METSAKAITSE- JA METSAUUENDUSKESKUS MTÜ NATURALIA TÖÖVÕTULEPINGU NR 2-24/TRT-12, 31.MÄRTS 2008 ARUANNE GENEETILISTE MEETODITE KASUTAMINE EESTI HUNDIPOPULATSIOONI DEMOGRAAFILISTES UURINGUTES VASTUTAV TÄITJA: URMAS SAARMA UURING ON FINANTSEERITUD SA KESKKONNAINVESTEERINGUTE KESKUSE POOLT TARTU, 30. MÄRTS 2009
Sissejuhatus Hunt on tippkiskjana oluline nii oma saakloomade arvukuse ühe reguleerijana kui ka vektorina erinevate patogeenide, sealhulgas marutaudi, kärntõve ja mitmete parasiitide levitajana (sealhulgas ehinokokk-paeluss Echinococcus sp.). Lisaks on hundid läbi aegade murdnud kariloomi ja rünnanud ka inimesi, mis on teinud neist inimese silmis kõige kardetuma kiskja paljudes regioonides, sh. ka Eestis. Kuna hunt on oluline liik nii inimese kui ka kodu- ja metsloomade seisukohast, siis on äärmiselt oluline teada, kuidas on hundipopulatsioonid struktureeritud ja kui ulatuslikult toimib geenisiire võimalike alampopulatsioonide vahel ning milline on geenisiirde ulatus. Need teadmised võimaldaksid meil hinnata lähitulevikus näiteks erinevate haigustekitajate, eelkõige marutõve potentsiaalset levikut Venemaalt (kus metsloomade marutõvevastast vaktsineerimist ei toimu) Eestisse ja Lätisse (mõlemad riigid on hetkel juba pea marutõvevabad, kuid loomade ränded Venemaalt võivad siiski tekitada uusi puhanguid). Põhja-Euroopa hundipopulatsiooni struktuur on seni teadmata, st. puudub informatsioon võimalike alampopulatsioonide olemasolu kohta ja geenisiirdest Põhja-Euroopas. Hundipopulatsioon on küllalt põhjalikult uuritud Soomes (Aspi jt. 2006), kuid teised Põhja-Euroopa populatsioonid on analüüsimata või vaid osaliselt analüüsitud (sh. ka Eesti hundid). Oletatakse, et Soome ja Venemaa Karjala osa hundid moodustavad ühtse populatsiooni (Pulliainen 1965, 1980; Boitani 2003), kuid seosed Põhja-Euroopa hundipopulatsioonis tervikuna on tuvastamata. Töö eesmärk Selle uurimuse kaugemaks eesmärgiks on välja selgitada hundipopulatsiooni struktuur Põhja-Euroopas, jaotus alampopulatsioonideks ja geneetilisteks gruppideks ning geenisiirde olemasolu, intensiivsus ja ulatus alampopulatsioonide vahel, kasutades selleks mikrosatelliitanalüüsi. Projekt on planeeritud pikaajalisena ja projekti laiemaks eesmärgiks on välja selgitada: 1) alampopulatsioonide e. geneetiliselt eristuvate gruppide olemasolu ja geenisiire Põhja- Euroopas 2) hundipopulatsiooni sees aja jooksul toimuvad muutused e. dünaamika Põhja-Euroopas Käesoleva projekti konkreetne eemärk oli selgitada hundi geneetiliste gruppide esinemine Eestis ja Lätis. 2
Materjal ja meetodid Hundiproovid Analüüsisime 135 hundilt saadud koeproovi kahest riigist: Eesti (85) ja Läti (50). Proovid on kogutud ajavahemikus 2006-2008. Eesti alalt, mis on suurema proovide hulgaga esindatud, on proove kogutud kõikidest Mandri-Eesti maakondadest, samuti on proovide valimiga kaetud kogu Läti territoorium. Laboratoorsed meetodid Me ananlüüsisime 20 mikrosatelliitlookust: H200, H10, H17, H54, H79, H208, H209, H213, H250, H253, H466, H642, H130, VWF ning CPH2, CPH4, CPH8, C09.173, CPH12 ja CXX22. DNA eraldamine koeproovidest viidi läbi, kasutades Roche i High Pure PCR Template preparation Kit i. Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) segu koosnes järgnevatest komponentidest: 0,25 u Taq polümeraasi (Amplitaq Gold), 1 µl 10 X PCR puhver, 2 mm MgCl 2, 0,2 mm dntp, 3,3 pmol praimereid ning 20 ng DNA-d iga reaktsiooni kohta. PCR i reaktsioonitingimused olid järgnevad: 10 minutit 95 denaturatsiooni, 11 tsüklit 30 s 94 C, 30 s 58 C, 60 s 72 C (ühtlaselt alaneva seondumistemperatuuriga ( 0,5 C tsükli kohta) ning 28 tsüklit 30 s 94 C, 30 s 52 C, 60 s 72 C. Lõplik elongatsioon 10 minutit 72 C. Pärast PCR i segu lahjendati veega (5x lahjendus) ning segati lookused kolme kapillaari (lookused H200, H10, H17, H54, H79, H208, H209, lookused H213, H250, H253, H466, H642, H130, VWF ning lookused CPH2, CPH4, CPH8, C09.173, CPH12 ja CXX22). Kapillaari segati ka lookuste pikkuse identifitseerimiseks 0,25 µl The GeneScan 600 LIZ i. PCR produktid analüüsiti ABI PRISM 3100 sekveneerijal. Alleelipikkused identifitseeriti programmiga Genemapper v4.0. Statistilised meetodid Mikrosatelliitide statistiline analüüs viidi läbi programmiga FSTAT, millega saab välja arvutada, kui mitu alleeli oli iga lookuse kohta esindatud ja kui suur on Eesti ja Läti hundipopulatsiooni geneetiline mitmekesisus e. heterosügootsus. Programmiga BAPS 5.0 arvutati Bayesi statistikal põhinevalt võimalike alampopulatsioonide olemasolu e. hundipopulatsiooni geneetilist differentseerumist. 3
Tulemused Eesti ja Läti hundiproovidel (tabel 1) analüüsiti 20 mikrosatelliitlookuse variatsiooni, mille tulemusena saadi iga hundi jaoks alleelisageduste muster e. geneetiline pass. Saadud alleelijaotuste alusel arvutati välja kui mitu alleeli oli iga lookuse kohta esindatud ja iga lookuse kohta rehkendati ka selle geneetiline mitmekesisus e. heterosügootsus (tabel 2). Suurima alleeliarvuga lookused olid H213, H10, H54 ja H200 ning väikseimatega CXX22 ja CPH2. Kõigi lookuste heterosügootsus oli kõrge (kõrgeks loetakse heterosügootsust >0.7), v.a. lookus H17, CPH12 ja CXX22. Seega osutusid valitud lookused äärmiselt sobivateks ja kõrge heterosügootsuse tase ning suur alleelide arv näitavad ka Eesti ja Läti hundipopulatsioonide suurt geneetilist mitmekesisust, mis on eelduseks elujõulise populatsiooni pikaajaliseks püsimiseks. Populatsiooni diferentseerumise statistiline analüüsi tulemusena selgus, et Eestis ja Lätis on esindatud 5 geneetiliselt diferentseerunud populatsiooni, neist üks oli Eesti (grupp 4, Ida-Virumaalt) ja kaks Läti spetsiifilised (grupp 3 ja grupp 5 Kirde-Lätist) (joonis 1). Siin peab märkima, et tegemist on geneetiliselt diferentseerunud gruppidega, millised võivad omavahel vabalt seguneda. Ülejäänud kaks diferentseerunud geneetilist gruppi olid esindatud nii Eestis kui Lätis. See, et kaks populatsiooni olid esindatud nii Eestis kui Lätis pole üllatav, sest hundid on tuntud kui väga hea rändevõimega loomad, kes on vabalt võimelised rändama (ja paarituma) üle terve Eesti ja Läti. Tulemuste põhjal võib järeldada, et geneetiline grupp nr 1 on levinud kõige laialdasemalt: seda leidub nii Eestis kui ka Lätis, kuid teine mõlema riigi territooriumil esindatud grupp, grupp 2 on levinud peamiselt Eestis (vaid ühe isend Lätis, Eesti lõunapiiril on programm BAPS 5.0 paigutanud samasse geneetilisse gruppi). Väga selget huntide geneetiliste gruppide geograafilist jaotust Eestisiseselt ei eksisteeri, kuid huvi pakuvad geneetilised grupid 2 ja 4, mis on levinud ainult Eestis (grupp 4) või peamiselt Eestis (grupp 2) - nende geograafilise paiknemise alusel võib oletada, et Venemaalt toimub Eesti alale huntide sisseränne. Samas on Eesti (grupp 4) ja Läti (grupp 3 ja 5) spetsiifiliste geneetiliste gruppide olemasolu mõnevõrra üllatav, sest Eesti ja Läti vahel pole mingit geograafilist või selgelt eristuvat ökoloogilist barjääri, mis hundipopulatsioone lahus hoiaks. Grupp 5 tundub olevat vaid Läti-spetsiifiline, siiski on võimalik, et viimase geneetilise grupeeringu näol on tegemist Lätisse kaugemalt sisse rännanud huntide ja nende järeltulijatega (näiteks Venemaalt). Edasised analüüsid, kuhu tuleb lisaks Eesti ja Läti proovide jätkuvale 4
kogumisele ja analüüsimisele kaasata ka hundiproove Venemaalt, peaksid sellele küsimusele selgema vastuse andma. Eesti ja Venemaa huntide omavaheliste geenisiirete edaspidine uurimine oleks erakordselt oluline, seda eriti huntide abil Venemaalt nii Eestisse kui Lätisse levida võivate inimestele ja loomadele eluohtlike haiguste, sh. marutõve, tõttu. Seega tuleks jätkata proovide kogumist nii Eestist, aga kindlasti ka Lätist ja Venemaalt, et saada täpsemat ülevaadet hundigruppide jaotumisest ja omavahelistest suhetest neis riikides. Joonis 1. Erinevate geneetiliste hundigruppide esinemine Eesti ja Lätis. 5
Tabel 1. Analüüsitud huntide päritolu ja geneetiline grupp, kuhu nad kuuluvad (grupid on tähistatud vastavalt Joonis 1 gruppidele ja värvidele); sugu F emane, M isane Hunt nr Riik Kogumiskoht Kogumispaik Kogumisaeg Sugu 1 EST Ida-Virumaa Kuremäe 27.02.2007 F 2 EST Ida-Virumaa Oonurme 23.02.2007 F 3 EST Ida-Virumaa Avinurme 3.12.2007 M 4 EST Jõgevamaa Torma 11.02.2006 M 5 EST Jõgevamaa Laiuse 5.04.2006 M 6 EST Jõgevamaa Pikknurme 4.02.2006 F 7 EST Jõgevamaa Aidu 27.01.2007 M 8 EST Jõgevamaa Metsis 2.12.2006 M 9 EST Jõgevamaa Pikknurme 3.02.2007 M 10 EST Jõgevamaa Torma 3.02.2007 F 11 EST Jõgevamaa Kullavere 10.02.2007 M 12 EST Jõgevamaa Kullavere 22.01.2007 F 13 EST Jõgevamaa Torma 11.02.2007 M 14 EST Jõgevamaa Kullavere 10.01.2007 F 15 EST Jõgevamaa Laiuse 12.01.2008 M 16 EST Jõgevamaa Luua 17.02.2008 F 17 EST Jõgevamaa Palamuse 16.02.2008 M 18 EST Järvamaa Anna 5.08.2006 F 19 EST Järvamaa Imavere 20.10.2006 M 20 EST Järvamaa Anna 5.08.2006 F 21 EST Järvamaa Jäneda 27.01.2007 M 22 EST Järvamaa Kõrvemaa 28.02.2007 M 23 EST Läänemaa Lihula 12.02.2006 M 24 EST Läänemaa Lihula 26.12.2005 25 EST Läänemaa Linnamäe 30.01.2007 M 26 EST Läänemaa Piirsalu 31.01.2007 F 27 EST Läänemaa Linnamäe 24.02.2007 F 28 EST Lääne-Virumaa Anguse 14.02.2006 F 29 EST Põlvamaa Rasina 28.02.2007 F 30 EST Pärnumaa Koonga 4.02.2006 F 6
Hunt nr Riik Kogumiskoht Kogumispaik Kogumisaeg Sugu 31 EST Pärnumaa Nõmme 21.02.2007 M 32 EST Pärnumaa Nõmme 27.02.2007 M (juv) 33 EST Pärnumaa Tahkuranna 17.02.2007 M 34 EST Pärnumaa Kilingi- Nõmme 28.02.2007 F 35 EST Pärnumaa Halinga 10.02.2006 F 36 EST Pärnumaa Nõmme 27.02.2007 M 37 EST Pärnumaa Vändra 22.01.2007 M 38 EST Pärnumaa Nõmme 14.02.2007 M 39 EST Pärnumaa Vändra 22.01.2007 F 40 EST Pärnumaa Seliste 30.01.2007 F 41 EST Pärnumaa Pööravere 3.02.2007 M 42 EST Raplamaa Käru 28.01.2007 F 43 EST Tartumaa Puhja 19.02.2006 F 44 EST Tartumaa Kärevere 15.02.2006 M 45 EST Tartumaa Tammistu 1.02.2007 M 46 EST Tartumaa Alatskivi 29.01.2007 M 47 EST Tartumaa Tammistu 4.02.2007 F 48 EST Tartumaa Alatskivi 20.01.2008 F 49 EST Tartumaa Peipsiääre 18.09.2007 M 50 EST Tartumaa Saadjärve 29.01.2008 F 51 EST Viljandimaa Soomaa RP 2.03.2006 F 52 EST Viljandimaa Nuia 22.01.2007 M 53 EST Võrumaa jaan.06 54 LAT Jekabpils mezr. 4.11.2007 F 55 LAT Jekabpils mezr. 4.11.2006 56 LAT Zagasti F 57 LAT Jekabpils 1.01.2008 F 58 LAT Gludige Alsunga 17.02.2007 F 59 LAT Gludige Alsunga 17.02.2007 F 60 LAT Piltene 22.02.2007 F 61 LAT Kuldiga VM Alsurga 7.10.2006 F 62 LAT Talsu VM Dundaga 8.10.2006 M 63 LAT Ventspils Ancesmežn. 22.01.2006 F 7
Hunt nr Riik Kogumiskoht Kogumispaik Kogumisaeg Sugu 64 LAT Talsi 8.02.2008 F 65 LAT Talsi 8.02.2008 M 66 LAT Gulbene, Litene 10.12.2006 M 67 LAT Gen. Parangs. Valmiera Zunaras mrn. 2.10.2006 F 68 LAT Staicele 15.12.2007 F 69 LAT Gen. Parangs. Anna m. 14.02.2008 F 70 LAT Gen. Parangs. Anna m. 12.02.2008 F 71 EST Ida-Viru Kurtna 8.11.08 M 72 EST Läänemaa Piirsalu 21.11.08 M 73 EST Läänemaa Piirsalu 21.11.08 M 74 EST Läänemaa Kullamaa 5.11.08 F 75 EST Läänemaa Taebla 23.11.08 M 76 LAT 20km Eesti piirist 1.10.2008 F 77 EST I-Viru Kurtna 10.01.2008 F 78 EST I-Viru Avinurme 17.02.2008 M 79 EST I-Viru Kurtna 9.01.2008 F 80 EST Järva Alliku 10.09.2008 M 81 EST Jõgeva Kullavere 17.02.2008 F 82 EST I-Viru Lohusuu 16.02.2008 M 83 EST I-Viru Tammiku 2.12.2007 F 84 EST I-Viru Alajõe 29.12.2007 F 85 EST I-Viru Avinurme 17.02.2008 M 86 EST Pärnu K-Nõmme 2.01.2008 F 87 EST Põlva Rasina 3.02.2008 M 88 EST Lääne Nõva 9.01.2008 F 89 EST Pärnu K-Nõmme 2.01.2008 M 90 EST Pärnu K-Nõmme 8.01.2008 F 91 EST Pärnu K-Nõmme 8.01.2008 M 92 EST Lääne Tuudi 3.02.2008 F 93 EST Rapla Eidapere 23.01.2008 F 94 EST Pärnu Pööravere 14.01.2008 M 95 EST Pärnu Lõpe 27.12.2007 M 8
Hunt nr Riik Kogumiskoht Kogumispaik Kogumisaeg Sugu 96 EST L-Viru Simuna 23.02.2008 97 EST Pärnu Pärnjõe 8.01.2008 M 98 EST Tartu Vahelaane 3.02.2008 M 99 EST Põlva Rasina 11.11.2008 100 EST Lääne Linnamäe 11.11.2008 M 101 EST Pärnu Nõmme 4.02.2007 M 102 EST Pärnu Nõmme 5.02.2007 M 103 EST Tartu Luunja 8.11.2008 M 104 EST Tartu Luunja 8.11.2008 M 105 EST Tartu Luunja 8.11.2008 F 106 LAT Vandžene mežn. 24.10.2008 E 107 LAT Tukuma m. 30.11.2008 E 108 LAT Valdemarpils Gen. Parangs. 27.03.2008 E 109 LAT Nereta Gen. Parangs. 24.07.2008 E 110 LAT Stalte Gen. Parangs. 5.10.2008 E 111 LAT Vandžene mežn. 22.12.2008 E 112 LAT Melnaja praisa 24.10.2008 E 113 LAT Annas m. Gen. Parangs. 21.11.2008 E 114 LAT Sesile 24.12.2008 E 115 LAT Sesile 24.12.2008 E 116 LAT Ugales m. 24.03.2008 I 117 LAT Jekabpils Gen. Parangs. 1.01.2008 E 118 LAT Talsi mežn. Gen. Parangs. 24.03.2008 E 119 LAT Selsile 24.12.2008 E 120 LAT Ugales m. Gen. Parangs. 24.03.2008 E 121 LAT Sesile 25.12.2008 I 122 LAT Piltenes mežn. Gen. Parangs. 26.03.2008 E 123 LAT Nica 3.01.2009 I 124 LAT Parganjas m. Gen. Parangs. 3.08.2008 E 125 LAT Jekabpils Gen. Parangs. 21.12.2008 E 126 LAT Gaunjelgava 20.12.2008 E 127 LAT Nica 3.01.2009 E 128 LAT Preilu Gen. Parangs. 17.12.2008 E 129 LAT Naukšeni Gen. Parangs. 20.12.2008 E 9
Hunt nr Riik Kogumiskoht Kogumispaik Kogumisaeg Sugu 130 LAT Krustpils mežn. Gen. Parangs. 1.11.2008 E 131 LAT Guldiga Gen. Parangs. 9.03.2008 E 132 LAT Ventspils 22.01.2009 I 133 LAT Vecumniki 1.12.2007 E 134 LAT Valdemarpils 27.11.2008 E 135 LAT Jumaras m. Gen. Parangs. 29.11.2008 E Tabel 2 Mikrosatelliitlookuste statistilised parameetrid, mis kirjeldavad: iga lookuse geneetilist mitmekesisust e. heterosügootsust ja alleelide arvu lookuses. Lookuse nimi Heterosügootsus Alleelide arv H10 0.764 19 H642 0.868 18 H17 0.666 17 H250 0.789 13 H200 0.852 18 H466 0.701 12 H130 0.821 12 H208 0.796 12 H54 0.800 19 H20 0.791 11 H79 0.747 17 H213 0.873 24 VWF 0.780 16 H209 0.778 12 CPH2 0.762 8 CPH4 0.811 10 CPH8 0.777 15 C09.17 0.821 11 CPH12 0.625 14 CXX22 0.623 4 10
Kirjandusallikate loetelu Aspi J, Roininen E, Ruokonen M, Kojola I, Vilà C (2006) Genetic diversity, population structure, effective population size and demographic history of the Finnish wolf population. Molecular Ecology 15(6),1561-76. Boitani L (2003) Wolf conservation and recovery. In: Wolves. Behavior, Ecology, and Conservation (eds Mech LD, Boitani L), pp. 317 340. University of Chicago Press, Chicago. Pulliainen E (1965) Studies on the wolves (Canis lupus L.) in Finland. Annales Zoologici Fennici, 2, 215 259. Pulliainen E (1980) The status, structure and behaviour of the wolf (Canis lupus L.) along the Fenno-Soviet border. Annales Zoologici Fennici, 17, 107 112. 11