ENERGEETILISES METABOLISMIS OSALEVATE GEENIDE EKSPRESSIOON MÜOKARDIS JA HL-1 RAKULIINIS Mart Roosimaa TÜ arstiteaduskond EESTI TEADUSTE AKADEEMIA ÜLIÕPILASTÖÖDE KONKURSI VÕITJATE KONVERENTS 2008
Südamelihas töötab pidevalt Süda teeb 100 000 lööki ööpäevas Juhul kui löögisagedus kasvab suureneb ka südamerakkude energiavajadus
Energeetilise metabolismi kompartmentatsioon ATP tootmine mitokondrites Energia ülekanne mitokondritest ATPaasideni ATP kasutamine kontraktsiooniaparaadi ja ioonpumpade tööks Ingwall ja Weiss, 2004
Energiatranspordivõrkude integreeritud kommunikatsiooni skeem Dzeja ja Terzic, 2003
Rakusiseses energiaülekandes osalevate geenide sümbolid ja produktid Geeni sümbol Geeniprodukt AK1 Adenülaatkinaas 1 AK2 Adenülaatkinaas 2 CKB Kreatiinkinaas B CKM Kreatiinkinaas M Sarkomeerne CKMT2 mitokondriaalne kreatiinkinaas HK1 Heksokinaas 1 HK2 Heksokinaas 2
HL 1 rakud Rakuliini looja: dr. William Claycomb HL 1 kardiomüotsüüdid Beating HL 1 rakud (Claycomb et al., 1998) Non-beating HL 1 rakud (Pelloux et al., 2006)
HL 1 rakkudes paiknevad mitokondrid ebakorrapäraselt Hiir Braun et al., 2005 Inimese koda Seppet et al., 2005 B HL 1 Anmann et al., 2006 NB HL 1 Anmann et al., 2006 Laser konfokaalmikroskoospia abil saadud kujutised mitokondrite paigutusest kardiomüotsüütides. Mitokondrid on visualiseeritud fluorestseeruva ühendiga MitoTracker Red või MitoTracker Green
Töö hüpotees HL 1 rakkude ebakorrapärane struktuur võib mõjutada rakusisese energiaülekande molekulaarseid mehhanisme, sealhulgas ka energeetilises metabolismis osalevate geenide ekspressiooni.
Töö eesmärk Töö põhieesmärgiks oli võrrelda kreatiinkinaasi, adenülaatkinaasi ja heksokinaasi isoensüüme kodeerivate geenide ekspressiooni sellistes erineva struktuurilise organisatsiooniga rakkudes nagu beating ja non-beating HL 1 rakud inimese ja hiire kardiomüotsüüdid
Materjalid ja meetodid HL 1 rakud Beating Non-beating Hiire ja inimese müokard Reaalaja PCR (polümeraasi ahelreaktsioon) Summaarse RNA eraldamine ja analüüs RNA pöördtranskribeerimine cdna DNA kordistamine
TULEMUSED
Spetsiifiliste geeniproduktide akumuleerumine reaalajas ja nende PCRjärgne elektroforeetiline analüüs näitavad AK, CK ja HK geenide transkriptide avaldumist beating ja non beating HL 1 rakkudes. B HL 1 NB HL 1
Amplifikatsioonikõverad Fluorestsents Läve ületamine Referentsgeen DeltaCT Uuritav geen Fluorestsentsi algtase Lävetsüklite erinevus = 22 17=5 Lävetsükli number
AK, CK ja HK geenide mrna tase beating ja non-beating HL 1 rakkudes normaliseerituna hiire müokardile (x1000) Suhteline ekspressioon = 2 deltadelta CT (Livak ja Schmittgen, 2001) 5 14 eksperimendi tulemused; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 võrreldes hiire müokardiga; p < 0,05 võrreldes B HL 1 rakkudega
** ** ** ** ** ** ** ** ** ** Geenide ekspressioonitase beating (B) ja non-beating (NB) HL 1 rakkudes võrrelduna inimese kodade müokardiga. Suhteline ekspressioon on väljendatud kui 2 deltadeltact ** p <0.01 võrreldes inimese müokardiga; 5 14 eksperimendi tulemused.
Tsütokroomid http:// www.interscience.whiley.com ATP süntees oksüdatiivse fosforüülimise protsessis
c b aa3 Roti kardiomüotsüüdid 0.25 ± 0.01 0.18 ± 0.01 0,15 ± 0.01 NB HL-1 rakud 0.05 ± 0.01** 0.10 ± 0.03** 0.08 ± 0.02** Non-beating (NB) HL 1 rakkude tsütokroomide originaalspekter. Tabelis on esitatud tsütokroomide c, b ja aa3 sisaldus nanomoolides 1 mg tsellulaarse valgusisalduse kohta. Esitatud on aritmeetiline keskmine ± standardviga ** oluliselt erinev võrreldes vastava tsütokroomi kontsentratsiooniga roti kardiomüotsüütides
JÄRELDUSED 1. Madal CKM geeni ekspressioonitase tase HL 1 rakkudes, eriti non-beating rakkudes, on tõenäoliselt seotud asjaoluga, et nimetatud rakkudes ei ole müofibrillid täielikult välja kujunenud. 2. AK ja CK geenid avalduvad HL 1 rakkudes nõrgalt. See võib mõjutada energia ülekandemehhanisme ning kompensatoorselt esile kutsuda heksokinaasi isoensüümide poolt vahendatud ülekandesüsteemi. 3. Saadud tulemused näitavad, et energiaülekandes osalevate geenide ekspressioonimuster sõltub raku struktuurilise organiseerituse astmest.
Milles seisneb töö tähtsus? Raku energeetilist seisundit ja selle analüüsi peetakse tähtsaks haiguse prognoosi ja ravi efektiivsuse seisukohalt. Rakusisese energiaülekande uurimine võimaldab paremini mõista: elusrakkude ainevahetust ja rakukomponentide vahelisi seoseid mehhanisme, mis kutsuvad rakus esile haiguslikud protsessid Integreeritud energiaülekandevõrgustike uurimist võib pidada kaasaegse molekulaarsete süsteemide bioloogia küllaltki tähtsaks komponendiks. Eksperimentaalseid andmeid saab kasutada matemaatiliste mudelite loomisel, mille abil on võimalik kvantitatiivselt kirjeldada lihasraku energiaainevahetuse toimemehhanisme.
Tänuavaldused See töö on osa suuremast projektist Energeetilise metabolismi kompartmentaliseeritud süsteemid ja nende häired südame, maoepiteeli ja ajurakkudes, mis on saanud Eesti Teadusfondi uurimistoetust. Teadusteema juht: prof. Enn Seppet Ma olen tänulik ka Dots. Andres Piirsoole ja tema töögrupile Dr. Arno Ruusalepale
Tänan tähelepanu eest!