CE¤

HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) Kood GM333 2. redaktsioon HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) on otsese in situ fluorestsentshübridiseerimisega (FISH) analüüs, mis on mõeldud HER2 geeni amplifikatsiooni kvantitatiivseks määramiseks formaliiniga fikseeritud parafiini sisestatud (FFPE) rinnavähikoe proovidest ning metastaseerunud mao või mao-söögitoru ühenduskoha adenokartsinoomiga patsientide FFPE proovidest. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) on mõeldud täiendama analüüsi HercepTest selliste patsientide seisundi hindamisel, kelle puhul kaalutakse ravi ravimpreparaadiga Herceptin. Viaalis olevast reaktiivist piisab 20 analüüsi tegemiseks. Reaktiiviga HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) koos kasutatavad abireaktiivid: Kood Toote nimetus GM300 ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) GM301 ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) GM302 ISH Pepsin (Dako Omnis) GM303 ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) GM304 Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 1/55

Sisukord Lk Kasutusvaldkond... 3 Meetodi põhimõte rind... 4 Reaktiivid rind... 5 Ettevaatusabinõud rind... 6 Säilitamine rind... 6 Proovi ettevalmistus rind... 7 KASUTUSJUHEND rind... 8 A. Reaktiivi ettevalmistamine rind... 8 B. Värvimisprotseduur rind... 9 Kvaliteedikontroll rind... 11 Värvumise tõlgendamine rind... 11 Piirangud rind... 13 Toote omadused rind... 13 Tõrkeotsing rind... 22 Lisa 1 rind... 24 Lisa 2 rind... 26 Kokkuvõte ja selgitus magu... 27 Meetodi põhimõte magu... 27 Reaktiivid - magu... 28 Ettevaatusabinõud magu... 29 Säilitamine magu... 31 Proovi ettevalmistus magu... 31 KASUTUSJUHEND magu... 32 A. Reaktiivi ettevalmistamine magu... 32 B. Värvimisprotseduur magu... 34 Kvaliteedikontroll magu... 36 Värvumise tõlgendamine magu... 36 Piirangud magu... 38 Toote omadused magu... 38 Tõrkeotsing magu... 47 Lisa 3 magu... 49 Lisa 4 magu... 51 Lisa 5 magu... 52 Viited... 53 Tingmärkide tähendus... 55 (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 2/55

Kasutusvaldkond Kasutuseks in vitro diagnostikas. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) on hübridiseerimissond, mida kasutatakse otsese in situ fluorestsentshübridiseerimisega (FISH) analüüsi teostamiseks analüüsiseadmetes Dako Omnis. Koos abireaktiividega kasutatakse seda HER2 geeni amplifikatsiooni kvantitatiivseks määramiseks formaliiniga fikseeritud parafiini sisestatud (FFPE) rinnavähikoe proovidest ning mao ja mao-söögitoru ühenduskoha adenokartsinoomiga patsientide FFPE proovidest. HER2 IQFISH pharmdx on mõeldud täiendama analüüsi HercepTest selliste patsientide seisundi hindamisel, kellel kaalutakse ravimpreparaadi Herceptin (trastusumaab) kasutust (vt ravimpreparaadi Herceptin pakendi infolehte). Rinnavähiga patsientide puhul on analüüsi HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) tulemused mõeldud kasutamiseks lisaks muule kliinilis-patoloogilise teabele, mida kasutatakse standardselt II staadiumi sõlmpositiivse rinnavähiga patsientide prognoosi määramiseks. Käesolevas dokumendis peetakse maovähi all silmas ka mao-söögitoru ühenduskoha adenokartsinoomi. Rinnavähi puhul rakendamise kohta leiate teavet lk 4 26. Maovähi puhul rakendamise kohta leiate teavet lk 27 52. Oluline! Arvestage rinnavähikoe ja maovähikoe erinevustega, eriti värvitud lõikude tõlgendamisel. (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 3/55

Rinnavähk Kokkuvõte ja selgitus rind Inimese HER2 geen (nimetatakse ka ERBB2 või NEU) paikneb 17. kromosoomis ning kodeerib HER2 valku ehk p185 HER2. HER2 valk on membraaniretseptor türosiinkinaas, mis on homoloogne epidermaalse kasvufaktori retseptoriga (EGFR või HER1) (1-2). Kõigis mittepatoloogilistes diploidsetes rakkudes on HER2 geen kahes eksemplaris. Teatud osal rinnavähiga patsientidest amplifitseerub HER2 geen maliigse transformatsiooni ja kasvaja arenemise käigus (3-8). HER2 geeni amplifikatsiooni tulemuseks on tavaliselt HER2 valgu üleekspresseerumine rinnavähi rakkude pinnal (9). HER2 geeni amplifikatsiooni ja/või vastava valgu üleekspresseerumist on täheldatud 20 25% rinnavähijuhtudest (10). Selline ülesregulatsioon on seostatav halva prognoosi, suurenenud haiguse taastekke riski ja lühema elulemusega. Mitmed uuringud on näidanud, et HER2- positiivsus seostub tundlikkuse või vastupidavusega teatud kemoteraapia ravirežiimidele (11). HER2 valgu tugeva üleekspresseerumise või HER2 geeni amplifikatsiooni tuvastamine on äärmiselt oluline enne ravi alustamist preparaadiga Herceptin, mis on HER2 valgu monoklonaalne antikeha. Kliinilised uuringud on näidanud, et patsiendid, kelle kasvajad üleekspresseerivad HER2 valku oluliselt ja/või amplifitseerivad HER2 geeni, saavad ravimpreparaadist Herceptin kõige rohkem kasu (12). Kõnealune toode (HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)) on IQISH-sondisegu HER2 geeni amplifitseerumise automaatseks otseseks FISH-tuvastamiseks. Seda toodet tuleb kasutada koos määratud abireaktiividega analüüsiseadmes Dako Omnis ning see on tuletatud käsitsi teostatavast HER2 geeni amplifikatsiooni analüüsist, HER2 IQFISH pharmdx, kood K5731. Meetodi põhimõte rind HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) on IQISH-sondisegu, mis koosneb fluorokroomiga Texas Red märgistatud DNA-sondidest, mis katavad 17. kromosoomi 218 kb piirkonna, mis hõlmab HER2 geeni, ning erinevatest fluorestseiiniga märgistatud peptiidnukleiinhappe (PNA) (13) sondidest, mis seonduvad 17. kromosoomi tsentromeerse piirkonnaga (CEN-17). Nende kahe epitoobi spetsiifilise hübridiseerimise tulemusel tekib igal HER2 geenilookusel selgesti eristatav punane fluorestsentssignaal ning igal 17. kromosoomi tsentromeeril selgesti eristatav roheline fluorestsentssignaal. HER2 geeni amplifikatsiooni määramine analüüsiga HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) toimub analüüsiseadmes Dako Omnis täisautomaatse meetodina. Tööjaama Dako Link Omnis Workstation tarkvaras saab valida kolme erineva HER2 FISH-värvimisprotokolli vahel. Need protokollid erinevad ainult pepsiinlõhustamisaja poolest. Valida võib pepsiinlõhustamisaja 10 minutit (protokoll Short (Lühike)), 15 minutit (protokoll Medium (Keskmine)) või 20 minutit (protokoll Long (Pikk)) (lugege lisaks alt). Esialgseks analüüsiks soovitame kasutada protokolli Medium (Keskmine). Pärast analüüsiseadmes Dako Omnis värvimist kinnitatakse proovid reaktiiviga Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis), mis sisaldab 4',6-diamidino-2-fendüülindooli (DAPI), ning kaetakse katteklaasidega. Sobivate filtritega (vt Lisa 2) varustatud fluorestsentsmikroskoobi abil leitakse kasvajarakud ning loendatakse punased (HER2) ja rohelised (CEN-17) signaalid. Seejärel arvutatakse suhtarv HER2/CEN-17. Analüüsitavas koelõigus sisalduvad mittepatoloogilised rakud on kasutatavad analüüsisisese positiivse värvimiskontrollina. Üksikasjad leiate jaotisest Värvumise tõlgendamine. Üksikasjalikud juhised alusklaaside, kaante ISH Lids (Dako Omnis), reaktiivide, abivedelike ning jäätmete seadmesse sisestamise ja seadmest kõrvaldamise kohta leiate vastavatest Dako Omnise kasutusjuhenditest. (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 4/55

Reaktiivid rind HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ja selle abireaktiive võib tellida eraldi üksikute reaktiividena. Rinnavähk Kaasasolevad materjalid HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): 1,6 ml kasutamiseks valmis segu fluorokroomiga Texas Red märgistatud HER2 DNA-sondidest ning fluorestseiiniga märgistatud CEN-17 PNAsondidest, mis tarnitakse IQISH-hübridiseerimispuhvris. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) tarnitakse kuival jääl. Veenduge, et reaktiiv ei oleks transportimise käigus kõrge temperatuuri käes olnud: üleandmisel peab kuivjääd natuke alles olema. Reaktiiviviaale, mille sisu on sulanud, tuleb alati püstises asendis säilitada ja käsitseda. Reaktiiviviaalis on kullaga kaetud metallkuul, mis võimaldab reaktiivi seguris Dako Omnis Mixing Device segada (vt seguri Dako Omnis Mixing Device kasutusjuhendit). Enne analüüsiseadmesse Dako Omnis sisestamist tuleb reaktiivi põhjalikult segada. Vajalikud materjalid, mida ei ole kaasas Abireaktiivid Järgmised reaktiivid peavad analüüsiseadmes Dako Omnis olema, et saaks teostada HER2 geeni amplifikatsiooni analüüsi reaktiiviga HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis): 175 ml 20x kontsentraati tuleb lahjendada vahekorras 1:20 suures 3,5 L Dako Omnise pudelis (kood GC109). Toode sisaldab mikroobidevastast ainet ning inertset rohelist värvainet hõlpsamaks tuvastamiseks ja mugavamaks kasutamiseks. ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis): 14 ml 96% etanooli (kasutamiseks valmis). ISH Pepsin (Dako Omnis): 7 ml pepsiin A lahust (kasutamiseks valmis), ph 2.0; sisaldab stabilisaatorit ja mikroobidevastast ainet. Pepsiin tarnitakse kuivjääl. Veenduge, et reaktiiv ei oleks transportimise käigus kõrge temperatuuri käes olnud: üleandmisel peab kuivjääd natuke alles olema. ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis): 175 ml keedusoola-naatriumtsitraadi puhverlahust, 20x kontsentraat; tuleb lahjendada vahekorras 1:20 Dako Omnise 3,5 L suures pudelis (kood GC109). Toode sisaldab mikroobidevastast ainet, detergenti ning inertset kollast värvainet hõlpsamaks tuvastamiseks ja mugavamaks kasutamiseks. Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis): 0,8 ml fluorestsents-kinnituskeskkonda (kasutamiseks valmis) koos DAPI-ga. Ehkki ülalnimetatud reaktiivid ei ole reaktiivi HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) komplektis, kirjeldatakse neid allolevas tekstis lühidalt. Lisateavet leiate iga vahendi kasutusjuhendist. Abireaktiivid ja -vahendid Dako Omnis, kood GI100 Pesupuhver Wash Buffer (20x) (Dako Omnis), kood GC807 Clearify, kood GC810 Dako Omnis Mixing Device, kood GC116 ISH Lid, kood GC102 ISH Cleaning Solution, kood GC207 Katteklaasid kinnitamiseks (24 mm x 50 mm) Abireaktiivide ja -vahendite kasutamise kohta leiate teavet Dako Omnise põhilistest ja täpsematest kasutusjuhenditest. (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 5/55

Rinnavähk Mikroskoobi tarvikud ja lisatarvikud Fluorestsentsmikroskoobi filtrid: DAPI ja FITC/Texas Red topeltfilter või FITC ja Texas Red monofiltrid üksikasjad leiate lisast 2. Kõrge suurenduse korral halvendab DAPI-filtri kasutamine signaali intensiivsust negatiivselt. Vältida tuleb pikka valgustusaega. Kasutada tuleks 100-vatise elavhõbedalambiga fluorestsentsmikroskoopi. Muude valgusallikate kasutamine nende filtritega pole soovitatav. Mikroskoobi alusklaaside kaust (liigendkaanega või sarnane pappalus 20 alusklaasi jaoks). Ettevaatusabinõud rind 1. Kasutuseks in vitro diagnostikas. 2. Professionaalsetele kasutajatele. 3. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) sisaldab 10-<25% etüleenkarbonaatining ja 3- <5% sodium chloride. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) kannab järgmist märgist: Hoiatus H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Põhjustab tugevat silmade ärritust. Kanda kaitseprille või kaitsemaski. Peske käed põhjalikult pärast käitlemise. SILMA SATTUMISE KORRAL: Loputada mitme minuti jooksul ettevaatlikult veega. Eemaldada kontaktläätsed, kui neid kasutatakse ja kui neid on kerge eemaldada. Loputada veel kord. Üldiselt ei ole alla 18-aastastel lubatud selle ainega töötada. Kasutajaid tuleb põhjalikult juhendada õigete töövõtete, toote ohtlike omaduste ning asjakohaste ohutusjuhiste osas. Vaadake lisateavet kemikaali ohutuskaardilt. 4. Bioloogilisi proove, nii enne kui pärast kinnitamist, ning kõiki nendega kokku puutunud materjale tuleb käsitleda kui võimalikke infektsiooniallikaid ja rakendada lõppkäitlemisel vastavaid ettevaatusabinõusid (14). Ärge kunagi pipeteerige reaktiive suuga. Vältige reaktiivide ja proovimaterjalide kokkupuudet naha ja limaskestadega. Kui reaktiivid puutuvad kokku tundlike piirkondadega, peske suure koguse veega. 5. Minimeerige reaktiivi saastumist mikroobidega, et vältida valesid tulemusi. 6. Ettenähtust erinevad koe fikseerimismeetodid ja proovi paksused võivad mõjutada koe morfoloogiat ja/või signaali intensiivsust. 7. Reaktiiv on optimaalselt lahjendatud. Edasine lahjendamine võib tuua kaasa analüütiliste omaduste halvenemise. 8. Silma ja nahale sattumise vältimiseks tuleb kanda vastavaid kaitsevahendeid. Vaadake lisateavet kemikaali ohutuskaardilt (Safety Data Sheet, SDS). 9. Kasutamata lahus tuleb vastavalt kohalikele, riiklikele ja föderaalsetele nõuetele lõppkäidelda. Säilitamine rind Säilitage reaktiivi HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) < 18 C (soovitatavalt 18 C kuni 25 C) pimedas. Ülessulanud reaktiiviviaali t uleb alati püstises asendis hoida. Reaktiivi omadused säilivad kuni 10-kordsel külmutamisel ja sulatamisel. Ärge jätke seda komponenti toatemperatuurile. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ja selle abireaktiivide ISH pepsin (Dako Omnis) ja Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) omadused võivad soojas hoidmisel muutuda. Ärge jätke neid komponente toatemperatuurile. (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 6/55

Rinnavähk HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ja selle abireaktiivi Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) omadused võivad tugeva valguse mõjul halveneda. Ärge hoidke neid komponente ega teostage analüüsi tugeva valguse, näiteks otsese päikesevalguse käes. Hoidke abireaktiive ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis), ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis), ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) ja Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) pimedas temperatuuril 2 8 C. Hoidke r eaktiivi ISH Pepsin (Dako Omnis) temperatuuril 18 8 C. Viaali kork, s.h suletav ko rk, peab kõigil reaktiividel säilitamise ajal suletud olema. Lahjendatud lahuseid (töölahus ISH Stringent Wash Buffer ning töölahus ISH Pre-Treatment Solution) võib hoida temperatuuril 2 8 C kuni 30 p äeva. Ärge kasutage ühtegi reaktiivi pärast reaktiivianumale märgitud kõlblikkusaja möödumist. Säilitamise ajal peab reaktiivianuma kork, muu hulgas taassuletav kork, suletud olema. Kui reaktiive ei säilitata juhendis toodud tingimustel, peab kasutaja reaktiivi toimivuse üle kontrollima (15). Puuduvad silmaga nähtavad tunnused, mis viitaksid toote ebastabiilsusele. Seetõttu on oluline hinnata analüüsitavas koelõigus mittepatoloogilisi rakke. Kui märkate ootamatut seletamatut fluorestseerumismustrit ning kahtlustate probleemi reaktiiviga HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) või mõnega selle abireaktiividest, pöörduge Dako tehnilise toe poole. Stabiilsus analüüsiseadmes Dako Omnis Reaktiivi HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ning selle abireaktiivide ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) ja ISH Pepsin (Dako Omnis) stabiilsusaeg analüüsiseadmes on 80 tundi. Lahjendatud reaktiivide ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis) ja ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) stabiilsusaeg analüüsiseadmes on 7 päeva. Seadmesisese stabiilsusaja kulumist jälgib Dako Omnise tarkvara. Aegunud reaktiivide kasutamisel annab analüüsiseade Dako Omnis hoiatuse; kõigi aegunud reaktiiviga värvitud alusklaaside olekuks saab kahtlane ning tööjaamal olevas alusklaaside logis märgitakse ära aegunud reaktiivi kasutamine. Proovi ettevalmistus rind Biopsia-, väljalõike- või resektsiooniproove peab käsitlema nii, et kude säiliks FISH-analüüsiks. Kõikidel proovidel tuleb kasutada immunotsütokeemilisele värvimisele eelneva koetöötluse standardmeetodeid (16). Parafiini sisestatud koelõigud Kasutamiseks sobivad ainult neutraalses puhverdatud formaliinis säilitatud ja parafiini sisestatud koed. Proovid tuleb lõigata näiteks kolme või nelja mm paksusteks plokkideks ja fikseerida 18 24 tundi neutraalses puhverdatud formaliinis. Seejärel koed veetustatakse järkjärgulise etanool- ja ksüleentöötlusega, millele järgneb sulatatud parafiiniga immutamine mitte üle 60 C juures. Korralikult fikseeritud ja sisestatud koed säilivad enne lõikamist ja alusklaasidele kinnitamist piiramatu aja vältel, kui neid säilitatakse jahedas kohas (15 25 C) (16-17). Teised fiksaatorid ei sobi. Koeproovid tuleb lõigata 4 6 µm lõikudeks. Kõik HER2 geeni amplifikatsiooni analüüsimiseks ja kasvaja olemasolu kontrollimiseks vajalikud alusklaasid tuleks valmistada ette samal ajal. Soovitatav on kasutada vähemalt kahte järjestikust koelõiku: üks koelõik värvitakse hematoksüliini ja eosiiniga (H&E-värvimine) kasvaja olemasolu tuvastamiseks ning teist kasutatakse HER2 geeni amplifikatsiooni analüüsis. Soovitame kinnitada koelõigud alusklaasidele Dako FLEX IHC Microscope Slides, kood K8020. Sobivad ka alusklaasid Superfrost Plus (Thermo Fischer Scientific, J1800AMNZ). Alusklaaside kõlblikkusaeg ei tohi olla möödunud. Proove tuleb analüüsida 6 kuu jooksul pärast lõikamist, kui neid säilitatakse temperatuuril 2 25 C. Märkus. Koeproovid tuleb asetada alusklaasil määratletud värvimisalale. Alusklaasi värvimisala mõõtmed leiate Dako Omnise põhilisest kasutusjuhendist. (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 7/55

KASUTUSJUHEND rind Rinnavähk A. Reaktiivi ettevalmistamine rind A.1 HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) Reaktiivi HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) viaalis on segamiseks kullaga kaetud metallkuul. Enne viaali laadimist analüüsiseadmesse Dako Omnis tuleb reaktiiv üles sulatada ja põhjalikult segada, kuna külmumisel selle faasid eralduvad. Kasutage sondi segamiseks segurit Dako Omnis Mixing Device. Segage sondi seguris Dako Omnis Mixing Device allolevate juhiste kohaselt. Lisateavet leiate seguri kasutusjuhendist. 1. Võtke reaktiivi HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) viaal külmikust välja. 2. Sisestage viaal segurisse Dako Omnis Mixing Device. 3. Ühendage segur Mixing Device ning veenduge, et roheline olekuindikaator põleb. Valige programm Thaw + mix (Sulata + sega). Oluline! Viaalid, mida hoitakse temperatuuril alla 25 C, tuleb sulatada (vahetult) enne viaali laad imist segurisse Dako Omnis Mixing Device, ning kasutada tuleb programmi Mix (Sega). 4. Eemaldage viaal segurist Mixing Device. 5. Avage suletav kork, keerake see kõrvale ning lukustage vastavasse sälka (lisateavet leiate Dako Omnise põhilisest kasutusjuhendist). 6. Sisestage viaal kohe analüüsiseadme Dako Omnis reaktiivimoodulisse. Kui värvimisprotsessis kasutatakse reaktiivi pideva sisestamise funktsiooni, siis veenduge, et viaali segamisest aspireerimiseni analüüsiseadmes Dako Omnis kulub vähemalt 10 minutit. Sondi HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) võib üles sulatada ja kasutada kuni 10 korda. Segage sondisegu HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) vahetult enne analüüsiseadmesse laadimist. Ärge loksutage. ISH HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) kogu-stabiilsusaeg analüüsiseadme Dako Omnis reaktiivimoodulis on 80 tundi. Seadmesisese stabiilsusaja kulumist jälgib Dako Omnise tarkvara (vt all). HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) tuleb pärast analüüsiseadmest Dako Omnis eemaldamist kohe jahutada temperatuurile < 18 C (soovitatavalt 18 C kuni 25 C). A.2 ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) Valmistage töölahus, lahjendades kontsentreeritud reaktiivi ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) vahekorras 1:20 järgmiselt. 1. Täitke Dako Omnise tähisega PTB (sinine silt) suur 3,5 L pudel täitmiskriipsuni deioniseeritud veega (3,325 L). Enne täitmist asetage suur pudel horisontaalsele pinnale. 2. Tühjendage suurde pudelisse üks kontsentraadi ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) 175 ml pudel. 3. Võtke kontsentraadipudelilt eemaldatav silt maha ning kleepige suurele pudelile. Keerake suure pudeli kaas kinni ning pöörake suurt pudelit 2 3 korda õrnalt ümber. 4. Tuvastage reaktiiv Dako Omnise käeshoitava triipkoodiskanneriga (skannige eemaldatav silt ja suur pudel). 5. Laadige suur pudel kohe analüüsiseadmesse Dako Omnis. Lahjendatud lahust võib analüüsiseadmes Dako Omnis hoida kuni 7 päeva. Seadmesisese stabiilsusaja kulumist jälgib Dako Omnise tarkvara (vt all). Kasutamata lahjendatud lahust võib hoida temperatuuril 2 8 C 30 päeva. Pärast külmas säilitamist tuleb lahjendatud lahus kindlasti ühtlustada temperatuurile vähemalt 18 C, enne kui see analüüsiseadmesse Dako Omnis laaditakse. MÄRKUS. Hävitage lahjendatud lahus, kui see on muutunud häguseks. (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 8/55

Rinnavähk A.3 ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) Valmistage töölahus, lahjendades kontsentreeritud reaktiivi ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) vahekorras 1:20 järgmiselt. 1. Täitke Dako Omnise tähisega PTB (sinine silt) suur 3,5 L pudel täitmiskriipsuni deioniseeritud veega (3,325 L). Enne täitmist asetage suur pudel horisontaalsele pinnale. 2. Tühjendage suurde pudelisse üks kontsetraadi ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) 175 ml pudel. 3. Võtke kontsentraadipudelilt eemaldatav silt maha ning kleepige suurele pudelile. Keerake suure pudeli kaas kinni ning pöörake suurt pudelit 2 3 korda õrnalt ümber. 4. Tuvastage reaktiiv Dako Omnise käeshoitava triipkoodiskanneriga (skannige eemaldatav silt ja seejärel suur pudel). 5. Laadige suur pudel kohe analüüsiseadmesse Dako Omnis. Lahjendatud lahust võib analüüsiseadmes Dako Omnis hoida kuni 7 päeva. Seadmesisese stabiilsusaja kulumist jälgib Dako Omnise tarkvara (vt all). Kasutamata lahjendatud lahust võib hoida temperatuuril 2 8 C kuni 30 päeva. Pärast külmas säilitamist tuleb lahjendatud lahus kindlasti ühtlustada temperatuurile vähemalt 18 C, enne kui see analüüsiseadmesse Dako Omnis laaditakse. MÄRKUS. Hävitage lahjendatud lahus, kui see on muutunud häguseks. A.4 ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) on kasutamisvalmis reaktiiv. Enne analüüsiseadmesse Dako Omnis laadimist avage viaali suletav kork, keerake see kõrvale ning lukustage vastavasse sälka. Reaktiivi ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) kogu-stabiilsusaeg analüüsiseadme Dako Omnis reaktiivimoodulis on 80 tundi. Seadmesisese stabiilsusaja kulumist jälgib Dako Omnise tarkvara (vt all). Pärast töötsükli lõppu võib reaktiivi ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) jahutada säilitamistemperatuurile (2 8 C), et sell e seadmesisest stabiilsusaega säästa. A.5 ISH Pepsin (Dako Omnis) ISH Pepsin (Dako Omnis) on kasutamisvalmis reaktiiv. Enne analüüsiseadmesse Dako Omnis laadimist veenduge, et reaktiiv on sulanud, ning avage suletav kork, keerake see kõrvale ja lukustage vastavasse sälka. Reaktiivi ISH Pepsin (Dako Omnis) kogu-stabiilsusaeg analüüsiseadme Dako Omnis reaktiivimoodulis on 80 tundi. Seadmesisese stabiilsusaja kulumist jälgib Dako Omnise tarkvara (vt all). Pärast töötsükli lõppemist tuleb reaktiiv ISH Pepsin (Dako Omnis) jahutada säilitustemperatuurile 18 8 C, et seadmesisest st abiilsusaega säästa. A.6 Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) on kasutusvalmis kinnituskeskkond, mida kasutatakse väljaspool analüüsiseadet Dako Omnis. Jahutage Fluorescence Mounting Medium kohe pärast kasutamist säilitustemperatuurile (2 8 C). A.7 Täiendavad tarvikud Analüüsiseadmesse Dako Omnis tuleb sisestada ka järgmised tarvikud: deioniseeritud vesi, lahjendatud Wash Buffer 20x (Dako Omnis), kood GC807, Clearify, kood GC810, ISH Cleaning Solution, kood GC207 ja ISH Lid (Dako Omnis), kood GC102, vastavalt Dako Omnise kasutusjuhendi(te)le. B. Värvimisprotseduur rind B.1 Märkused töökorra kohta HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) on hübridiseerimissond, mida kasutatakse otsese in situ hübridiseerimisanalüüsi (FISH) teostamiseks analüüsiseadmes Dako Omnis ning mis on mõeldud (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 9/55

Rinnavähk koos abireaktiividega GM300, GM301, GM302, GM303 ja GM304 (GM304 analüüsiseadme väliselt) HER2 geeni amplifikatsiooni kvantitatiivseks määramiseks. Enne kasutamist peaks kasutaja kõik juhised hoolikalt läbi lugema ning tutvuma kõigi komponentidega ja nendega seotud ohutusnõuetega. Analüüsiseadmes Dako Omnis teostatav automaatne FISH-värvimisprotseduur hõlmab koelõikude deparafineerimist, epitoobi taastamist, pepsiinlõhustamist, hübridiseerimist ja kontsentreeritud pesu. Koelõigud väljastatakse kuivväljastamispesast. Kõik protokolli etapid on Dako Omnise tarkvaras eelprogrammeeritud. Üksikasjalikud juhised alusklaaside, kaante ISH Lids (Dako Omnis), reaktiivide jne seadmesse sisestamise kohta leiate vastavatest Dako Omnise kasutusjuhenditest. Kolm kontrollitud HER2 IQFISH protokolli: HER2 IQFISH Pepsin Short, HER2 IQFISH Pepsin Medium ja HER2 IQFISH Pepsin Long, mis erinevad ainult pepsiinlõhustamise kestuse poolest, on Dako Omnise tarkvarasse programmeeritud, ning neid võib kõigi viie alusklaasirestil oleva alusklaasi jaoks valida. Nii saab kudede lõhustamist optimeerida olenevalt analüüsieelsetest tingimustest. Protokolli HER2 IQFISH Pepsin Medium loetakse standardprotokolliks. Erinevaid värvimisprotokolle saab vaadata tööjaamas Dako Link Omnis Workstation. B.2. Värvimiseelne töökord 1. Valige igale alusklaasile rakendatav HER2 IQFISH protokoll tööjaama Dako Link Omnis Workstation tarkvaras IQFISH-protokollide alt. 2. Printige välja alusklaaside sildid ning kleepige need alusklaasidele. 3. Asetage alusklaasid alusklaasirestile. Üksikasjad leiate Dako Omnise põhilisest kasutusjuhendist. Ühel alusklaasirestil võib olla üks kuni viis alusklaasi. Soovitame ühe HER2 IQFISH värvimistsükliga värvida vähemalt kaks alusklaasi. 4. Sisestage alusklaasirest analüüsiseadmesse Dako Omnis. 5. Laadige kaaned ISH Lid (üks ISH Lid iga alusklaasiresti kohta) analüüsiseadmesse Dako Omnis. 6. Veenduge, et suured vedelikupudelid on analüüsiseadmesse Dako Omnis sisestatud ning selles registreeritud. Suured vedelikupudelid: Clearify (selgendi), lahjendatud ISH Pre- Treatment Solution (Dako Omnis), lahjendatud ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) ja lahjendatud Wash Buffer (Dako Omnis). 7. Sisestage ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) ja ISH Pepsin (Dako Omnis) ning värskelt segatud HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ja ISH Cleaning Solution reaktiivimoodulisse. Veenduge, et kõik suletavad korgid on avatud. 8. Järgige puuteekraanil kuvatavaid juhiseid ning puudutage nuppu Done (Valmis), et värvimisprotseduur käivitada. B.3. Värvimisprotseduur Värvimisprotseduuri HER2 IQFISH analüüsiseadmes Dako Omnis (kokkuvõte tabelis 1) saab jälgida tööjaamas Dako Link Omnis Workstation: (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 10/55

Tabel 1 Lihtsustatud ülevaade värvimisprotokolli HER2 IQFISH etappidest. Etapp Reaktiiv Kestus ja temperatuur Deparafin. Clearify (selgendi) 10 minutit, 38 C Epitoobi taastamine ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis) 15 minutit, 97 C Pesu ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) 2 x 3 minutit, 32 C Lõhustamine* ISH Pepsin (Dako Omnis) 10 minutit, 15 minutit või 20 minutit Kuivatamine 15 minutit, 45 C Denatureerimine 10 minutit, 66 C Hübridiseerimine HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) 75 minutit, 45 C Kontsentreeritud pesu ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) 10 minutit, 61 C * Ülalloetletud HER2 IQFISH protokollide vahel valides saab ühtlasi valida kolme kontrollitud pepsiinlõhustamise kestuse vahel. Rinnavähk Kui lähiajal ei ole vaja rohkem ISH-värvimist teha, jahutage kõik reaktiivid nende ettenähtud säilitamistemperatuuridele. B.4. Värvimisjärgne töökord Väljastage alusklaasid ning kandke alusklaasi värvimisalale 30 µl reaktiivi Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis), mis sisaldab DAPI-d. Reaktiiv Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) peab koelõigu täielikult katma. Paigaldage klaasist katteklaas. MÄRKUS. Alusklaase võib hinnata 15 minutit kuni 7 päeva pärast kinnitamist. Kui alusklaasid on tugeva valguse käes või kõrgel temperatuuril, võib toimuda fluorestsentsi kustumine. Kustumise vähendamiseks hoidke alusklaase pimedas temperatuuril 18 8 C. Kvaliteedikontroll rind 1. Signaalid peavad olema eredad, eristatavad ning lihtsasti hinnatavad. 2. Mittepatoloogiliste rakkude alusel on võimalik teha värvimistsükli sisest kontrolli. Mittepatoloogilised rakud peaksid andma 1 2 selgesti nähtavat rohelist signaali, mis näitab, et CEN-17 PNA-sond on edukalt hübridiseeritud 17. kromosoomi tsentromeersele piirkonnale. Mittepatoloogilistel rakkudel peaks olema ka 1 2 selgest nähtavat punast signaali, mis näitab, et HER2 DNA-sond on edukalt hübridiseeritud HER2 geeni(de)le. Kuna kude on lõikudena, võib mõnedes mittepatoloogilistes rakkudes olla igat värvi signaale vähem kui kaks (diploidsete rakkude puhul oodatav). Kui tervetes rakkudes ei õnnestu signaali tuvastada, on test ebaõnnestunud ja tulemused loetakse valeks. 3. Tuumade morfoloogia peab olema kahjustamata, kui hindamisel kasutada DAPI-filtrit. Mitmed ghost-like rakud ja üldiselt halb tuuma morfoloogia viitab proovi liigsele lõhustamisele, mis annab tulemuseks signaalide kao või fragmentatsiooni. Sellised proovid tuleb lugeda kehtetuteks. 4. Hindamiskõlbulikke kasvajarakke peab olema vähemalt 20. 5. Erinevused koe fikseerimiseks, töötlemiseks ja sisestamiseks kasutatavas laboritehnilises töökorras võivad anda tulemuste kõikuvust, mis tingib vajaduse laborisisesteks kontrollideks. Värvumise tõlgendamine rind Hindamiskõlbulik kude (xx) P02276_001_GM333/2014.07 lk 11/55

Rinnavähk Analüüsida tuleks ainult invasiivse rinnakartsinoomiga patsientide proove. Kui samas proovis on mitteinvasiivne kartsinoom ja invasiivne kartsinoom, tuleb määrata ainult invasiivse komponendi skoor. Hoiduge surevate rakkudega aladest ning aladest, kus tuumakestad on kahtlased. Ärge kaasake tuumi, mis vajavad subjektiivset hinnangut. Jätke vahele tuumad, millel on nõrgad signaalid ja mittespetsiifiline või kõrge tausta värvumine. Signaalide loendamine Leidke kasvaja H&E-värvitud alusklaasilt ning hinnake FISH-värvitud alusklaasil sama ala. Skannige kasvajarakkude mitmeid alasid, et vähendada võimaliku heterogeensuse võimalust. Valige ala, kus on ilus tuumade levik. Alustage analüüsi valitud ala vasakust ülemisest kvadrandist ning, liikudes vasakult paremale, lugege üle signaalid, mis on iga hinnatud tuuma tuumapiirjoontes vastavalt järgnevatele juhistele (vt ka lisa 2). - Fokusseerige üles ja alla, et leida kõik üksikute tuumade signaalid. - Kaks sama suurt signaali, mille kaugus on signaali läbimõõduga võrdne või sellest väiksem, tuleb lugeda üheks signaaliks - Kui tuumade HER2 geeni amplifikatsioon on tugev, võivad HER2 signaalid paikneda väga lähestikku, moodustades signaalide kobara. Neil juhtudel ei saa HER2 signaale täpselt loendada, vaid nende arvu tuleb hinnata. Erilist tähelepanu tuleb pöörata rohelistele signaalidele, sest HER2 signaalide kogumid võivad katta rohelisi signaale ning neid peita. Kui kahtlete, kontrollige rohelisi signaale spetsiifilise FITC-filtriga. Ärge arvestage loendamisel signaalideta tuumi ega ainult ühte värvi signaalidega tuumi. Loendage ainult neid tuumi, kus on mõlemast värvist vähemalt üks FISH-signaal. Signaalide loendamise juhend 1 Mitte arvestada. Tuumad kattuvad, kõik tuuma piirkonnad ei ole näha. 2 Kaks rohelist signaali, ärge arvestage ainult ühte värvi signaaliga tuumi. 3 Arvestage 3 rohelise ja 12 punase signaalina (kogumi hindamine). 4 Arvestage 1 rohelise ja 1 punase signaalina. Kaks sama suurt signaali, mille kaugus on signaali läbimõõduga võrdne või sellest väiksem, tuleb lugeda üheks signaaliks. 5 Ärge arvestage (üle- või alalõhustatud tuumad). või Puuduvad signaalid tuumade keskmetes (sõõrikukujulised tuumad). 6 Arvestage 2 rohelise ja 3 punase signaalina. Kaks sama suurt signaali, mille kaugus on signaali läbimõõduga võrdne või sellest väiksem, tuleb lugeda üheks signaaliks. (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 12/55

Rinnavähk 7 Arvestage 1 rohelise ja 5 punase signaalina. 8 Arvestage 3 rohelise (1 roheline fookusest väljas) ja 3 punase signaalina. 9 Punaste signaalide kogum peidab rohelisi signaale; kontrollige rohelisi signaale spetsiifilise FITC-filtriga või ärge arvestage neid. Kirjendage arvud tabelisse, nagu kirjeldatud lisas 1. Loendage 20 tuuma koeproovi kohta; võimalusel kasvaja eraldiseisvatest osadest (18). Arvutage suhtarv HER2/CEN-17, jagades punaste HER2 signaalide koguarvu roheliste CEN-17 signaalide koguarvuga. Proovid, mille suhtarv HER2/CEN-17 on vähemalt 2, tuleb lugeda HER2 geeni amplifikatsiooniga proovideks (3, 18-20). Tulemusi, mis on otsustuslävel või selle lähedal (1,8 2,2) tuleks tõlgendada ettevaatusega. Kui suhtarv on otsustusläve lähedal (1,8 2,2), loendage veel 20 tuuma ning arvutage suhtarv uuesti 40 tuuma jaoks. Kui kahtlete ikkagi, tuleb proovialusklaas uuesti loendada. Piirjuhtumi korral tuleb konsulteerida patoloogi ja raviarstiga. Piirangud rind 1. Ainult automaatvärvimiseks Dako Omnise analüüsiseadmetes. 2. Kudede valimiseks, fikseerimiseks ja alusklaaside ettevalmistamiseks ning IQFISH-värvumise tõlgendamiseks on vaja eriväljaõpet. Reaktiiviga HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) värvitud proove ei tohi tõlgendada inimesed, kellel on puudulik värvitaju. 3. FISH-tulemused sõltuvad kudede käitlemisest ja töötlemisest enne värvimist. Vale fikseerimine, pesu, kuivatamine, kuumutamine, lõigu lõikamine või saastumine teiste kudede või vedelikega võib mõjutada proovi hübridiseerimist. Vastuolulised tulemused võivad olla tingitud fikseerimise ja sisestamise meetodite variatsioonist või koele omastest anomaaliatest. 4. Analüüsi HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) toimivust ei ole hinnatud mikrokaltsifikatsioonidega rinnavähiproovide puhul. Toote omadused rind Hübridisatsiooni tõhusus Analüüsi HER2 IQFISH pharmdx hübridisatsiooni tõhususe uurimiseks analüüsiti kolmes erinevas uuringukohas 180 formaliiniga fikseeritud parafiini sisestatud koelõiku. Kõik 180 koelõiku õnnestus loendada vastavalt toote loendamisjuhistele. Hübridisatsiooni tõhusus oli 100%. Toote omaduste uuringutes kasutatud suhtarvude HER2/CEN-17 arvutamine põhineb 20 tuuma signaalide loendamisel vastavalt käesoleva kasutusjuhendi jaotises Värvumise tõlgendamine kirjasolevatele hindamisjuhistele. Analüütiline tundlikkus (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 13/55

Rinnavähk Analüüsi HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) analüütilist tundlikkust uuriti 20 erineva rinnavähi koeproovi abil (10 proovi olid HER2 geeni amplifikatsiooniga ning 10 proovi amplifikatsioonita). Koeproovi 20 mittepatoloogilise raku rakutuumade loendamise põhjal arvutati HER2 signaalide arvu ja CEN-17 signaalide arvu suhe. 20 rinnavähi koeproovis tuvastatud normaalsete rakkude suhtarv HER2/CEN-17 oli 0,97 1,11. Analüütiline spetsiifilisus Reaktiivis HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) sisalduvad HER2 DNA sondid on lõppjärjestatud ning kaardistatud, et veenduda kogukatvuses 218 kb, mis hõlmab HER2 geeni. Reaktiivis HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) sisalduvaid CEN-17 PNA sonde on nii ühekaupa kui ka korraga FISH-analüüsitud, et veenduda nende spetsiifilises hübridiseerumises 17. kromosoomi tsentromeersele osale. Et välistada risthübridiseerumine teistele kromosoomidele peale 17. kromosoomi, teostati Dako standardsetele kvaliteedikontrolliprotseduuridele vastavad metafaasiaegsete proovide uuringud. Kokku hinnati 275 hästieristatavate signaalidega metafaasiaegset proovi, et uurida HER2 DNA ja CEN-17 PNA sondisegude hübridiseerumise spetsiifikat. Kõigil 275 juhul oli hübridiseerumine 17. kromosoomi spetsiifiline. Ühelgi 275 proovist ei tuvastatud risthübridiseerumist teiste kromosoomide lookustele. Seega oli sondi spetsiifilisus 100% (275/275). Selleks, et mõõta analüüsi IQFISH võimet tuvastada ainult sihtaineid HER2 ja CEN-17 ilma teiste ainete põhjustatavate häireteta, teostati rinnavähi koeproovidega uuringud, milles kasutatud hübridiseerimissegu ei sisaldanud HER2 ja CEN-17 sonde, vaid ainult hübridiseerimispuhvrit. Kokku hinnati 20 proovi, et tuvastada võimalikke sondiseguga mitteseotud signaale. Ühelgi 20 proovist ei tuvastatud teiste kromosoomilookuste värvumist ega sarnaste ainete põhjustatavaid häireid. Robustsuse uuringud Analüüsi HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) robustsust mõõdeti, varieerides PNA-sondi kontsentratsiooni, epitoobi taastamise kestust, pepsiininkubeerimise kestust, denatureerimise kestust, hübridiseerimise kestust ning kontsentreeritud pesu kestust ja temperatuuri. Varieeruvate parameetritega analüüsiti viite rinnavähi FFPE koeproovi (nende hulgas oli nii amplifikatsiooniga kui ka amplifikatsioonita koeproove). Analüüsid teostati nii standardprotokolli seadetest madalamate kui ka kõrgemate parameetritega. Erandiks olid PNA-sondi kontsentratsioon ja kontsentreeritud pesu temperatuur, mis jäeti mõndade analüüside puhul standardprotokolli seadetele. Analüüsi parameetrid: PNA-sondi kontsentratsioon: analüüsid tasemetel 100% ja +/-17%. Epitoobi taastamise kestus: analüüsid tasemetel 13 min 45 s ja 16 min 15 s. Pepsiininkubeerimise kestus: analüüsid tasemetel 14 min 45 s ja 16 min 15 s. Denatureerimise kestus: analüüsid tasemetel 9 min 45 s ja 10 min 45 s. Hübridiseerimise kestus: analüüsid tasemetel 70 min ja 80 min. Kontsentreeritud pesu kestus: analüüsid tasemetel 8 min 45 s ja 11 min 15 s. Kontsentreeritud pesu temperatuur: analüüsid tasemetel 59 C, 61 C ja 63 C. Kolme erineva PNA-sondi kontsentratsiooniga tehti fraktsioonilise katsekorraldusega (JMP tööriist, SAS) katse, mis hõlmas 12 erinevat värvimisprotokolli, mis on kirjas tabelis 2. (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 14/55

Rinnavähk Tabel 2. Robustsuse uurimiseks kasutatud kaksteist erinevat värvimisprotokolli. Analüüsi parameeter Robustsuse uurimise protokolli nr Epitoobi taastamise kestus (min) Pepsiininkub kestus (min) Denatureerimise kestus (min) Hübridiseerimise kestus (min) Kontsentr. pesu kestus (min) Kontsentr. pesu temp (ºC) PNA konts. sondisegus 1 16,25 16,25 9,75 80 8,75 59 83% 2 13,75 14,75 10,75 70 8,75 59 100% 3 16,25 14,75 9,75 70 8,75 63 100% 4 13,75 14,75 10,75 80 8,75 61 83% 5 13,75 14,75 9,75 80 11,25 59 117% 6 13,75 16,25 10,75 70 11,25 63 83% 7 13,75 16,25 10,75 70 11,25 63 100% 8 16,25 14,75 9,75 70 11,25 61 83% 9 13,75 16,25 9,75 70 8,75 61 117% 10 16,25 16,25 10,75 70 11,25 59 117% 11 16,25 16,25 10,75 80 11,25 61 100% 12 16,25 14,75 10,75 80 8,75 63 117% Kõiki viite koeproovi värviti kõigi 12 protokolliga. Robustsuse uuringu väljundparameetriteks olid signaali intensiivsus ja morfoloogia kvaliteet. Kõik protokollid värvisid kõiki koeproove (kokku 60) erksate, hästi eristuvate ja hõlpsasti loendatavate signaalidega ning andsid seega loendamiseks sobivaid tulemusi. Lisaks uuriti koelõigu paksuse mõju analüüsi HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) tulemustele, varieerides rinnavähi FFPE koeproovide lõigu paksust. Kokku analüüsiti analüüsiga HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) viis järjestikust erineva paksusega (3, 4, 5, 6 ja 7 µm) lõiku viiest inimese rinnavähi proovist. Suhte HER2/CEN-17 keskmine variatsioonikoefitsient oli 5,8% (vahemikus 4,3% kuni 7,1%). Korratavus Laborisisest päevade- ja partiidevahelist korratavust uuriti analüüsiga HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). See uuring korraldati tootjasisese pimeda randomiseeritud uuringuna, mis hõlmas kaheksa erinevate HER2 geeni amplifikatsiooni tasemetega formaliinis fikseeritud parafiini sisestatud rinnavähi koeproovi lõikude HER2/CEN-17 suhete määramist. Neid kaheksat proovi oli analüüsitud analüüsiga HercepTest ning nende hulgas oli kaks proovi HER2 IHK skooriga 0/1+, kaks proovi HER2 IHK skooriga 2+, kaks proovi HER2 IHK skooriga 3+ ja kaks proovi eelnevalt HER2 IQFISH pharmdx (kood K5731) abil määratud FISH-suhtarvuga HER2/CEN-17 vahemikus 1,5 kuni 2,5. Kõik proovid värviti kolme erineva HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) partiiga viiel mittejärjestikusel päeval. Kokku teostati uuringu jooksul 240 koevärvimist, kuna iga kombinatsioon värviti duplikaatidena. Suhtarvude päevade- ja partiidevahelist varieerumist on kujutatud joonisel 1. Andmeid analüüsiti Boxi-Coxi teisendusega, rakendades juhuslike mõjudega mudelit, et saavutada andmete homogeenne dispersioon. Summaarseks hinnanguliseks variatsioonikoefitsiendiks saadi 4,3%. Päevadevaheline ja partiidevaheline variatsioonikoefitsient olid vastavalt 1,5% ja 0%. (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 15/55

Rinnavähk Joonis 1. Suhtarvud HER2/CEN-17, mis saadi analüüsiga HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) teostatud laborisiseses korratavusuuringus, milles uuriti partiidevahelist ja päevadevahelist korratavust. Lisaks uuriti analüüsi HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) päevadevahelist ja laboritevahelist korratavust tootjaväliselt kolme uuringukohta (üks uuringukohta USA-s ja kaks Euroopas) hõlmanud stratifitseeritud pimedas uuringus, milles analüüsiti 12 erineva formaliinis fikseeritud parafiini sisestatud rinnavähi koeproovi lõike. Kolme proovi HER2 IHK skoor oli 0/1+, kolme proovi HER2 IHK skoor oli 2+, kolme proovi HER2 IHK skoor oli 3+ ning kolme proovi suhtarvud HER2/CEN-17 FISH olid 1,5 ja 2,5, määratuna vastavalt analüüsiga HercepTest ja analüüsiga HER2 IQFISH pharmdx (kood K5731). Proovid värviti ja neid analüüsiti uuringukohtades. Igat proovi värviti vähemalt viis korda viiel mittejärjestikusel päeval ning hinnati igas uuringukohas ühe uurija poolt. Kokku värviti ja kaasati statistilisse analüüsi 192 koelõiku. Andmeid analüüsiti Boxi-Coxi teisendusega ning arvutati dispersiooni komponendid. Ülemisel usalduspiiril 95% põhinevaks summaarseks variatsioonikoefitsiendiks oli 15%. Suhtarvu HER2/CEN-17 päevade- ja laboritevahelist varieeruvust on kujutatud joonisel 2. Joonis 2. Teisendamata ühikutes suhtarvude HER2/CEN-17 varieeruvuse diagramm, mis saadi analüüsi HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) päevadevahelise ja laboritevahelise korratavuse uuringus rinnavähi koeproovidega. Analüüsi HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) uurijatevahelist korratavust uuriti ettevõttesiseselt teostatud meetodite võrdlusuuringus, mille käigus hindasid kolm uurijat värvitud proove sõltumatult. Korratavuse uurimiseks analüüsiti 140 erinevat inimese rinnavähi proovi, mille hulgas oli nii HER2 geeni amplifikatsiooniga kui ka amplifikatsioonita proove. Andmeid analüüsiti Boxi-Coxi teisendusega. Keskmine uurijatevaheline variatsioonikoefitsient oli 9%. (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 16/55

Rinnavähk Korduvus Analüüsi HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) laborisisest korduvust uuriti, analüüsides kaheksa inimese rinnavähi koeproovide, mille hulgas oli nii HER2 geeni amplifikatsiooniga kui ka amplifikatsioonita proove, järjestikuseid lõike. Koeproove analüüsiti duplikaatidena viiel mittejärjestikusel päeval, kasutades kokku 240 alusklaasi (120 koelõiku duplikaatidena) analüüsimiseks kolme erinevat partiid. Andmete analüüsimisel kasutatud juhuslike efektide mudel andis tulemuseks päevade ja partiide erinevustega seostatava dispersiooni (kooskõlas tootjasisese korratavusuuringu tulemustega). Ülejäänud dispersioon võrdub paralleelproovide vahelise dispersiooniga ning seega korduvusega. Korduvusega seotud variatsioonikoefitsient 95% usaldusnivool oli 4,4%. Meetodite võrdlusuuringud Analüüsi HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ja analüüsi HER2 IQFISH pharmdx tulemuste võrdlus Analüüsi HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) võrreldi analüüsiga HER2 IQFISH pharmdx (kood K5731) 140 inimese rinnavähi koeproovi hõlmanud võrdlusuuringus. Analüüsiti 77 HER2 amplifikatsioonita proovi ning 63 HER2 amplifikatsiooniga proovi, mille HercepTest -skoorid on kirjas tabelis 3. Tabel 3. Proovide jaotus HercepTest -skoori ning HER2 FISH-skoori (HER2 geeni oleku) järgi, mis saadi analüüsiga HER2 IQFISH pharmdx (kood K5731). HercepTest -värvimise skoor 0 1+ 2+ 3+ Kokku n 27 11 53 49 140 HER2 FISH-olek Amplifikatsiooniga 2 0 13 48 63 Amplifikatsioonita 25 11 40 1 77 FISH-analüüsitud proove kokku 27 11 53 49 140 Tabelis 4 on kujutatud HER2 geeni oleku risttabulatsiooni, mis saadi kahe erineva analüüsiga, arvutades üldise kokkulangevuse protsentarvu (OPA), positiivse kokkulangevuse protsentarvu (PPA) ja negatiivse kokkulangevuse protsentarvu (NPA). Nende kahe analüüsimeetodiga saadud suhtarvude HER2/CEN-17 korrelatsiooni on kujutatud joonisel 3. Tabel 4. Risttabulatsioon HER2 geeni olekutest, mis saadi analüüsidega HER2 IQFISH pharmdx (kood K5731) ja HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Amplifikatsioonita HER2 geeni olek (K5731) Amplifikatsiooniga Kokku HER2 geeni olek (Dako Omnis) Amplifikatsioonita Amplifikatsiooniga 77 0 0 63 77 63 Kokku 77 63 140 OPA: 100% PPA: 100% NPA: 100% (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 17/55

Rinnavähk Joonis 3. Analüüsidega HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ja HER2 IQFISH pharmdx (kood K5731) saadud suhtarvude HER2/CEN-17 korrelatsioon. Analüüsiti 140 rinnavähi koeproovi (regressioonisirge: y = 0,11 + 0,95*x; R 2 = 0,97. Kaalutud dispersiooni pöördväärtusega, et saada regressioonisirge). Suhtarvud HER2/CEN-17 logaritmiti analüüsimiseks. Suhtarvul HER2/CEN-17 = 2 saadi kahe värvimismeetodi keskmise erinevuse 95% usaldusvahemikuks [0,002; 0,031]. See tähendab, et 95% usaldusnivool ei ole oodatav erinevus suurem kui 3%. Ruutkeskmiseks veaks (RMSE), mis näitab keskmise hälbe suurust keskväärtusest, saadi 9%. Analüüsi HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ja analüüsi PathVysion HER-2 DNA Probe Kit tulemuste võrdlus Analüüsi HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) võrreldi analüüsiga PathVysion HER-2 DNA Probe Kit 140 inimese rinnavähi koeproovi hõlmanud võrdlusuuringus. Analüüsiti 80 HER2 amplifikatsioonita proovi ning 80 HER2 amplifikatsiooniga proovi, mille HercepTest -skoorid on kirjas tabelis 5. Tabel 5. Proovide jaotus HercepTest -skoori ning HER2 FISH-skoori (HER2 geeni oleku) järgi, mis saadi analüüsiga HER2 IQFISH pharmdx (kood K5731). HercepTest -värvimise skoor 0 1+ 2+ 3+ Kokku n 28 10 54 48 140 HER2 FISH-olek Amplifikatsiooniga 1 0 12 47 60 Amplifikatsioonita 27 10 42 1 80 FISH-analüüsitud proove kokku 28 10 54 48 140 Tabelis 6 on kujutatud HER2 geeni oleku risttabulatsiooni, mis saadi kahe erineva analüüsiga, arvutades üldise kokkulangevuse protsentarvu (OPA), positiivse kokkulangevuse protsentarvu (PPA) ja negatiivse kokkulangevuse protsentarvu (NPA). Nende kahe analüüsimeetodiga saadud suhtarvude HER2/CEN-17 korrelatsiooni on kujutatud joonisel 4. (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 18/55

Rinnavähk Tabel 6. Risttabulatsioon HER2 geeni olekutest, mis saadi analüüsidega PathVysion HER-2 DNA Probe Kit (kood DNA) ja HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Amplifikatsioonita HER2 geeni olek (PathVysion) Amplifikatsiooniga Kokku HER2 geeni Amplifikatsioonita 80 0 80 olek (Dako Omnis) Amplifikatsiooniga 0 60 60 Kokku 80 60 140 OPA: 100% PPA: 100% NPA: 100% Joonis 4. Analüüsidega HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ja PathVysionsaadud suhtarvude HER2/CEN-17 korrelatsioon. Analüüsiti 140 rinnavähi koeproovi (regressioonisirge: y = 0,01 + 0,98*x; R2 = 0,96. Kaalutud dispersiooni pöördväärtusega, et saada regressioonisirge). Suhtarvud HER2/CEN-17 logaritmiti analüüsimiseks. Suhtarvul HER2/CEN-17 = 2 saadi kahe värvimismeetodi keskmise erinevuse 95% usaldusvahemikuks [0,001; 0,031]. See tähendab, et 95% usaldusnivool ei ole oodatav erinevus suurem kui 3%. Ruutkeskmiseks veaks (RMSE), mis näitab keskmise hälbe suurust keskväärtusest, saadi 10%. Kliiniline kasulikkus patsientide valimisel raviks ravimpreparaadiga Herceptin (trastusumaab) Analüüsi HER2 FISH pharmdx Kit uuriti võrdlusuuringutes analüüsidega PathVysion HER-2 DNA Probe Kit ja Dako HercepTest. Analüüsimeetodiga HER2 FISH tehtud analüüside tulemused on saadaval kokku 940 rinnavähi koeproovi kohta. Analüüsi HER2 FISH pharmdx Kit ja analüüsi PathVysion HER-2 DNA Probe Kit tulemuste võrdlus Analüüsi HER2 FISH pharmdx Kit tulemuste võrdlemiseks analüüsi PathVysion HER-2 DNA Probe Kit tulemustega on korraldatud kolm uuringut (vt tabelit 7). Need uuringud teostati geograafiliselt erinevates asukohtades ning nendes kasutatud proovid ei kattunud. Kokku on analüüsitud 328 proovi. (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 19/55

Tabel 7. FISH-meetodi võrdlusuuringute tulemuste kokkuvõte. Uuringu nimetus Ühilduvus (95% usaldusvahemik) Positiivse kokkulangevuse protsentarv (95% usaldusvahemik) Negatiivse kokkulangevuse protsentarv (95% usaldusvahemik) Ühilduvusuuring (Taani proovid, N = 190) 93,68% (90,22% 97,14%) 86% (77,34% 95,08%) 97% (94,05% 99,89%) Ühilduvusuuring (Jaapani proovid, N = 52) 96,15% * Artiklis sisaldusid võrdlusandmed, kuid HER2 FISH-analüüsi ei olnud ära märgitud. 97% 96% Rinnavähk Ühilduvusuuring (Prantsuse proovid, N = 86) (21)* Taani kliiniliste proovide puhul andsid HER2 FISH pharmdx Kit ja PathVysion HER-2 DNA Probe kokku 12 lahknevat analüüsitulemust (vt tabelit 8). Tabel 8. 12 lahkneva analüüsitulemuse andmete kokkuvõte. HER2 FISH(positiivne)/PathVysion(negatiivne) ID# HER2 FISHsuhtarv 160 2,10* (1,82 2,51) 208 3,61 (2,95 4,73) 306 2,20* (1,79 2,24) 846 2,58 (2,06 3,50) PathVysionsuhtarv 1,51 (1,39 1,68) 1,62 (1,51 1,82) 1,33 (1,18 1,44) 1,51 (1,42 1,76) HercepTestskoor ID# HER2 FISHsuhtarv 2+ 234 1,68 (1,38,83) 2+ 284 1,44 (1,07,83) 1+ 423 1,7 (1,52,95) 2+ 474 1,44 (1,16,83) 735 1,68 (1,40,99) 746 1,05 (0,96,18) 837 1,52 (1,48,79) 881 1,83* (1,15,69) HER2 FISH(negatiivne)/PathVysion(positiivne) * keskmiste log suhtarvude usaldusvahemik hõlmas 2,0. Sulgudes arvud on 95% usaldusvahemik PathVysionsuhtarv 2,02* (1,84 2,29) 2,21* (1,94 2,64) 2,15 (2,02 2,45) 2,55 (2,38 3,26) 2,03* (1,89 2,19) 4,53 (4,27 5,17) 2,15 (2,10 2,67) 2,68 (2,39 3,14) HercepTestskoor 2+ Selles lahknevusanalüüsis kasutati logaritmitud suhtarve. 95% usaldusvahemik arvutati analüüsi PathVysion HER-2 DNA Probe suhtarvude arvutamiseks kasutatud tuumade 60 logaritmitud suhtarvu põhjal. 4 juhust, kui HER2 FISH pharmdx Kit andis positiivse tulemuse ja PathVysion HER-2 DNA Probe andis negatiivse tulemuse, ei sisaldanud ühegi vahemik kriitilist väärtust 2. 8 juhust, kui HER2 FISH pharmdx Kit andis negatiivse tulemuse ja PathVysion HER-2 DNA Probe andis positiivse tulemuse, sisaldas 3 (nr 234, 284 ja 735) 95% usaldusvahemikku kriitilist väärtust 2. Samamoodi arvutati 95% usaldusvahemik analüüsi HER2 FISH pharm Dx Kit suhtarvude arvutamiseks kasutatud tuumade logaritmitud suhtarvude põhjal. 4 juhust, kui HER2 FISH pharmdx Kit andis positiivse tulemuse ja PathVysion HER-2 DNA Probe andis negatiivse tulemuse, 2 (nr 160 ja 306) vahemik sisaldas kriitilist väärtust 2. Kaheksast juhust, kui HER2 FISH pharmdx Kit andis negatiivse tulemuse ja PathVysion HER-2 DNA Probe andis positiivse tulemuse, sisaldas 1 (nr 881) 95% usaldusvahemik kriitilist väärtust 2. Analüüsi HER2 FISH pharmdx Kit tulemuste võrdlus analüüsi HercepTest tulemustega Analüüsi HER2 FISH pharmdx Kit tulemuste võrdlemiseks analüüsi HercepTest tulemustega on teostatud neli uuringut. Kokku on võrreldud 940 proovi, kasutades analüüsi HercepTest puhul IHK positiivse tulemusena värvimise skoori 3+ (vt tabelit 9). 2+ 1+ 2+ 2+ 3+ 3+ 2+ (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 20/55

Rinnavähk Tabel 9. Analüüsi HER2 FISH pharmdx Kit ja IHK-analüüsi (HercepTest ) võrdlusuuringute kokkuvõte. Uuringu nimetus Ühtivus: (95% usaldusvahemik) Positiivse kokkulangevuse protsentarv (95% usaldusvahemik) Negatiivse kokkulangevuse protsentarv (95% usaldusvahemik) Taani kliinilised proovid (N = 682) 93,11% (91,21% 95,01%) 91% (87,39% 94,57%) 94% (92,12% 96,46%) Jaapani proovid (N = 52) Prantsuse uuring (N = 86) (31) Taani pilootuuring (N = 120) (22) 96,15% 87,21% 93,33% 96% 87% 84% 96% 87% 97% Analüüside HercepTest ja HER2 FISH tulemuste jaotus Taani kliiniliste proovide puhul on kirjas tabelis 10. Tabel 10. Analüüsidega HercepTest ja HER2 FISH pharmdx Kit saadud HER2-olekute jaotus. HercepTest -värvimise skoor 0 1+ 2+ 3+ Kokku n 221 267 84 248 820 % 27 33 10 30 100% HER2 FISH-olek Amplifikatsiooniga 0 8 17 222 247 Amplifikatsioonita 106 245 62 22 435 FISH-analüüsitud proove kokku 106 253 79 244 682 (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 21/55

Rinnavähk Tõrkeotsing rind Probleem Tõenäoline põhjus Soovitatav tegevus 1. Signaale pole või nõrgad signaalid 1a. Reaktiivid on tarnimisel või säilitamisel olnud kõrgel temperatuuril 1b. Mikroskoop ei tööta korralikult - Sobimatu filtrikomplekt - Sobimatu valgusallikas - Elavhõbedalamp on liiga vana - Määrdunud ja/või mõranenud kollektorläätsed - Sobimatu immersioonõli 1a. Kontrollige säilitamistingimusi. Kontrollige IQISHsondisegu ja pepsiini saadetiste vastuvõtmisel kuivjää olemasolu. Veenduge, et reaktiive on säilitatud nõuetekohaselt. 1b. Kontrollige mikroskoopi ja veenduge, et kasutatud filtrid on sobilikud kasutamiseks koos sondisegu flurokroomidega ning et elavhõbedalamp on sobiv ja seda pole üle oodatava tööea kasutatud (vt lisa 2). Kahtluse korral võtke ühendust kohaliku mikroskoobitarnijaga. 1c. Kustunud signaalid 1c. Vältige pikaajalist mikroskoopilist uurimist ja minimeerige kokkupuudet tugevate valgusallikatega. 1d. Puhvrid on valesti tuvastatud 1d. Asendage puhverlahused ning tagage uute puhvrite õige registreerimine (tööjaamas) ja tuvastamine (puuteekraanil). Üksikasjad leiate Dako Omnise põhilisest kasutusjuhendist. Tähelepanu! ISH Pre- Treatment Solution on roheline ja ISH Stringent Wash Buffer on kollane. 2. Uuritaval alal pole signaali 2. Kinnitamise ajal on tekkinud õhumullid 2. Vältige õhumulle. Leidmisel koputage need õrnalt pintsette kasutades välja. 3. Liigne taustavärvumus 3a. Koe ebapiisav fikseerimine 3a. Kasutage kindlasti ainult formaliinis fikseeritud parafiini sisestatud koelõike. 3b. Hübridiseeritud lõigu pikaajaline kokkupuude tugeva valgusega 3b. Vältige pikaajalist mikroskoopilist uurimist ja minimeerige kokkupuudet tugeva valgusega. (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 22/55

Probleem Tõenäoline põhjus Soovitatav tegevus 4. Kudede kehv morfoloogia Rinnavähk 4a. Vale pepsiintöötlus. 4a. Valige mõni teine kolmest erinevast värvimisprotokollist. Veenduge, et reaktiivi ISH Pepsin (Dako Omnis) säilitatakse õigel temperatuuril. 4b. Liiga pikaajaline pepsiintöötlus või väga väike lõigu paksus võib põhjustada varirakkude või sõõrikukujuliste rakkude ilmumist. 4b. Proovige kasutada lühema pepsiinlõhustamisajaga värvimisprotokolli. Veenduge, et lõigu paksus on 4 6 µm. 5. Kõrge rohelise autofluorestsentsi tase katteklaasil, k.a alad ilma FFPE koeta 5. Aegunud või mittesoovitatavate alusklaaside kasutamine 5. Valige nõuetekohased alusklaasid. Alusklaaside kõlblikkusaeg ei tohi olla möödunud. MÄRKUS. Kui probleemi ei saa liigitada ühegi eelnimetatud põhjuse alla või soovitatud tegevus seda ei lahenda, võtke edasise abi osas ühendust Dako tehnilise teenindusega. (xx) P02276_001_GM333/2014.07 lk 23/55

Rinnavähk Lisa 1 rind HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), kood GM333 Hindamisskeem Tsükli teostamiskuupäev: Värvimistsükli ID logis: HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) partii: Proovi ID: Tuum nr HER2-skoor (punased) Signaalide arv 20 tuumas CEN-17- skoor (rohelised) Tuum nr 1 11 2 12 3 13 4 14 5 15 6 16 7 17 8 18 9 19 10 20 Kokku (1 10) Kokku (11 20) HER2- skoor (punased) CEN-17- skoor (rohelised) Suhtarvu HER2/CEN-17 määramiseks loendage HER2 signaalid ning CEN-17 signaalid samas 20 tuumas ning jagage HER2 signaalide koguarv CEN-17 signaalide koguarvuga. Kui suhtarv HER2/CEN-17 on otsustusläve lähedal (1,8 2,2), loendage veel 20 tuuma ning arvutage suhtarv uuesti 40 tuuma jaoks. Kui suhtarv on otsustuslävel või selle lähedal (1,8 2,2), tuleb seda ettevaatlikult tõlgendada (vt lugemisjuhendit). Koguskoor (1 20) HER2 CEN-17 Suhtarv HER2/CEN-17 (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 24/55

Rinnavähk Signaalide arv 20 täiendavas tuumas Tuum nr HER2-skoor (punased) CEN-17- skoor (rohelised) Tuum nr 21 31 22 32 23 33 24 34 25 35 26 36 27 37 28 38 29 39 30 40 Kokku (21 30) Kokku (31 40) HER2- skoor (punased) CEN-17- skoor (rohelised) Arvutage suhtarv HER2/CEN-17 40 loendatud tuuma põhjal HER2 CEN-17 Suhtarv HER2/CEN-17 Koguskoor (1 40) Suhtarv < 2: HER2 geeni amplifikatsiooni ei täheldatud Suhtarv 2: HER2 geeni amplifikatsiooni täheldati Kuupäev ja allkiri, laborant: Kuupäev ja allkiri, patoloog: Hindamisjuhised: vt Värvumise tõlgendamine. (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 25/55

Rinnavähk Lisa 2 rind HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), kood GM333 Fluorestsentsmikroskoobi tehnilised andmed Dako soovitab kasutada analüüsis HER2 IQFISH pharmdx, (Dako Omnis), GM333 järgmisi seadmeid. 1. Mikroskoobitüüp Epifluorestsentsmikroskoop 2. Valgusallikas 100-vatine elavhõbedalamp (pidage valgustamisaja üle arvet) 3. Objektiivid Kudede esmaseks vaatlemiseks sobivad 16X või 20X objektiivid Võimsama suurenduse saavutamiseks, näiteks signaalide loendamiseks, soovitame kasutada ainult õliimersioonobjektiive, nt 100X. 4. Filtrid Filtrid on kujundatud individuaalselt spetsiifiliste fluorokroomide jaoks ja peavad olema vastavalt valitud. Dako soovitab kasutada spetsiifilist DAPI-filtrit koos kvaliteetse Texas Red/FITC topeltfiltriga. DAPI-filter, näiteks Chroma filter nr 31000 Texas Red/FITC topeltfilter, nt Omega Optical filter nr XF53 või Chroma filter nr 51006 Texas Red ja FITC monofiltreid võib kasutada kontrollimiseks ja loendamiseks Fluorokroom Ergastav lainepikkus Kiiratav lainepikkus FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Filtrid on spetsiifilised iga mikroskoobitüübi jaoks ja sobivate filtrite kasutamine on tõlgendamise jaoks oluline. Täpsemat teavet saate oma mikroskoobitarnijalt või Dako esindajalt. 5. Õli Mittefluorestseeruv õli Ettevaatusabinõud 50-vatise elavhõbedalambi kasutamine ei ole soovitatav Rodamiinfiltreid ei saa kasutada Kolmekordsete filtrite kasutamine ei ole soovitatav Optimeerimata mikroskoop võib põhjustada probleeme fluorestsentsisignaalide lugemisel. On oluline, et valgusallikas pole ületanud kõlblikkusaega ning et see on õigesti joondatud ja fokusseeritud. Kliendid peaksid jälgima ja järgima elavhõbedalambi tootja soovitusi. Mikroskoopi tuleb nõuetekohaselt hooldada ning enne tulemuste tõlgendamist tuleb veenduda, et elavhõbedalamp on õigesti joondatud. Hoidmaks ära fluorestsentsi kustumist, tuleks püüda proovi eksponeerida ergastavale valgusele nii vähe kui võimalik. Enne in situ fluorestsentshübridiseerimise alustamist soovitame teil konsulteerida mikroskoobikoostu sobivuse osas tootjaga või lugeda vastavat kirjandust. (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 26/55

Maovähk Kokkuvõte ja selgitus magu Inimese HER2 geen (nimetatakse ka ERBB2 või NEU) paikneb 17. kromosoomis ning kodeerib HER2 valku ehk p185 HER2. HER2 valk on membraaniretseptor türosiinkinaas, mis on homoloogne epidermaalse kasvufaktori retseptoriga (EGFR või HER1) (1-2). Kõigis mittepatoloogilistes diploidsetes rakkudes on HER2 geen kahes eksemplaris. Paljudes uuringutes (ülevaade viites (23)) on näidatud HER2 valgu üleekspressiooni ja HER2 geeni amplifikatsiooni maovähi puhul. HER2-positiivsus tuvastatakse ligikaudu 20% patsientidest kas IHK- või FISH-analüüsis (23). Eelkliinilised in vitro ja in vivo uuringud on näidanud, et trastusumaab (Herceptin ) on efektiivne erinevates maovähi mudelites, mis andis aluse mitmete kliiniliste uuringute korraldamiseks (23-27). Kõik III faasi uuringus BO18255 (ToGA An open-label, randomized, multicenter, phase III study of traustuzumab in combination with a fluoropyrimidine and cisplatin versus chemotherapy alone as first-line therapy in patients with HER2 positive advanced gastric cancer ), mida sponsoreeris Hoffmann-La Roche AG, osalenud patsiendid valiti analüüsidega Dako HercepTest (IHK) ja Dako HER2 FISH pharmdx Kit (FISH), kusjuures HER2-positiivsuse määramise tingimuseks oli IHK 3+ või FISH+ (HER2/CEN-17 2,0). See uuring näitas nii analüüsi HercepTest (IHK) kui ka analüüsi HER2 FISH pharmdx Kit (FISH) sobivust selliste kaugelearenenud mao või mao-söögitoru ühenduskoha adenokartsinoomiga patsientide HER2-oleku määramiseks, kelle puhul kaalutakse ravi trastusumaabiga (28). Uuringusse ei kaasatud selliseid patsiente, kelle kasvajad ei olnud küll geeniamplifikatsiooniga, kuid üleekspresseerisid HER2 valku nõrgalt kuni tugevalt [FISH(-)/IHK 2+]. Seega ei ole teada, kas ravist Herceptin -iga saaksid kasu ka patsiendid, kelle kasvaja ei ole geeniamplifikatsiooniga, kuid üleekspresseerib HER2 valku [st FISH(-), IHK 2+ või 3+]. Lisaks näitas see uuring, et geeniamplifikatsioon (FISH) ja valgu üleekspressioon (IHK) ei ole omavahel sama tugevas korrelatsioonis nagu rinnavähiga, mistõttu HER2 olekut ei tohiks määrata ainult ühe meetodi põhjal. Kõnealune toode (HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis)) on IQISH-sondisegu HER2 geeni amplifikatsiooni automaatseks otseseks FISH-tuvastamiseks. Seda toodet tuleb kasutada koos määratud abireaktiividega analüüsiseadmes Dako Omnis ning see on tuletatud käsitsi teostatavast HER2 geeni amplifikatsiooni analüüsist, HER2 IQFISH pharmdx, kood K5731. Meetodi põhimõte magu HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) on IQISH-sond, mis koosneb fluorokroomiga Texas Red märgistatud DNA-sondidest, mis katavad 17. kromosoomi 218 kb piirkonna, mis hõlmab HER2 geeni, ning erinevatest fluorestseiiniga märgistatud peptiidnukleiinhappe (PNA) (13) sondidest, mis seonduvad 17. kromosoomi tsentromeerse piirkonnaga (CEN-17). Nende kahe epitoobi spetsiifilise hübridiseerimise tulemusel tekib igal HER2 geenilookusel selgesti eristatav punane fluorestsentssignaal ning igal 17. kromosoomi tsentromeeril selgesti eristatav roheline fluorestsentssignaal. HER2 geeni amplifikatsiooni määramine analüüsiga HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) toimub analüüsiseadmes Dako Omnis täisautomaatse meetodina. Tööjaama Dako Link Omnis Workstation tarkvaras saab valida kolme erineva HER2 FISH-värvimisprotokolli vahel. Need protokollid erinevad ainult pepsiinlõhustamisaja poolest. Valida võib pepsiinlõhustamisaja 10 min (protokoll Short (Lühike)), 15 min (protokoll Medium (Keskmine)) või 20 min (protokoll Long (Pikk)) (lugege lisaks alt). Esialgseks analüüsiks soovitame kasutada protokolli Medium (Keskmine). Pärast analüüsiseadmes Dako Omnis värvimist kinnitatakse proovid reaktiiviga Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis), mis sisaldab 4',6-diamidino-2-fendüülindooli (DAPI), ning kaetakse katteklaasidega. Sobivate filtritega (vt Lisa 5) varustatud fluorestsentsmikroskoobi abil leitakse kasvajarakud ning loendatakse punased (HER2) ja rohelised (CEN-17) signaalid. (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 27/55

Seejärel arvutatakse suhtarv HER2/CEN-17. Analüüsitava koelõigu mittepatoloogilisi rakke kasutatakse eeltöötluse ja hübridisatsiooni tõhususe sisemiseks positiivseks kontrolliks. Üksikasjad leiate jaotisest Värvumise tõlgendamine. Maovähk Üksikasjalikud juhised alusklaaside, kaante ISH Lids (Dako Omnis), kood GC102, reaktiivide, abivedelike ning jäätmete seadmesse sisestamise ja seadmest kõrvaldamise kohta leiate vastavatest Dako Omnise kasutusjuhenditest. Reaktiivid - magu HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ja selle abireaktiive võib tellida eraldi üksikute reaktiividena. Kaasasolevad materjalid HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): 1,6 ml kasutamiseks valmis segu fluorokroomiga Texas Red märgistatud HER2 DNA-sondidest ning fluorestseiiniga märgistatud CEN-17 PNAsondidest, mis tarnitakse IQISH-hübridiseerimispuhvris. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) tarnitakse kuival jääl. Veenduge, et reaktiiv ei oleks transportimise käigus kõrge temperatuuri käes olnud: üleandmisel peab kuivjääd natuke alles olema. Reaktiiviviaale, mille sisu on sulanud, tuleb alati püstises asendis säilitada ja käsitseda. Reaktiiviviaalis on kullaga kaetud metallkuul, mis võimaldab reaktiivi seguris Dako Omnis Mixing Device segada (vt seguri Dako Omnis Mixing Device kasutusjuhendit). Enne analüüsiseadmesse Dako Omnis sisestamist tuleb reaktiivi põhjalikult segada. Vajalikud materjalid, mida ei ole kaasas Abireaktiivid Järgmised reaktiivid peavad analüüsiseadmes Dako Omnis olema, et saaks teostada HER2 geeni amplifikatsiooni analüüsi reaktiiviga HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis): ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis): 175 ml 20x kontsentraati tuleb lahjendada suures 3,5 L Dako Omnise pudelis (kood GC109). Toode sisaldab mikroobidevastast ainet ning inertset rohelist värvainet hõlpsamaks tuvastamiseks ja mugavamaks kasutamiseks. ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis): 14 ml 96% etanooli (kasutamiseks valmis). ISH Pepsin (Dako Omnis): 7 ml pepsiin A lahust (kasutamiseks valmis), ph 2.0; sisaldab stabilisaatorit ja mikroobidevastast ainet. Pepsiin tarnitakse kuivjääl. Veenduge, et reaktiiv ei oleks transportimise käigus kõrge temperatuuri käes olnud: üleandmisel peab kuivjääd natuke alles olema. ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis): 175 ml keedusoola-naatriumtsitraadi puhverlahust, 20x kontsentraat; tuleb lahjendada vahekorras 1:20 Dako Omnise 3,5 L suures pudelis (CG109). Toode sisaldab mikroobidevastast ainet, detergenti ning inertset kollast värvainet hõlpsamaks tuvastamiseks ja mugavamaks kasutamiseks. Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis): 0,8 ml fluorestsents-kinnituskeskkonda (kasutamiseks valmis) koos DAPI-ga. Ehkki ülalnimetatud reaktiivid ei ole reaktiivi HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) komplektis, kirjeldatakse neid allolevas tekstis lühidalt. Lisateavet leiate iga vahendi kasutusjuhendist. Abireaktiivid ja -vahendid Dako Omnis, kood Gl100 Pesupuhver Wash Buffer (20x) (Dako Omnis), kood GC807 Clearify TM, kood GC810 Dako Omnis Mixing Device, kood GC116 ISH Lid, kood GC102 (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 28/55

ISH Cleaning Solution, kood GC207 Katteklaasid kinnitamiseks (24 mm x 50 mm) Abireaktiivide ja -vahendite kasutamise kohta leiate teavet Dako Omnise põhilistest ja täpsematest kasutusjuhenditest. Maovähk Mikroskoobi tarvikud ja lisatarvikud Filtrid fluorestsentsmikroskoobile: DAPI ja FITC/Texas Red topeltfilter, või FITC ja Texas Red monofiltrid üksikasjad leiate lisast 5. Kõrge suurenduse korral halvendab DAPI-filtri kasutamine signaali intensiivsust negatiivselt. Vältida tuleb pikka valgustusaega. Kasutada tuleks 100-vatise elavhõbedalambiga fluorestsentsmikroskoopi. Muude valgusallikate kasutamine nende filtritega pole soovitatav. Mikroskoobi alusklaaside kaust (liigendkaanega või sarnane pappalus 20 alusklaasi jaoks) Ettevaatusabinõud magu 1. Kasutuseks in vitro diagnostikas. 2. Professionaalsetele kasutajatele. 3. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) sisaldab 10-<25% etüleenkarbonaatining ja 3- <5% sodium chloride. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) kannab järgmist märgist: Hoiatus H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Põhjustab tugevat silmade ärritust. Kanda kaitseprille või kaitsemaski. Peske käed põhjalikult pärast käitlemise. SILMA SATTUMISE KORRAL: Loputada mitme minuti jooksul ettevaatlikult veega. Eemaldada kontaktläätsed, kui neid kasutatakse ja kui neid on kerge eemaldada. Loputada veel kord. Üldiselt ei ole alla 18-aastastel lubatud selle ainega töötada. Kasutajaid tuleb põhjalikult juhendada õigete töövõtete, toote ohtlike omaduste ning asjakohaste ohutusjuhiste osas. Vaadake lisateavet kemikaali ohutuskaardilt. 4. Bioloogilisi proove, nii enne kui pärast kinnitamist, ning kõiki nendega kokku puutunud materjale tuleb käsitleda kui võimalikke infektsiooniallikaid ja rakendada lõppkäitlemisel vastavaid ettevaatusabinõusid (14). Ärge kunagi pipeteerige reaktiive suuga. Vältige reaktiivide ja proovimaterjalide kokkupuudet naha ja limaskestadega. Kui reaktiivid puutuvad kokku tundlike piirkondadega, peske suure koguse veega. 5. Minimeerige reaktiivi saastumist mikroobidega, et vältida valesid tulemusi. 6. Ettenähtust erinevad koe fikseerimismeetodid ja proovi paksused võivad mõjutada koe morfoloogiat ja/või signaali intensiivsust. 7. Reaktiiv on optimaalselt lahjendatud. Edasine lahjendamine võib tuua kaasa analüütiliste omaduste halvenemise. 8. Silma ja nahale sattumise vältimiseks tuleb kanda vastavaid kaitsevahendeid. Lisateavet lugege kemikaali ohutuskaardilt (SDS). 9. Kasutamata lahus tuleb vastavalt kohalikele, riiklikele ja föderaalsetele nõuetele lõppkäidelda. 10. Maovähi proovide heterogeensuse tõttu on oluline enne signaalide loendamiseks kasutatava ala valimist kogu proovi põhjalikult skannida, et signaalide jaotust hinnata. 11. Me ei soovita hinnata väga väikesi proove (st proovide morfoloogia peab olema terve ning nad peavad sisaldama loendamiseks piisavalt tuumasid). (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 29/55

Maovähk 12. Kui HER2 FISH-analüüsi teostatakse biopsiaprooviga, tuleb analüüsida mitut (7 8) hindamiskõlbulikku biopsiaproovi erinevatest kasvaja piirkondadest, et tagada kasvaja HER2-oleku kindel määramine. 13. Kõikide biopsiaproovis olevate koesüdamike tuvastamiseks on oluline H&E-värvitud alusklaasi vaadelda. 14. HER2 geeni amplifikatsioon ja HER2 valgu üleekspresseerumine ei ole maovähi puhul sama tugevas korrelatsioonis nagu rinnavähi puhul; seetõttu ei tohi HER2-oleku määramiseks kasutada ainult ühte meetodit. (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 30/55

Maovähk Säilitamine magu Säilitage reaktiivi HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) < 18 C (soovitatavalt 18 C kuni 25 C) pimedas. Ülessulanud reaktiiviviaali t uleb alati püstises asendis hoida. Reaktiivi omadused säilivad kuni 10-kordsel külmutamisel ja sulatamisel. Ärge jätke seda komponenti toatemperatuurile. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ja selle abireaktiivide ISH Pepsin (Dako Omnis) ja Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) omadused võivad soojuse mõjul halveneda. Ärge jätke neid komponente toatemperatuurile. HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ja selle abireaktiivi Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) omadused võivad tugeva valguse mõjul halveneda. Ärge hoidke neid komponente ega teostage analüüsi tugeva valguse, näiteks otsese päikesevalguse käes. Hoidke abireaktiive ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis), ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis), ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) ja Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) pimedas temperatuuril 2 8 C. Hoidke r eaktiivi ISH Pepsin (Dako Omnis) temperatuuril 18 8 C. Viaali kork, s.h suletav ko rk, peab kõigil reaktiividel säilitamise ajal suletud olema. Lahjendatud lahuseid (töölahus ISH Stringent Wash Buffer ning töölahus ISH Pre-Treatment Solution) võib hoida temperatuuril 2 8 C kuni 30 p äeva. Ärge kasutage reaktiive pärast reaktiivianumale märgitud kõlblikkusaja möödumist. Säilitamise ajal peab reaktiivianuma kork, muu hulgas taassuletav kork, suletud olema. Kui reaktiive ei säilitata juhendis toodud tingimustel, peab kasutaja reaktiivi toimivuse üle kontrollima (15). Puuduvad silmaga nähtavad tunnused, mis viitaksid toote ebastabiilsusele. Seetõttu on oluline hinnata analüüsitavas koelõigus mittepatoloogilisi rakke. Kui märkate ootamatut seletamatut fluorestseerumismustrit ning kahtlustate probleemi reaktiiviga HER2 IQFISH pharmdx, pöörduge Dako tehnilise abiteenistuse poole. Stabiilsus analüüsiseadmes Dako Omnis Reaktiivi HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ning selle abireaktiivide ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) ja ISH Pepsin (Dako Omnis) stabiilsusaeg analüüsiseadmes on 80 tundi. Lahjendatud reaktiivide ISH Pre-Treatment Solution (Dako Omnis) ja ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) stabiilsusaeg analüüsiseadmes on 7 päeva. Seadmesisese stabiilsusaja kulumist jälgib Dako Omnise tarkvara. Aegunud reaktiivide kasutamisel annab analüüsiseade Dako Omnis hoiatuse; kõigi aegunud reaktiiviga värvitud alusklaaside olekuks saab kahtlane ning tööjaamal olevas alusklaaside logis märgitakse ära aegunud reaktiivi kasutamine. Proovi ettevalmistus magu Mao või mao-söögitoru ühinemiskoha adenokartsinoomi biopsia-, väljalõike- ja resektsiooniproove tuleb käidelda nii, et proovi omadused FISH-analüüsi jaoks säiliksid. Kõikidel proovidel kasutada tuleb kasutada immunohistokeemilisele värvimisele eelneva koetöötluse standardmeetodeid (16). Väikeste biopsiaproovide analüüsimisel veenduge, et kasvaja morfoloogia on intaktne ning et loendamiseks on piisavalt rakutuumi. Kui HER2 FISH-analüüsi teostatakse biopsiaprooviga, tuleb analüüsida mitut (7 8) hindamiskõlbulikku biopsiaproovi erinevatest kasvaja piirkondadest, et tagada kasvaja HER2-oleku kindel määramine. (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 31/55

Maovähk Parafiini sisestatud koelõigud Kasutamiseks sobivad ainult neutraalses puhverdatud formaliinis säilitatud ja parafiini sisestatud koed. Proovid tuleb lõigata näiteks kolme või nelja mm paksusteks plokkideks ja fikseerida 18 24 tundi neutraalses puhverdatud formaliinis. Biopsiaproove fikseeriti 6 8 tundi ToGA uuringus (uuringu viidet vt (28)). Seejärel koed veetustatakse järkjärgulise etanool- ja ksüleentöötlusega, millele järgneb sulatatud parafiiniga immutamine mitte üle 60 C juures. Korralikult fikseeritud ja sisestatud koed säilivad enne lõikamist ja alusklaasidele kinnitamist piiramatu aja vältel, kui neid säilitatakse jahedas kohas (15 25 C) (16-17). Teised fiksaatorid ei sobi. Koeproovid tuleb lõigata 3 6 µm lõikudeks. Kõik HER2 geeni amplifikatsiooni analüüsimiseks ja kasvaja olemasolu kontrollimiseks vajalikud alusklaasid tuleks valmistada ette samal ajal. Soovitatav on kasutada vähemalt kahte järjestikust koelõiku: üks koelõik värvitakse hematoksüliini ja eosiiniga (H&E-värvimine) kasvaja olemasolu tuvastamiseks ning teist kasutatakse HER2 geeni amplifikatsiooni analüüsis. Soovitame kinnitada koelõigud alusklaasidele Dako FLEX IHC Microscope Slides, kood K8020. Sobivad ka alusklaasid Superfrost Plus (Thermo Fischer Scientific, J1800AMNZ). Alusklaaside kõlblikkusaeg ei tohi olla möödunud. Proove tuleb analüüsida 6 kuu jooksul pärast lõikamist, kui neid säilitatakse temperatuuril 2 25 C. Märkus. Koeproovid tuleb asetada alusklaasil määratletud värvimisalale. Alusklaasi värvimisala mõõtmed leiate Dako Omnise põhilisest kasutusjuhendist. KASUTUSJUHEND magu A. Reaktiivi ettevalmistamine magu A.1 HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) Reaktiivi HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) viaalis on segamiseks kullaga kaetud metallkuul. Enne viaali laadimist analüüsiseadmesse Dako Omnis tuleb reaktiiv üles sulatada ja põhjalikult segada, kuna külmumisel selle faasid eralduvad. Kasutage sondi segamiseks segurit Dako Omnis Mixing Device. Segage sondi seguris Dako Omnis Mixing Device allolevate juhiste kohaselt. Lisateavet leiate seguri kasutusjuhendist. 1. Võtke reaktiivi HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) viaal külmikust välja. 2. Sisestage viaal segurisse Dako Omnis Mixing Device. 3. Ühendage segur Mixing Device ning veenduge, et roheline olekuindikaator põleb. 4. Valige programm Thaw + mix (Sulata + sega). Oluline! Viaalid, mida hoitakse temperatuuril alla 25 C, tuleb sulatada (vahetult) enne viaali laad imist segurisse Dako Omnis Mixing Device, ning kasutada tuleb programmi Mix (Sega). 5. Eemaldage viaal segurist Mixing Device. 6. Avage suletav kork, keerake see kõrvale ning lukustage vastavasse sälka (lisateavet leiate Dako Omnise põhilisest kasutusjuhendist). 7. Sisestage viaal kohe analüüsiseadme Dako Omnis reaktiivimoodulisse. Kui värvimisprotsessis kasutatakse reaktiivi pideva sisestamise funktsiooni, siis veenduge, et viaali segamisest aspireerimiseni analüüsiseadmes Dako Omnis kulub vähemalt 10 minutit. Sondi HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) võib üles sulatada ja kasutada kuni 10 korda. Segage sondisegu HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) vahetult enne analüüsiseadmesse laadimist. Ärge loksutage. ISH HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) kogu-stabiilsusaeg analüüsiseadme Dako Omnis reaktiivimoodulis on 80 tundi. Seadmesisese stabiilsusaja kulumist jälgib Dako Omnise tarkvara (vt all). HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) tuleb pärast (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 32/55

Maovähk analüüsiseadmest Dako Omnis eemaldamist kohe jahutada temperatuurile < 18 C (soovitatavalt 18 C kuni 25 C). A.2 ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) Valmistage töölahus, lahjendades kontsentreeritud reaktiivi ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) vahekorras 1:20 järgmiselt. 1. Täitke Dako Omnise tähisega PTB (sinine silt) suur 3,5 L pudel täitmiskriipsuni deioniseeritud veega (3,325 L). Enne täitmist asetage suur pudel horisontaalsele pinnale. 2. Tühjendage suurde pudelisse üks kontsentraadi ISH Pre-Treatment Solution (20x) (Dako Omnis) 175 ml pudel. 3. Võtke kontsentraadipudelilt eemaldatav silt maha ning kleepige suurele pudelile. Keerake suure pudeli kaas kinni ning pöörake suurt pudelit 2 3 korda õrnalt ümber. 4. Tuvastage reaktiiv Dako Omnise käeshoitava triipkoodiskanneriga (skannige eemaldatav silt ja suur pudel). 5. Laadige suur pudel kohe analüüsiseadmesse Dako Omnis. Lahjendatud lahust võib analüüsiseadmes Dako Omnis hoida kuni 7 päeva. Seadmesisese stabiilsusaja kulumist jälgib Dako Omnise tarkvara (vt all). Kasutamata lahjendatud lahust võib säilitada temperatuuril 2 8 C 30 päeva. Pärast külmas säilitamist tuleb lahjendatud lahus kindlasti ühtlustada temperatuurile vähemalt 18 C, enne kui see analüüsiseadmesse Dako Omnis sisestatakse. MÄRKUS. Hävitage lahjendatud lahus, kui see on muutunud häguseks. A.3 ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) Valmistage töölahus, lahjendades kontsentreeritud reaktiivi ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) vahekorras 1:20 järgmiselt. 1. Täitke Dako Omnise tähisega PTB (sinine silt) suur 3,5 L pudel täitmiskriipsuni deioniseeritud veega (3,325 L). Enne täitmist asetage suur pudel horisontaalsele pinnale. 2. Tühjendage suurde pudelisse üks kontsetraadi ISH Stringent Wash Buffer (20x) (Dako Omnis) 175 ml pudel. 3. Võtke kontsentraadipudelilt eemaldatav silt maha ning kleepige suurele pudelile. Keerake suure pudeli kaas kinni ning pöörake suurt pudelit 2 3 korda õrnalt ümber. 4. Tuvastage reaktiiv Dako Omnise käeshoitava triipkoodiskanneriga (skannige eemaldatav silt ja seejärel suur pudel). 5. Laadige suur pudel kohe analüüsiseadmesse Dako Omnis. Lahjendatud lahust võib analüüsiseadmes Dako Omnis hoida kuni 7 päeva. Seadmesisese stabiilsusaja kulumist jälgib Dako Omnise tarkvara (vt all). Kasutamata lahjendatud lahust võib säilitada temperatuuril 2 8 C kuni 30 päeva. Pärast külmas säilitamist tuleb lahjendatud lahus kindlasti ühtlustada temperatuurile vähemalt 18 C, enne kui see analüüsiseadmesse Dako Omnis laaditakse. MÄRKUS. Hävitage lahjendatud lahus, kui see on muutunud häguseks. A.4 ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) on kasutamisvalmis reaktiiv. Enne analüüsiseadmesse Dako Omnis laadimist avage viaali suletav kork, keerake see kõrvale ning lukustage vastavasse sälka. Reaktiivi ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) kogu-stabiilsusaeg analüüsiseadme Dako Omnis reaktiivimoodulis on 80 tundi. Seadmesisese stabiilsusaja kulumist jälgib Dako Omnise tarkvara (vt all). Pärast töötsükli lõppu võib reaktiivi ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) jahutada säilitamistemperatuurile (2 8 C), et sell e seadmesisest stabiilsusaega säästa. (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 33/55

Maovähk A.5 ISH Pepsin (Dako Omnis) ISH Pepsin (Dako Omnis) on kasutamisvalmis reaktiiv. Enne analüüsiseadmesse Dako Omnis laadimist veenduge, et reaktiiv on sulanud, ning avage suletav kork, keerake see kõrvale ja lukustage vastavasse sälka. Reaktiivi ISH Pepsin (Dako Omnis) kogu-stabiilsusaeg analüüsiseadme Dako Omnis reaktiivimoodulis on 80 tundi. Seadmesisese stabiilsusaja kulumist jälgib Dako Omnise tarkvara (vt all). Pärast töötsükli lõppemist tuleb reaktiiv ISH Pepsin (Dako Omnis) jahutada säilitustemperatuurile 18 8 C, et seadmesisest st abiilsusaega säästa. A.6 Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) kasutamisvalmis kinnituskeskkond, mida kasutatakse väljaspool analüüsiseadet Dako Omnis. Jahutage Fluorescence Mounting Medium kohe pärast kasutamist säilitustemperatuurile (2 8 C). A.7 Täiendavad tarvikud Analüüsiseadmesse Dako Omnis tuleb sisestada ka järgmised tarvikud: deioniseeritud vesi, lahjendatud Wash Buffer 20x (Dako Omnis), kood GC807, Clearify (Dako Omnis), kood GC810, ISH Cleaning Solution, kood GC207 ja ISH Lid (Dako Omnis), kood GC102, vastavalt Dako Omnise kasutusjuhendi(te)le. B. Värvimisprotseduur magu B.1 Märkused töökorra kohta HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) on hübridiseerimissond, mida kasutatakse otsese in situ hübridiseerimisanalüüsi (FISH) teostamiseks analüüsiseadmes Dako Omnis ning mis on mõeldud koos abireaktiividega GM300, GM301, GM302, GM303 ja GM304 (GM304 analüüsiseadme väliselt) HER2 geeni amplifikatsiooni kvantitatiivseks määramiseks. Enne kasutamist peaks kasutaja kõik juhised hoolikalt läbi lugema ning tutvuma kõigi komponentidega ja nendega seotud ohutusnõuetega. Analüüsiseadmes Dako Omnis teostatav automaatne protseduur hõlmab koelõikude deparafineerimist, epitoobi taastamist, pepsiinlõhustamist, hübridiseerimist ja kontsentreeritud pesu. Koelõigud väljastatakse kuivväljastamispesast. Kõik protokolli etapid on Dako Omnise tarkvaras eelprogrammeeritud. Juhised alusklaaside, kaante ISH Lid, reaktiivide jne seadmesse sisestamise kohta leiate vastavatest Dako Omnise kasutusjuhenditest. Kolm kontrollitud HER2 IQFISH protokolli: HER2 IQFISH Pepsin Short, HER2 IQFISH Pepsin Medium ja HER2 IQFISH Pepsin Long, mis erinevad ainult pepsiinlõhustamise kestuse poolest, on Dako Omnise tarkvarasse programmeeritud, ning neid võib kõigi viie alusklaasirestil oleva alusklaasi jaoks valida. Nii saab kudede lõhustamist optimeerida olenevalt analüüsieelsetest tingimustest. Protokolli HER2 IQFISH Pepsin Medium loetakse standardprotokolliks. Erinevaid värvimisprotokolle saab vaadata tööjaamas Dako Link Omnis Workstation. B.2. Värvimiseelne töökord 1. Valige igale alusklaasile rakendatav HER2 IQFISH protokoll tööjaama Dako Link Omnis Workstation tarkvaras IQFISH-protokollide alt. 2. Printige välja alusklaaside sildid ning kleepige need alusklaasidele. 3. Asetage alusklaasid alusklaasirestile. Üksikasjad leiate Dako Omnise põhilisest kasutusjuhendist. Ühel alusklaasirestil võib olla üks kuni viis alusklaasi. Soovitame ühe HER2 IQFISH värvimistsükliga värvida vähemalt kaks alusklaasi. 4. Sisestage alusklaasirest analüüsiseadmesse Dako Omnis. 5. Laadige kaaned ISH Lid (üks ISH Lid iga alusklaasiresti kohta) analüüsiseadmesse Dako Omnis. (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 34/55

Maovähk 6. Veenduge, et suured vedelikupudelid on analüüsiseadmesse Dako Omnis sisestatud ning selles registreeritud. Suured vedelikupudelid: Clearify (selgendi), lahjendatud ISH Pre- Treatment Solution (Dako Omnis), lahjendatud ISH Stringent Wash Buffer (Dako Omnis) ja lahjendatud Wash Buffer (Dako Omnis). 7. Sisestage ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) ja ISH Pepsin (Dako Omnis) ning värskelt segatud HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ja ISH Cleaning Solution reaktiivimoodulisse. Veenduge, et kõik suletavad korgid on avatud. 8. Järgige puuteekraanil kuvatavaid juhiseid ning puudutage nuppu Done (Valmis), et värvimisprotseduur käivitada. B.3. Värvimisprotseduur Värvimisprotseduuri HER2 IQFISH analüüsiseadmes Dako Omnis (kokkuvõte tabelis 11) saab jälgida tööjaamas Dako Link Omnis Workstation: Tabel 11. Lihtsustatud ülevaade värvimisprotokolli HER2 IQFISH etappidest. Etapp Reaktiiv Kestus ja temperatuur Deparafin. Clearify (selgendi) 10 minutit, 38 C Epitoobi taastamine ISH Pre-Treatment Solution 15 minutit, 97 C (Dako Omnis) Pesu ISH Ethanol Solution, 96% (Dako Omnis) 2 x 3 minutit, 32 C Lõhustamine* ISH Pepsin (Dako Omnis) 10 minutit, 15 minutit või 20 minutit Kuivatamine 15 minutit, 45 C Denatureerimine 10 minutit, 66 C Hübridiseerimine HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) 75 minutit, 45 C Kontsentreeritud ISH Stringent Wash Buffer (Dako pesu Omnis) 10 minutit, 61 C * Ülalloetletud HER2 IQFISH protokollide vahel valides saab ühtlasi valida kolme kontrollitud pepsiinlõhustamise kestuse vahel. Kui lähiajal ei ole vaja rohkem ISH-värvimist teha, jahutage kõik reaktiivid nende ettenähtud säilitamistemperatuuridele. B.4. Värvimisjärgne töökord Väljastage alusklaasid ning kandke alusklaasi värvimisalale 30 µl reaktiivi Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis), mis sisaldab DAPI-d. Reaktiiv Fluorescence Mounting Medium (Dako Omnis) peab koelõigu täielikult katma. Paigaldage klaasist katteklaas. MÄRKUS. Alusklaase võib hinnata 15 minutit kuni 7 päeva pärast kinnitamist. Kui alusklaasid on tugeva valguse käes või kõrgel temperatuuril, võib toimuda fluorestsentsi kustumine. Kustumise vähendamiseks hoidke alusklaase pimedas temperatuuril 18 8 C. (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 35/55

Maovähk Kvaliteedikontroll magu 1. Signaalid peavad olema eredad, eristatavad ning lihtsasti hinnatavad. 2. Mittepatoloogiliste rakkude alusel on võimalik teha värvimistsükli sisest kontrolli. Mittepatoloogilised rakud peaksid andma 1 2 selgesti nähtavat rohelist signaali, mis näitab, et CEN-17 PNA-sond on edukalt hübridiseeritud 17. kromosoomi tsentromeersele piirkonnale. Mittepatoloogilistel rakkudel peaks olema ka 1 2 selgest nähtavat punast signaali, mis näitab, et HER2 DNA-sond on edukalt hübridiseeritud HER2 geeni(de)le. Kuna kude on lõikudena, võib mõnedes mittepatoloogilistes rakkudes olla igat värvi signaale vähem kui kaks (diploidsete rakkude puhul oodatav). Kui tervetes rakkudes ei õnnestu signaali tuvastada, on analüüs ebaõnnestunud ja tulemused loetakse valeks. 3. Tuumade morfoloogia peab olema kahjustamata, kui hindamisel kasutada DAPI-filtrit. Mitmed ghost-like rakud ja üldiselt halb tuuma morfoloogia viitab proovi liigsele lõhustamisele, mis annab tulemuseks signaalide kao või fragmentatsiooni. Sellised proovid tuleb lugeda kehtetuteks. 4. Hindamiskõlbulikke kasvajarakke peab olema vähemalt 20. 5. Erinevused koe fikseerimiseks, töötlemiseks ja sisestamiseks kasutatavas laboritehnilises töökorras võivad anda tulemuste kõikuvust, mis tingib vajaduse laborisisesteks kontrollideks. Värvumise tõlgendamine magu Hindamiskõlbulik kude Leidke kasvaja H&E-värvitud alusklaasilt ning hinnake FISH-värvitud alusklaasil (DAPI-filtriga) sama ala. Analüüsida tohib ainult mao või mao-söögitoru ühinemiskoha adenokartsinoomiga patsientide proove. Kui samas proovis on soole metaplaasia ja adenokartsinoom, tuleb punktid arvutada ainult kartsinoomikomponendi kohta. Hoiduge tugevalt põletikulistest aladest ning aladest, kus tuumakestad on kahtlased. Ärge kaasake tuumi, mis vajavad subjektiivset hinnangut. Ärge kaasake tuumi, millel on nõrgad signaalid ja mittespetsiifiline või kõrge tausta värvumine. Esiteks hinnake mikroskoopiliselt kogu FISH-värvitud koelõiku ning H&E-värvitud koelõigu määratud ala. Enne FISH-värvitud lõigu signaalide loendamist kirjendage üldine signaalide jaotus (homogeenne või heterogeenne) signaaliloendamislehele. Heterogeense jaotuse puhul pange kirja, kas esineb fokaalset amplifikatsiooni või üherakulist amplifikatsiooni (mosaiik). 1) Signaalide homogeenne jaotus Kui signaalide jaotus on homogeenne, lugege kokku kromosoomide tsentromeerid (rohelised signaalid) ja HER2 geenid (punased signaalid) 20 rakult 1 2 kasvaja esinduslikus alas. 2) Signaalide heterogeenne jaotus Kui signaalide jaotus on heterogeenne, loendage signaalid kokku 20 rakult allnimetatud valitud alades. A) Kui amplifikatsioon on lokaalne, peaksite valima amplifitseerunud rakkudega alad. B) Kui tegu on mosaiikjaotusega või amplifitseerunud polüsomaalsete ja disomaalsete rakkudega, loendage signaale amplifitseerunud rakkudega alades. Nendes alades tuleb loendada signaale mitte ainult amplifitseerunud rakkudelt, vaid ka nende kõrval paiknevatelt mitteamplifitseerunud rakkudelt; kokku 20 rakku. Võimalusel ärge valige kattuvaid alasid. Bakteriaalse DNA värvumist tuleb eirata HER2 sond värvib väga tugevalt erinevaid maokoes hajusalt leiduvaid spetsialiseerunud rakke (mastotsüüte ja makrofaage) bakteriaalse DNA olemasolu tõttu. Tulemuseks on väga tugevalt (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 36/55

Maovähk punaselt fluorestseeruvad rakud, mis eristuvad selgelt kõrge HER2 geeni amplifikatsiooniga rakkudest. Signaalide loendamine Kui olete signaali hindamiseks mõne ala välja valinud, alustage analüüsimist ühest 20 lähedalasuvast valitud tuumast ning loendage rakk-raku haaval, jättes välja ainult need rakud, mis ei vasta kvaliteedikriteeriumitele. Leidke kasvaja H&E-värvitud alusklaasilt ning hinnake FISH-värvitud alusklaasil sama ala. Skannige kogu värvitud alusklaas, et avastada võimalikke heterogeensusi. Valige ala, kus on ilus tuumade levik. Alustage analüüsi valitud piirkonna vasakust ülemisest kvadrandist ning, liikudes vasakult paremale, lugege vastavalt järgnevatele juhistele üle signaalid, mis on iga hinnatava tuuma tuumapiirjoontes (vt ka lisa 5). - Fokusseerige üles ja alla, et leida kõik üksikute tuumade signaalid. - Kaks sama suurt signaali, mille kaugus on signaali läbimõõduga võrdne või sellest väiksem, tuleb lugeda üheks signaaliks. Kahe signaali eristamiseks peab nende vaheline kaugus olema vähemalt võrdne ühe normaalse suurusega signaali läbimõõduga. Kui kahe signaali vaheline kaugus on väiksem kui signaali läbimõõt, loetakse need üheks signaaliks. - Kui tuumade HER2 geeni amplifikatsioon on tugev, võivad HER2 signaalid paikneda väga lähestikku, moodustades signaalide kobara. Neil juhtudel ei saa HER2 signaale täpselt loendada, vaid nende arvu tuleb hinnata. Erilist tähelepanu tuleb pöörata rohelistele signaalidele, sest punaste HER2 signaalide kogumid võivad katta rohelisi signaale ning neid peita. Kui kahtlete, kontrollige rohelisi signaale spetsiifilise FITC-filtriga. Ärge arvestage loendamisel signaalideta tuumi ega ainult ühte värvi signaalidega tuumi. Loendage ainult neid tuumi, kus on mõlemast värvist vähemalt üks FISH-signaal. Signaalide loendamise juhend 1 Mitte arvestada. Tuumad kattuvad, kõik tuuma piirkonnad ei ole näha. 2 Kaks rohelist signaali, ärge arvestage ainult ühte värvi signaaliga tuumi. 3 Arvestage 3 rohelise ja 12 punase signaalina (kogumi hindamine). 4 Arvestage 1 rohelise ja 1 punase signaalina. Kaks sama suurt signaali, mille kaugus on signaali läbimõõduga võrdne või sellest väiksem, tuleb lugeda üheks signaaliks. 5 Ärge arvestage (üle- või alalõhustatud tuumad). võ Puuduvad signaalid tuumade keskmetes (sõõrikukujulised tuumad). 6 Arvestage 2 rohelise ja 3 punase signaalina. Kaks sama suurt signaali, mille kaugus on signaali läbimõõduga võrdne või sellest väiksem, tuleb lugeda üheks signaaliks. 7 Arvestage 1 rohelise ja 5 punase signaalina. (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 37/55

8 Arvestage 3 rohelise (1 roheline fookusest väljas) ja 3 punase signaalina. Maovähk 9 Punaste signaalide kogum peidab rohelisi signaale; kontrollige rohelisi signaale spetsiifilise FITC-filtriga või ärge arvestage neid. Kirjendage arvud tabelisse, nagu kujutatud lisas 3 ja 4. Loendage 20 tuuma koeproovi kohta; võimalusel kasvaja eraldiseisvatest osadest. Arvutage suhtarv HER2/CEN-17, jagades punaste HER2 signaalide koguarvu roheliste CEN-17 signaalide koguarvuga. Proovid, mille suhtarv HER2/CEN-17 on vähemalt 2, tuleb lugeda HER2 geeni amplifikatsiooniga proovideks (29). Tulemusi, mis on otsustuslävel või selle lähedal (1,8 2,2) tuleks tõlgendada ettevaatusega. Kui suhtarv on otsustusläve lähedal (1,8 2,2), loendage 40 erinevat tuuma ning arvutage suhtarv 40 tuuma jaoks. Kui loendamise tulemuseks olev suhtarv on endiselt otsustusläve lähedal, tuleb teise loendamise tulemus õigeks lugeda. Võimalusel tuleb paremaks orienteerumiseks kaasata teise loendamisse HER2 immunohistokeemiline värvimine. Kui kahtlete ikkagi, tuleb proovialusklaas uuesti loendada. Piirjuhtumi korral tuleb konsulteerida patoloogi ja raviarstiga. Piirangud magu 1. Ainult automaatvärvimiseks Dako Omnise analüüsiseadmetes. 2. Kudede ja alusklaaside ettevalmistamiseks ning IQFISH-värvumise tõlgendamiseks on vaja eriväljaõpet. Reaktiiviga HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) värvitud proove ei tohi tõlgendada inimesed, kellel on puudulik värvitaju. 3. FISH-tulemused sõltuvad kudede käitlemisest ja töötlemisest enne värvimist. Vale fikseerimine, pesu, kuivatamine, kuumutamine, lõigu lõikamine või saastumine teiste kudede või vedelikega võib mõjutada proovi hübridiseerimist. Vastuolulised tulemused võivad olla tingitud fikseerimise ja sisestamise meetodite variatsioonist või koele omastest anomaaliatest. Toote omadused magu Hübridisatsiooni tõhusus Analüüsi HER2 IQFISH pharmdx hübridisatsiooni tõhususe uurimiseks analüüsiti kolmes erinevas uuringukohas 180 formaliiniga fikseeritud parafiini sisestatud koelõiku. Kõik 180 koelõiku õnnestus loendada vastavalt toote loendamisjuhistele. Hübridisatsiooni tõhusus oli 100%. Toote omaduste uuringutes kasutatud suhtarvude HER2/CEN-17 arvutamine põhineb 20 tuuma signaalide loendamisel vastavalt käesoleva kasutusjuhendi jaotises Värvumise tõlgendamine kirjasolevatele hindamisjuhistele. Analüütiline tundlikkus Analüüsi HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) analüütilist tundlikkust uuriti 20 erineva mao adenokartsinoomi koeproovi abil (10 proovi olid HER2 geeni amplifikatsiooniga ning 10 proovi amplifikatsioonita). Koeproovi 20 mittepatoloogilise raku rakutuumade loendamise põhjal arvutati HER2 signaalide arvu ja CEN-17 signaalide (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 38/55

Maovähk arvu suhe. 20 mao adenokartsinoomi koeproovi suhtarvud HER2/CEN-17 olid vahemikus 0,94 kuni 1,19. Analüütiline spetsiifilisus Reaktiivis HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) sisalduvad HER2 DNA sondid on lõppjärjestatud ning kaardistatud, et veenduda kogukatvuses 218 kb, mis hõlmab HER2 geeni. Reaktiivis HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) sisalduvaid CEN-17 PNA sonde on nii ühekaupa kui ka korraga analüüsitud, et veenduda nende spetsiifilises hübridiseerumises 17. kromosoomi tsentromeersele osale. Et välistada risthübridiseerumine teistele kromosoomidele peale 17. kromosoomi, teostati Dako standardsetele kvaliteedikontrolliprotseduuridele vastavad metafaasiaegsete proovide uuringud. Kokku hinnati 275 hästieristatavate signaalidega metafaasiaegset proovi, et uurida HER2 DNA ja CEN-17 PNA sondisegude hübridiseerumise spetsiifikat. Kõigil 275 juhul oli hübridiseerumine 17. kromosoomi spetsiifiline. Ühelgi 275 proovist ei tuvastatud risthübridiseerumist teiste kromosoomide lookustele. Seega oli sondi spetsiifilisus 100% (275/275). Selleks, et mõõta analüüsi IQFISH võimet tuvastada ainult sihtaineid HER2 ja CEN-17 ilma teiste ainete põhjustatavate häireteta, teostati mao adenokartsinoomi koeproovidega uuringud, milles kasutatud hübridiseerimissegu ei sisaldanud HER2 ja CEN-17 sonde, vaid ainult hübridiseerimispuhvrit. Kokku hinnati 20 proovi, et tuvastada võimalikke sondiseguga mitteseotud signaale. Ühelgi 20 proovist ei tuvastatud teiste kromosoomilookuste värvumist ega sarnaste ainete põhjustatavaid häireid. Robustsuse uuringud Analüüsi HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) robustsust mõõdeti, varieerides PNA-sondi kontsentratsiooni, epitoobi taastamise kestust, pepsiininkubeerimise kestust, denatureerimise kestust, hübridiseerimise kestust ning kontsentreeritud pesu kestust ja temperatuuri. Neid parameetreid varieeriti kolme erineva mao adenokartsinoomi FFPE koeproovi ning kahe maosöögitoru ühenduskoha FFPE koeproovi analüüsimisel (mõlemas rühmas oli nii amplifikatsiooniga kui ka amplifikatsioonita koeproove). Analüüsid teostati nii standardprotokolli seadetest madalamate kui ka kõrgemate parameetritega. Erandiks olid PNA-sondi kontsentratsioon ja kontsentreeritud pesu temperatuur, mis jäeti mõndade analüüside puhul standardprotokolli seadetele. Analüüsi parameetrid: PNA-sondi kontsentratsioon: analüüsid tasemetel 100% ja +/-17%. Epitoobi taastamise kestus: analüüsid tasemetel 13 min 45 s ja 16 min 15 s. Pepsiininkubeerimise kestus: analüüsid tasemetel 14 min 45 s ja 16 min 15 s. Denatureerimise kestus: analüüsid tasemetel 9 min 45 s ja 10 min 45 s. Hübridiseerimise kestus: analüüsid tasemetel 70 min ja 80 min. Kontsentreeritud pesu kestus: analüüsid tasemetel 8 min 45 s ja 11 min 15 s. Kontsentreeritud pesu temperatuur: analüüsid tasemetel 59 C, 61 C ja 63 C. Kolme erineva PNA-sondi kontsentratsiooniga tehti fraktsioonilise katsekorraldusega (JMP tööriist, SAS) katse, mis hõlmas 12 erinevat värvimisprotokolli, mis on kirjas tabelis 12. Tabel 12. Robustsuse uurimiseks kasutatud kaksteist erinevat värvimisprotokolli. (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 39/55

Maovähk Analüüsi parameeter Robustsuse uurimise protokolli nr Epitoobi taastamise kestus (min) Pepsiininkub kestus (min) Denatureerimise kestus (min) Hübridiseerimise kestus (min) Kontsentr. pesu kestus (min) Kontsent. pesu temp ( 0 C) PNA konts. sondisegus 1 16,25 16,25 9,75 80 8,75 59 83% 2 13,75 14,75 10,75 70 8,75 59 100% 3 16,25 14,75 9,75 70 8,75 63 100% 4 13,75 14,75 10,75 80 8,75 61 83% 5 13,75 14,75 9,75 80 11,25 59 117% 6 13,75 16,25 10,75 70 11,25 63 83% 7 13,75 16,25 10,75 70 11,25 63 100% 8 16,25 14,75 9,75 70 11,25 61 83% 9 13,75 16,25 9,75 70 8,75 61 117% 10 16,25 16,25 10,75 70 11,25 59 117% 11 16,25 16,25 10,75 80 11,25 61 100% 12 16,25 14,75 10,75 80 8,75 63 117% Kõiki viite koeproovi värviti kõigi 12 protokolliga. Robustsuse uuringu väljundparameetriteks olid signaali intensiivsus ja morfoloogia kvaliteet. Kõik protokollid värvisid kõiki koeproove (kokku 60) erksate, hästi eristuvate ja hõlpsasti loendatavate signaalidega ning andsid seega loendamiseks sobivaid tulemusi. Lisaks uuriti koelõigu paksuse mõju analüüsi HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) tulemustele, varieerides maovähi FFPE koeproovide lõigu paksust. Kokku analüüsiti analüüsiga HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) viis järjestikust erineva paksusega (2, 3, 4, 5, 6 ja 7 µm) lõiku inimese mao adenokartsinoomi proovidest. Suhte HER2/CEN-17 keskmine variatsioonikoefitsient oli 3,9% (vahemikus 3,2% kuni 5,0%). Korratavus Laborisisest päevade- ja partiidevahelist korratavust uuriti analüüsiga HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). See uuring korraldati tootjasisese pimeda randomiseeritud uuringuna, mis hõlmas kaheksa erinevate HER2 geeni amplifikatsiooni tasemetega formaliinis fikseeritud parafiini sisestatud maovähi, muu hulgas mao-söögitoru ühenduskoha vähi koeproovi lõikude HER2/CEN- 17 suhete määramist. Neid kaheksat proovi oli analüüsitud analüüsiga HercepTest ning nende hulgas oli kaks proovi HER2 IHK skooriga 0/1+, kaks proovi HER2 IHK skooriga 2+, kaks proovi HER2 IHK skooriga 3+ ja kaks proovi eelnevalt HER2 IQFISH pharmdx (kood K5731) abil määratud FISH-suhtarvuga HER2/CEN-17 vahemikus 1,5 kuni 2,5. Kõik proovid värviti kolme erineva HER2 IQFISH pharmdx TM (Dako Omnis) partiiga viiel mittejärjestikusel päeval. Kokku teostati uuringu jooksul 240 koevärvimist, kuna iga kombinatsioon värviti duplikaatidena. Suhtarvude päevade- ja partiidevahelist varieerumist on kujutatud joonisel 8. Andmeid analüüsiti Boxi-Coxi teisendusega, rakendades juhuslike mõjudega mudelit, et saavutada andmete homogeenne dispersioon. Summaarseks hinnanguliseks variatsioonikoefitsiendiks saadi 6,5%. Päevadevaheline ja partiidevaheline variatsioonikoefitsient olid vastavalt 0,7% ja 0,8%. (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 40/55

Maovähk Joonis 8. Suhtarvud HER2/CEN-17, mis saadi analüüsiga HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) teostatud laborisiseses korratavusuuringus, milles uuriti partiidevahelist ja päevadevahelist korratavust. Koeproovide keskväärtusi on kujutatud horisontaaljoontega. Lisaks uuriti analüüsi HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) päevadevahelist ja laboritevahelist korratavust tootjaväliselt kolme uuringukohta (üks uuringukohta USA-s ja kaks Euroopas) hõlmanud stratifitseeritud pimedas uuringus, milles analüüsiti 12 erineva formaliinis fikseeritud parafiini sisestatud mao adenokartsinoomi, muu hulgas mao-söögitoru ühenduskoha adenokartsinoomi koeproovi lõike. Kolme proovi HER2 IHK skoor oli 0/1+, kolme proovi HER2 IHK skoor oli 2+, kolme proovi HER2 IHK skoor oli 3+ ning kolme proovi suhtarvud HER2/CEN-17 FISH olid 1,5 ja 2,5, määratuna vastavalt analüüsiga HercepTest TM ja analüüsiga HER2 IQFISH pharmdx (kood K5731). Proovid värviti ja neid analüüsiti uuringukohtades. Igat proovi värviti vähemalt seitse korda seitsmel mittejärjestikusel päeval ning hinnati igas uuringukohas ühe uurija poolt. Kokku värviti ja kaasati statistilisse analüüsi 314 koelõiku. Andmeid analüüsiti Boxi-Coxi teisendusega ning arvutati dispersiooni komponendid. Ülemisel usalduspiiril 95% põhinevaks summaarseks variatsioonikoefitsiendiks oli 24%. Suhtarvu HER2/CEN-17 päevade- ja laboritevahelist varieeruvust on kujutatud joonisel 9. Joonis 9. Teisendamata ühikutes suhtarvude HER2/CEN-17 varieeruvuse diagramm, mis saadi analüüsi HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) päevadevahelise ja laboritevahelise korratavuse uuringus maovähi koeproovidega. Analüüsi HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) uurijatevahelist korratavust uuriti ettevõttesiseselt teostatud meetodite võrdlusuuringus, mille käigus hindasid kolm uurijat värvitud (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 41/55

Maovähk proove sõltumatult. Korratavuse uurimiseks analüüsiti 139 erinevat inimese mao adenokartsinoomi proovi, mille hulgas oli nii HER2 geeni amplifikatsiooniga kui ka amplifikatsioonita proove. Andmeid analüüsiti Boxi-Coxi teisendusega. Keskmine uurijatevaheline variatsioonikoefitsient oli 18%. Mao adenokartsinoomi proovidest 96,4% olid resektsiooniproovid ja 5,6% biopsiaproovid. 81,3% proovidest võeti maost ning 18,7% maosöögitoru ühenduskohast. Korduvus Analüüsi HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) laborisisest korduvust uuriti, analüüsides kaheksa inimese mao adenokartsinoomi koeproovi, mille hulgas oli nii HER2 geeni amplifikatsiooniga kui ka amplifikatsioonita proove, järjestikuseid lõike. Koeproove analüüsiti duplikaatidena viiel mittejärjestikusel päeval, kasutades kokku 240 alusklaasi (120 koelõiku duplikaatidena) analüüsimiseks kolme erinevat partiid. Andmete analüüsimisel kasutatud juhuslike efektide mudel andis tulemuseks päevade ja partiide erinevustega seostatava dispersiooni (vaata ülalolevat tootjasisest korratavusuuringut). Ülejäänud dispersioon võrdub paralleelproovide vahelise dispersiooniga ning seega korduvusega. Korduvusega seotud variatsioonikoefitsient 95% usaldusnivool oli 7,1%. Meetodite võrdlusuuring Analüüsi HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) ja analüüsi HER2 IQFISH pharmdx tulemuste võrdlus (K5731) Uuring hõlmas 140 maovähi koeproovi, mille hulgas oli erinevaid mao adenokartsinoomi koetüüpe, st mao ja mao-söögitoru ühenduskoha koeproove, resektsiooni- ja biopsiaproove ning homogeense ja heterogeense (fokaalse ja mosaiikse) signaalijaotusega proove, nagu kirjas tabelis 13. Tabel 13. Proovide jaotus maovähi tüübi (magu või mao-söögitoru ühenduskoht), signaalide jaotuse (homogeenne või heterogeenne) ning koeproovi tüübi (resektsioon või biopsia) järgi. Maovähi tüüp Proovide arv Signaalide jaotus Proovide arv Koeproovi tüüp Proovide arv Magu 113 Homogeenne 58 Resektsioon 134 Mao-söögitoru ühenduskoht 27 Heterogeenne fokaalne Heterogeenne mosaiikne 61 21 Biopsia 6 Kokku 140 Kokku 140 Kokku 140 Analüüsiti 76 HER2 amplifikatsioonita proovi ning 64 HER2 amplifikatsiooniga proovi, mille HercepTest -skoorid on kirjas tabelis Tabel 14. Tabel 14. Proovide jaotus analüüsiga HER2 FISH pharmdx Kit (K5731) saadud HercepTest -skoori ja HER2 FISH-skoori põhjal. HercepTest -värvimise skoor 0 1+ 2+ 3+ Kokku n 39 14 45 42 140 HER2 FISH-olek Amplifikatsiooniga 4 1 19 40 64 Amplifikatsioonita 35 13 26 2 76 FISH-analüüsitud proove kokku 39 14 45 42 140 Tabelis Tabel 15 on kujutatud HER2 oleku risttabulatsiooni, mis saadi kahe analüüsiga, arvutades üldise kokkulangevuse protsentarvu (OPA), positiivse kokkulangevuse protsentarvu (PPA) ja negatiivse kokkulangevuse protsentarvu (NPA). Nende kahe analüüsimeetodiga saadud suhtarvude HER2/CEN-17 korrelatsiooni on kujutatud joonisel 10. (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 42/55

Maovähk Tabel 15. Risttabulatsioon HER2 geeni olekutest, mis saadi analüüsidega HER2 IQFISH pharmdx (kood K5731) ja HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis). Amplifikatsioonita HER2 geeni olek (K5731) Amplifikatsiooniga Kokku HER2 geeni olek (Dako Amplifikatsioonita Amplifikatsiooniga 76 0 1 63 77 63 Omnis) Kokku 76 64 140 OPA: 99,3% PPA: 98,4% NPA: 100% Joonis 10. Analüüsidega HER2 FISH pharmdx (Dako Omnis) ja HER2 IQFISH pharmdx (kood K5731) saadud suhtarvude HER2/CEN-17 korrelatsioon. Analüüsiti 140 maovähi koeproovi (regressioonisirge: y = 0,06 + 0,97*x; R2 = 0,97. Kaalutud dispersiooni pöördväärtusega, et saada regressioonisirge). Suhtarvul HER2/CEN-17 = 2 saadi kahe värvimismeetodi keskmise erinevuse 95% usaldusvahemikuks [0,007; 0,022]. See tähendab, et 2% suurem erinevus ei ole ootuspärane. Kliinilised andmed Trastusumaabi (Herceptin ) kliinilist ohutust ja tõhusust on näidatud uuringus BO18255 (ToGA uuring An open-label, randomized, multicenter, phase III study of trastuzumab in combination with cisplatin and a fluoropyrimidine (capecitabine or 5-Fluorouracil) (FC+H) versus chemotherapy (FC) alone as first-line therapy in patients with HER2 positive advanced gastric cancer ) (28). Uuring korraldati avatud randomiseeritud mitmekeskuselise III faasi uuringuna HER2-positiivsetel patsientidel, kellel on kaugelearenenud mao ja mao-söögitoru ühenduskoha adenokartsinoom. Uuringus BO18255 loeti HER2-positiivseteks proovid, mis olid IHKpositiivsed (3+) analüüsi HercepTest (Dako) kohaselt ja/või FISH-positiivsed (HER2/CEN-17 2,0) analüüsi HER2 FISH pharmdx Kit (Dako) kohaselt. Pärast uuringusse kaasamist randomiseeriti patsiendid kas keemiaravi (5-FU või kapetsitabiin ja tsisplatiin) või keemiaravi+trastusumaabi rühma. (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 43/55

Maovähk Peamiseks kliinilist efektiivsust iseloomustavaks tulemuseks oli üldine elulemus, mida analüüsiti stratifitseeritud log-rank testiga. Lõplik 351 surmal põhinenud üldise elulemuse analüüs oli statistiliselt oluline (olulisuse nimiväärtus 0,0193). Aasta pärast lõplikku analüüs teostati ka uus üldise elulemuse analüüs. Herceptin -i ja keemiaravi saanud uuringurühma patsientide üldise elulemuse mediaan oli 13,5 kuud, mis oli ainult keemiaravi saanud uuringurühma 11,0-kuulisest üldise elulemuse mediaanist oluliselt pikem. Lõpliku analüüsi ja uue analüüsi kliinilist tõhusust puudutavad tulemused on kokku võetud tabelis 16 ja joonisel 11. (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 44/55

Maovähk Tabel 16. Üldine elulemus ravikavatsusega populatsioonis. Lõplik üldine elulemus nr Surmad (%) Mediaan 95% usaldusvahemik (üldise elulemuse mediaan) Riskitiheduste suhe 95% usaldusvahemik p-väärtus*, kahepoolne Uuendatud üldine elulemus nr Surmad (%) Mediaan 95% usaldusvahemik (üldise elulemuse mediaan) Riskitiheduste suhe 95% usaldusvahemik *Võrreldes olulisuse nimiväärtus 0,0193 FC rühm N = 296 184 (62,2%) 11,0 (9,4, 12,5) 227 (76,7%) 11,7 (10,3, 13,0) 0,73 (0,60, 0,91) 0,0038* 0,80 (0,67, 0,97) FC + H rühm N = 298 167 (56,0%) 13,5 (11,7, 15,7) 221 (74,2%) 13,1 (11,9 15,1) Joonis 11. Metsastaatilise maovähiga patsientide uuendatud üldine elulemus (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 45/55

Maovähk Üldise elulemuse uuriv analüüs, mis põhineb geeniamplifikatsiooni (FISH) ja valkude üleekspresseerumise (IHK) mõõtmistel, on kokku võetud tabelis 17. Tabel 17. HER2-olekul ja uuendatud üldisel elulemusel põhinevad uurivad analüüsid. FISH+ / IHK 0, 1+ alamrühm (N = 133) nr Surmad / n (%) Üldise elulemuse mediaan 95% usaldusvahemik (üldise elulemuse mediaan) FC N = 296 a 57/71 (80,3%) 8,8 (6,4, 11,7) Riskitiheduste suhe (95% CI) 1,33 (0,92, 1,92) FISH+ / IHK2+ alamrühm (N = 160) nr Surmad / n (%) 65/80 (81%) Üldise elulemuse mediaan 10,8 95% usaldusvahemik (6,8, 12,8) (üldise elulemuse mediaan) Riskitiheduste suhe (95% CI) 0,78 (0,55, 1,10) FISH+ või FISH-/IHK3+ c alamrühm (N = 294) nr Surmad / n (%) 104/143 (73%) Üldise elulemuse mediaan 13,2 95% usaldusvahemik (11,5. 15,2 (üldise elulemuse mediaan) Riskitiheduste suhe (95% CI) 0,66 (0,5, 0,87) FC + H N = 298 b 56/62 (90,3%) 8,3 (6,2, 10,7) 64/80 (80%) 12,3 (9,5, 15,7) 96/151 (64%) 18,0 (15,5, 21,2) Elulemuse mediaani hinnati Kaplani-Meieri kõverate põhjal. a Analüüsist jäeti välja kaks FC-rühma patsienti, kes olid küll FISH+, kuid kelle IHK-olek oli teadmata. b Analüüsist jäeti välja kaks Herceptin -i rühma patsienti, kes olid küll FISH+, kuid kelle IHKolek oli teadmata. c Hõlmab 6 patsienti keemiaravirühmas, 10 FISH-, IHK3+ patsienti Herceptin -i rühmas, ning 8 patsienti keemiaravirühmas, 8 tundmatu FISH-olekuga IHK3+ patsienti Herceptin -i rühmas. (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 46/55

Maovähk Tõrkeotsing magu Probleem Tõenäoline põhjus Soovitatav tegevus 1. Signaale pole või nõrgad signaalid 1a. Reaktiivid on tarnimisel või säilitamisel olnud kõrgel temperatuuril 1b. Mikroskoop ei tööta korralikult - Sobimatu filtrikomplekt - Sobimatu valgusallikas - Elavhõbedalamp on liiga vana - Määrdunud ja/või mõranenud kollektorläätsed - Sobimatu immersioonõli 1a. Kontrollige säilitamistingimusi. Kontrollige IQISH-sondisegu ja pepsiini saadetiste vastuvõtmisel kuivjää olemasolu. Veenduge, et reaktiive on säilitatud nõuetekohaselt. 1b. Kontrollige mikroskoopi ja veenduge, et kasutatud filtrid on sobilikud kasutamiseks koos sondisegu flurokroomidega ning et elavhõbedalamp on sobiv ja seda pole üle oodatava tööea kasutatud (vt lisa 5). Kahtluse korral võtke ühendust kohaliku mikroskoobitarnijaga. 1c. Kustunud signaalid 1c. Vältige pikaajalist mikroskoopilist uurimist ja minimeerige kokkupuudet tugevate valgusallikatega. 1d. Puhvrid on valesti tuvastatud 1d. Asendage puhverlahused ning tagage uute puhvrite õige registreerimine (tööjaamas) ja tuvastamine (puuteekraanil). Üksikasjad leiate Dako Omnise põhilisest kasutusjuhendist. Tähelepanu! ISH Pre- Treatment Solution on roheline ja ISH Stringent Wash Buffer on kollane. 2. Uuritaval alal pole signaali 2. Kinnitamise ajal on tekkinud õhumullid 2. Vältige õhumulle. Leidmisel koputage need õrnalt pintsette kasutades välja. 3. Liigne taustavärvumus 3a. Koe ebapiisav fikseerimine 3a. Kasutage kindlasti ainult formaliinis fikseeritud parafiini sisestatud koelõike. 3b. Hübridiseeritud lõikude pikaajaline kokkupuude tugeva valgusega. 3b. Vältige pikaajalist mikroskoopilist uurimist ja minimeerige kokkupuudet tugeva valgusega. (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 47/55

Probleem Tõenäoline põhjus Soovitatav tegevus 4. Kudede kehv morfoloogia 5. Kõrge rohelise autofluorestsentsi tase katteklaasil, k.a alad ilma FFPE koeta Maovähk 4a. Vale pepsiintöötlus. 4a. Valige mõni teine kolmest erinevast värvimisprotokollist. Veenduge, et reaktiivi ISH Pepsin säilitatakse õigel temperatuuril. 4b. Liiga pikk pepsiintöötlus või väga õhuke lõigu paksus võib põhjustada varirakkude või sõõrikukujuliste rakkude ilmumist. 5. Aegunud või mittesoovitatavate alusklaaside kasutamine. 4b. Proovige kasutada lühema pepsiinlõhustamisajaga värvimisprotokolli. Veenduge, et lõigu paksus on 3 6 µm. 5. Valige nõuetekohased alusklaasid. Alusklaaside kõlblikkusaeg ei tohi olla möödunud. MÄRKUS. Kui probleemi ei saa liigitada ühegi eelnimetatud põhjuse alla või soovitatud tegevus seda ei lahenda, võtke edasise abi osas ühendust Dako tehnilise teenindusega. (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 48/55

Maovähk Lisa 3 magu HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis), kood GM333 Hindamisskeem Tsükli teostamiskuupäev: Värvimistsükli ID logis: HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) partii: Proovi ID: Signaalide jaotuse kirjeldus koes: Homogeenne: Heterogeenne fokaalne: or Heterogeenne mosaiik: Signaalide arv 20 tuumas Tuum nr HER2- skoor (punased) CEN-17- skoor (rohelised) Tuum nr HER2-skoor (punased) CEN-17- skoor (rohelised) 1 11 2 12 3 13 4 14 5 15 6 16 7 17 8 18 9 19 10 20 Kokku (1 10) Kokku (11 20) Suhtarvu HER2/CEN-17 määramiseks loendage HER2 signaalid ning CEN-17 signaalid samas 20 tuumas ning jagage HER2 signaalide koguarv CEN-17 signaalide koguarvuga. Kui suhtarv HER2/CEN-17 on otsustusläve lähedal (1,8 2,2), loendage 40 erinevat tuuma ning arvutage suhtarv nende 40 tuuma jaoks (vt Kordusloenduse hindamisskeem, lisa 4). Kui suhtarv on otsustuslävel või selle lähedal (1,8 2,2), tuleb seda ettevaatlikult tõlgendada (vt lugemisjuhendit). (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 49/55

Maovähk HER2 CEN-17 Suhtarv HER2/CEN-17 Koguskoor (1 20) Suhtarv < 2: HER2 geeni amplifikatsiooni ei täheldatud Suhtarv 2: HER2 geeni amplifikatsiooni täheldati Kuupäev ja allkiri, laborant: Kuupäev ja allkiri, patoloog: Hindamisjuhised: vt Värvumise tõlgendamine. (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 50/55

Maovähk Lisa 4 magu HER2 IQFISH pharmdx, kood GM333 Kordusloenduse hindamisskeem Tsükli teostamiskuupäev: Värvimistsükli ID logis: HER2 IQFISH pharmdx (Dako Omnis) partii: Proovi ID: Tuum nr HER2 (punane) CEN17 (roheline) Tuum nr Signaalid täiendavast 40 tuumast (1 40) HER2 CEN-17 Tuum nr HER2 (punane) (roheline) (punane) CEN-17 (roheline) 1 11 21 31 2 12 22 32 3 13 23 33 4 14 24 34 5 15 25 35 6 16 26 36 7 17 27 37 8 18 28 38 9 19 29 39 10 20 30 40 Kokku (1 10) Kokku (11 20) Kokku (21 30) Tuum nr Kokku (31 40) HER2 (punane) CEN-17 (roheline) Suhtarvu HER2/CEN-17 määramiseks loendage HER2 signaalid ning CEN-17 signaalid samas 40 tuumas ning jagage HER2 signaalide koguarv CEN-17 signaalide koguarvuga. Kirjendage tuumade 1 40 koguskoor allolevasse tabelisse. Koguskoor (1 40) Suhtarv < 2: HER2 geeni amplifikatsiooni ei täheldatud Suhtarv 2: HER2 geeni amplifikatsiooni täheldati Kuupäev ja allkiri, laborant: Kuupäev ja allkiri, patoloog: Hindamisjuhised: vt Värvumise tõlgendamine. HER2 CEN-17 Suhtarv HER2/CEN-17 (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 51/55

Maovähk Lisa 5 magu HER2 IQFISH pharmdx, kood GM333 Fluorestsentsmikroskoobi tehnilised andmed Dako soovitab kasutada analüüsis HER2 IQFISH pharmdx, (Dako Omnis), GM333 järgmisi seadmeid. 1. Mikroskoobitüüp Epifluorestsentsmikroskoop 2. Valgusallikas 100-vatine elavhõbedalamp (pidage valgustamisaja üle arvet) 3. Objektiivid Kudede esmaseks vaatlemiseks sobivad 16X või 20X objektiivid Võimsama suurenduse saavutamiseks, näiteks signaalide loendamiseks, soovitame kasutada ainult õliimersioonobjektiive, nt 100X. 4. Filtrid Filtrid on kujundatud individuaalselt spetsiifiliste fluorokroomide jaoks ja peavad olema vastavalt valitud. Dako soovitab kasutada spetsiifilist DAPI-filtrit koos kvaliteetse Texas Red/FITC topeltfiltriga. DAPI-filter, näiteks Chroma filter nr 31000 Texas Red/FITC topeltfilter, nt Omega Optical filter nr XF53 või Chroma filter nr 51006 Texas Red ja FITC monofiltreid võib kasutada kontrollimiseks ja loendamiseks Fluorokroom Ergastav lainepikkus Kiiratav lainepikkus FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Filtrid on spetsiifilised iga mikroskoobitüübi jaoks ja sobivate filtrite kasutamine on tõlgendamise jaoks oluline. Täpsemat teavet saate oma mikroskoobitarnijalt või Dako esindajalt. 5. Õli Mittefluorestseeruv õli Ettevaatusabinõud 50-vatise elavhõbedalambi kasutamine ei ole soovitatav Rodamiinfiltreid ei saa kasutada Kolmekordsete filtrite kasutamine ei ole soovitatav Optimeerimata mikroskoop võib põhjustada probleeme fluorestsentsisignaalide lugemisel. On oluline, et valgusallikas pole ületanud kõlblikkusaega ning et see on õigesti joondatud ja fokusseeritud. Kliendid peaksid jälgima ja järgima elavhõbedalambi tootja soovitusi. Mikroskoopi tuleb nõuetekohaselt hooldada ning enne tulemuste tõlgendamist tuleb veenduda, et elavhõbedalamp on õigesti joondatud. Hoidmaks ära fluorestsentsi kustumist, tuleks püüda proovi eksponeerida ergastavale valgusele nii vähe kui võimalik. Enne in situ fluorestsentshübridiseerimise alustamist soovitame teil konsulteerida mikroskoobikoostu sobivuse osas tootjaga või lugeda vastavat kirjandust. (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 52/55

Viited 1. Coussens L, Yang-Feng TL, Liao YC, Chen E, Gray A, McGrath J, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science. 1985;230:1132-9. 2. Muleris M, Almeida A, Malfoy B, Dutrillaux B. Assignment of v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2 (ERBB2) to human chromosome band 17q21.1 by in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet. 1997;76:34-5. 3. Kallioniemi OP, Kallioniemi A, Kurisu W, Thor A, Chen LC, Smith HS, et al. ERBB2 amplification in breast cancer analyzed by fluorescence in situ hybridization. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992;89:5321-5. 4. King CR, Kraus MH, Aaronson SA. Amplification of a novel v-erbb-related gene in a human mammary carcinoma. Science. 1985;229:974-6. 5. Persons DL, Bui MM, Lowery MC, Mark HF, Yung JF, Birkmeier JM, et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for detection of HER-2/neu amplification in breast cancer: a multicenter portability study. Ann Clin Lab Sci. 2000;30:41-8. 6. Rennstam K, Baldetorp B, Kytola S, Tanner M, Isola J. Chromosomal rearrangements and oncogene amplification precede aneuploidization in the genetic evolution of breast cancer. Cancer Res. 2001;61:1214-9. 7. Schwab M. Oncogene amplification in solid tumors. Semin Cancer Biol. 1999;9:319-25. 8. Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, Levin WJ, Ullrich A, McGuire WL. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science. 1987;235:177-82. 9. Borg A, Tandon AK, Sigurdsson H, Clark GM, Ferno M, Fuqua SA, et al. HER-2/neu amplification predicts poor survival in node-positive breast cancer. Cancer Res. 1990;50:4332-7. 10. Ross JS, Slodkowska EA, Symmans WF et al. The HER-2 receptor and breast cancer: ten years of targeted anti-her-2 therapy and personalized medicine. Oncologist 2009;14: 320-368. 11. Nichols DW, Wolff DJ, Self S, Metcalf JS, Jacobs D, Kneuper-Hall R, et al. A testing algorithm for determination of HER2 status in patients with breast cancer. Ann Clin Lab Sci. 2002;32:3-11. 12. Bilous M, Dowsett M, Hanna W, Isola J, Lebeau A, Moreno A, et al. Current perspectives on HER2 testing: a review of national testing guidelines. Mod Pathol. 2003;16:173-82. 13. Nielsen PE, Egholm M, editors. Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications. Norfolk NR18 0EH, England: Horizon Scientific Press. 1999. 14. Clinical and Laboratory Standards Institute. Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline Third Edition. CLSI document M29-A3. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2005. 15. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, FR 7163, February 28. 1992. 16. Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: CV Mosby Company. 1980. 17. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press. 1981. (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 53/55

18. Tsuda H, Akiyama F, Terasaki H, Hasegawa T, Kurosumi M, Shimadzu M, et al. Detection of HER-2/neu (c-erb B-2) DNA amplification in primary breast carcinoma. Interobserver reproducibility and correlation with immunohistochemical HER-2 overexpression. Cancer. 2001;92:2965-74. 19. Ellis IO, Dowsett M, Bartlett J, Walker R, Cooke T, Gullick W, et al. Recommendations for HER2 testing in the UK. J Clin Pathol. 2000;53:890-2. 20. Hanna W. Testing for HER2 status. Oncology. 2001;61 Suppl 2:22-30. 21. Ginestier C, Charafe-Jauffret E, Penault-Llorca F, Geneix J, Adelaide J, Chaffanet M, et al. Comparative multi-methodological measurement of ERBB2 status in breast cancer. J Pathol. 2004;202(3):286-98. 22. Olsen KE, Knudsen H, Rasmussen BB, Baslev E, Knoop A, Ejlertsen B, et al. Amplification of HER2 and TOP2A and deletion of TOP2A genes in breast cancer investigated by new FISH probes. Acta Oncol. 2004;59:795-805. 23. Jorgensen JT. Targeted HER2 Treatment in Advanced Gastric Cancer. Oncology. 2010;78:26-33. 24. Fujimoto-Ouchi K, Sekiguchi F, Yasuno H, Moriya Y, Mori K, Tanaka Y. Antitumor activity of trastuzumab in combination with chemotherapy in human gastric cancer xenograft models. Cancer Chemother Pharmacol. 2007;59:795-805. 25. Kim SY, Kim HP, Kim YJ, Oh do Y, Im SA, Lee D, et al. Trastuzumab inhibits the growth of human gastric cancer cell lines with HER2 amplification synergistically with cisplatin. Int J Oncol. 2008;32:89-95. 26. Matsui Y, Inomata M, Tojigamori M, Sonoda K, Shiraishi N, Kitano S. Suppression of tumor growth in human gastric cancer with HER2 overexpression by an anti-her2 antibody in a murine model. Int J Oncol. 2005;27:681-5. 27. Tanner M, Hollmen M, Junttila TT, Kapanen AI, Tommola S, Soini Y, et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase IIalpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol. 2005;16:273-8. 28. Bang YJ, Van Cutsem E, Feyereislova A, Chung HC, Shen L, Sawaki A, et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2- positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, openlabel, randomised controlled trial. Lancet. 2010; 376(9742):687-97. 29. Hofmann M, Stoss O, Shi D, Buttner R, van de Vijver M, Kim W, et al. Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer: results from a validation study. Histopathology. 2008;52:797-805. (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 54/55

Tingmärkide tähendus Katalooginumber Temperatuuripiirang Kõlblik kuni In vitro diagnostiline meditsiiniseade Kaitske päikesevalguse eest (lugege säilitamise jaotist) Tootja Lugege kasutusjuhendit Partii kood GHS-piktogramm (lugege ettevaatusabinõude jaotist) Tootja: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Taani Tel +45 44 85 95 00 Faks +45 44 85 95 95 www.dako.com Levitaja USAs: Dako North America Inc. 6392 Via Real Carpinteria, CA 93013, USA Tel 805/566-6655, Tasuta number: 800/235-5743 Tellimisteave: Tel 800/235-5763 Faks 805/566-6688 Tehniline tugi: Tel 800/424-0021 (129193-001) P04125EE_01_GM333/2015.07 lk 55/55