada selliste patsientide hindamiseks, kelle puhul kaalutakse nivolumaabi ja ipilimumaabi kombinatsioonravi või nivolumaabi monoravi kasutamist. Samas tuleb seda teavet käsitleda kogu muu kliinilise teabe kontekstis, kuna kliiniliselt olulisi ravivastuseid täheldati kõigis PD-L1 ekspressiooni alamrühmades. Kõigi PD-L1 ekspressiooni tasemetega ravikavatsusega populatsioonides oli nivolumaabi ja ipilimumaabi kombinatsioonravi efektiivsus võrreldes ipilimumaabi monoraviga kõrgem. Eri PD-L1 ekspressiooni tasemete PFS-i ohusuhted (HR) ja mediaansed PFS-id on esitatud tabelis 10. Tabelis 11 on esitatud uurija hinnatud ORR-id erinevatel PD L1 ekspressiooni tasemetel. (129094-002) P03914EE_02/SK00521-2/2016.04 lk 15/17

Tabel 10: Progresseerumiseta elumus PD-L1 tasemete ja ravirühmade kaupa kõik randomiseeritud melanoomiga osalejad CA209067 Ravi nivolumaab + ipilimumaab nivolumaab ipilimumaab PD-L1 ekspressiooni tase Sündmuste N / Patsientide N Mediaannne PFS kuudes (95% CI) HR võrreldes ipilimumaabiga (95% CI) HR võrreldes nivolumaabi monoraviga (95% CI) 5% 28/68 13,96(9,72, NR) 0,39 (0,25, 0,62) 0,96 (0,58, 1,58) < 5% 103/210 11,24(7,98, NR) 0,42 (0,32, 0,54) 0,70 (0,54, 0,91) 1% 72/155 12,35(8,51, NR) 0,44 (0,32, 0,58) 0,95 (0,69, 1,31) < 1% 59/123 11,17(6,93, NR) 0,38 (0,27, 0,53) 0,56 (0,40, 0,79) 5% 33/80 14,00(9,07, NR) 0,41 (0,26, 0,63) -- < 5% 122/208 5,32(2,83, 7,06) 0,59 (0,47, 0,75) -- 1% 79/171 12,39(8,11, NR) 0,46 (0,34, 0,61) -- < 1% 76/117 2,83(2,76, 5,13) 0,67 (0,49, 0,92) -- 5% 53/75 3,94 (2,79, 4,21) -- -- < 5% 154/202 2,83 (2,76, 3,09) -- -- 1% 122/164 3,91 (2,83, 4,17) -- -- < 1% 85/113 2,79 (2,66, 2,96) -- -- Lühendid: CI = usaldusintervall, NR = ei saavutatud, PFS = progressioonita elumus HR = ravivastuse ohusuhe, mis põhineb Coxi proportsionaalsete ohtude mudelil interaktsioonidega ravi, PD-L1 staatuse ja PD-L1 staatuse põhise ravi vahel Tabel 11: Uurija hinnatud ORR: PD-L1 ekspressiooniga melanoomiga patsiendid mõõdetud PD-L1-ga patsiendid CA209067 PD-L1 Arv, ORR Ravi Ekspressioonitase patsientide % [95% CI] 5% 68 72% (59,9, 82,3) Nivolumaab + < 5% 210 55% (47,8, 61,6) ipilimumaab 1% 155 65% (56,4, 72,0) < 1% 123 52% (42,8, 61,1) 5% 80 58% (45,9, 68,5) Nivolumaab < 5% 208 41% (34,6, 48,4) 1% 171 54% (46,6, 62,0) < 1% 117 33% (24,9, 42,6) 5% 75 21% (12,7, 32,3) Ipilimumaab < 5% 202 18% (12,8, 23,8) 1% 164 19% (13,2, 25,7) < 1% 113 19% (11,9, 27,0) Tabel 12: Tõrkeotsing Probleem Tõenäoline põhjus Soovitatav tegevus 1. Kontroll- või proovialusklaasid ei värvu 1a. Programmeerimisviga. 1a. Veenduge, et alusklaaside programmiks valiti SK005 PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. 1b. Puudub reaktsioon DAB+ substraadi-kromogeeni lahusega (DAB). 1b. Veenduge, et DAB+ substraadi-kromogeeni lahus valmistati õigesti. 1c. Naatriumasiid pesupuhvris. 1c. Kasutage ainult pesupuhvrit Dako Wash Buffer, kood K8007. 1d. Kontroll-alusklaasi degradatsioon. 1d. Kontrollige pakendilt komplekti kõlblikkusaega ja säilitamistingimusi. 2a. Proovialusklaasid värvuvad nõrgalt. 2a. Kasutatud fikseerimismeetod ei sobi. 2a. Kontrollige, et kasutataks ainult ettenähtud fiksatiive ja fikseerimismeetodeid. 2b. Proovialusklaasid värvuvad nõrgalt või Dako tarnitud kontrollalusklaasi 2b. Ebapiisav epitoobi taastamine. 2b. Veenduge, et kolm-ühes-eeltöötlusprotseduur tehti õigesti. positiivne rakuliin värvub nõrgalt. 3. Alusklaaside tugev taustvärvumine. 3a. Parafiin ei ole täielikult eemaldatud. 3a. Veenduge, et kolm-ühes-eeltöötlusprotseduur tehti õigesti. 3b. Alusklaasid kuivasid seadmesse 3b. Kontrollige laadimise ajal ja enne tsükli käivitamist, Autostainer Link 48 laadimise ajal. 3c. Reaktiivide mittespetsiifiline seondumine koelõikudele. et alusklaasid oleksid puhvriga niisutatud. 3c. Kontrollige, et proov oleks õigesti fikseeritud, ja/või nekroosi olemasolu. (129094-002) P03914EE_02/SK00521-2/2016.04 lk 16/17

4. Kude on alusklaasilt eraldunud. 4a. Valede mikroskoobialusklaaside kasutus. 4a. Kasutage mikroskoobialusklaase Dako FLEX IHC Microscope Slides (kood K8020) või laetud alusklaase (näiteks Fisherbrand Superfrost Plus). 4b. Enne värvimist tuleb lõigatud proove hoida 1 tund ahjus temperatuuril 58 ± 2 C. 4b. Proovide mittenõuetekohane ettevalmistus. 5. Liiga tugev spetsiifiline värvumine. 5a. Kasutatud fikseerimismeetod ei sobi. 5a. Kontrollige, et kasutataks ainult ettenähtud fiksatiive ja fikseerimismeetodeid. 5b. Kasutatud on vale pesupuhvrit. 5b. Kasutage ainult pesupuhvrit Dako Wash Buffer, kood K8007. 6. Epitoobi taastamise lahus on 6. Kuumutamisel muutub epitoobi 6. See on normaalne ega mõjuta värvimisprotsessi. kuumutamisel hägune. taastamise lahus häguseks. MÄRKUS. Kui probleemi ei saa liigitada ühegi eelnimetatud põhjuse alla või kui soovitatud tegevus seda ei korrigeeri, võtke edasise abi saamiseks ühendust Dako tehnilise toega. Lisateavet värvimistehnikate ja proovide ettevalmistamise kohta leiate juhendist Dako Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods (15) (saadaval Dakolt). Viited 1. Topalian SL, Drake CG, Pardoll DM. Targeting the PD-1/B7-H1 (PD-L1) pathway to activate anti-tumor immunity. Curr Opin Immunol 2012; 24(2):207-212. 2. Wang C, Thudium KB, Han M, et al. In vitro characterization of the anti-pd-1 antibody nivolumab, BMS-936558, and in vivo toxicology in non-human primates. Cancer Immunol Res 2014; 2(9):846-56. 3. OPDIVO package insert. 4. YERVOY package insert. 5. Borghaei H, Paz-Ares L, Horn L, et al. Nivolumab versus Docetaxel in advanced nonsquamous non-small-cell lung cancer. N Engl J Med 2015; 10.1056/NEJMoa1507643. 6. Phillips T, Simmons P, Inzunza HD, et al. Development of an automated PD-L1 immunohistochemistry (IHC) assay for non-small cell lung cancer. Appl Immuno Molec Morph 2015; 23(8):541-9. 7. Phelps RM, et al. NCI-navy medical oncology branch cell line data base. J. Cell. Biochem. 1996; 63: 32-91. 8. Weber JS, D Angelo SP, Minor D, et al. Nivolumab versus chemotherapy in patients with advanced melanoma who progressed after anti-ctla-4 treatment (CheckMate 037): a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet Oncol 2015; 16: 375 84. 9. Postow M, Chesney J, Pavlick A, et al. Nivolumab and ipilimumab versus ipilimumab in untreated melanoma. N Engl J Med. 2015; 372(21):2006-17. 10. Larkin J, Chiarion-Sileni V, Gonzalez R et al. Combined Nivolumab and Ipilimumab or Monotherapy in Untreated Melanoma. N Engl J Med. 2015; 373(1):23-34. 11. Topalian SL, Hodi FS, Brahmer JR, et. al. Safety, Activity, and Immune Correlates of Anti-PD-1 Antibody in Cancer. New Eng. J. Med. 2012; 366(26):2455-2465. 12. Department of Health, Education and Welfare, National Institutes for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides. DHHS (NIOSH) Publ. No. 78-127, Current 13. August 16, 1976. 13. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline Fourth Edition. CLSI document M29-A4 [ISBN 1-56238-962-9]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 950 West Valley Road, Suite 2500, Wayne, Pennsylvania 19087 1898 USA, 2014. 14. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCCLS). Quality assurance for Design Control and Implementation of Immunohistochemistry Assays; Approved guideline. CLSI document I/LA28-A2; Vol. 31 No. 4 (ISBN 1-56238-745-6) CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087 USA; 2011. 15. Taylor CR and Rudbeck L. Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods. Sixth Edition. Dako, Carpinteria, California; 2013. Versioon 04/16 (129094-002) P03914EE_02/SK00521-2/2016.04 lk 17/17