(i2)eestiskehtivaeuroopa patendi PATENDIKIRJELDUSE TOLGE

Suurus: px
Alustada lehe näitamist:

Download "(i2)eestiskehtivaeuroopa patendi PATENDIKIRJELDUSE TOLGE"

Väljavõte

1 CQ Tf o Ph EESTIVABARIIK PATENDIAMET (ii)ee-ep B1 (1) Int. Cl. A61K 31/499 (06.01) A61P 2/00(06.01) (i2)eestiskehtivaeuroopa patendi PATENDIKIRJELDUSE TOLGE () Registreeringu number: E (73) Patendiomanik: (11) Patendikirjelduse tolke number: EE-EP B1 (30) Prioriteediandmed: US P (96) Euroopa patenditaotluse esitamise kuupaev: (96) Euroopa patenditaotluse number: (97) Euroopa patendi vatjaandmisest teatamise kuupaev: (97) Euroopa patendi number: EP Patendikirjelduse tolke esitamise kuupsev: Patendikirjelduse tolke avalikustamise kuupaev: Neuren Pharmaceuticals Limited Level 1 PWC Tower, 188 Quay Street, Auckland 1141, NZ (72) Leiutise autorid: GLASS, Lawrence Irwin 74 Piney Branch Road, Takoma Park, Maryland 912, US B1CKERDIKE, Michael John 41 Waimaire Street, St. Heliers Auckland, NZ SNAPE, Michael Frederick 111 Thorkhill Road, Thames Ditton Surrey KT7 OUW, GB DE COGRAM, Patricia Perez Lastarria 1, piso 4, Santiago Centro Santiago, CL (74) Patendivolinik: Kaie Puur PatendiburooRestMark Metida Ol) Kompanii 1c, 04 Tartu, EE (4) Narve kaitsvad bitsuklilised iihendid ja meetodid nende kasutamiseks autismispektri hairete ja neuroloogiliste arenguhairete ravimisel EE-EP B1

2 EE EP B1 NÄRVE KAITSVAD BITSÜKLILISED ÜHENDID JA MEETODID NENDE KASUTAMISEKS AUTISMISPEKTRI HÄIRETE JA NEUROLOOGILISTE ARENGUHÄIRETE RAVIMISEL PRIORITEEDINÕUE Käesolevas rahvusvahelises patenditaotluses esitatakse prioriteedinõue Ameerika Ühendriikide ajutise patenditaotluse nr 61/98,329 suhtes, mis esitati 2. juulil 13 pealkirjaga Neuroprotective Bicyclic Compounds and Methods for Their Use in Treating Autism Spectrum Disorders and Neurodevelopmental Disorders, leiutise autorid Lawrence Irwin Glass, Michael John Bickerdike, Michael Fredrick Snape ning Patricia Perez de Cogram. LEIUTISE VALDKOND 1 Käesolev leiutis käsitleb uudseid bitsüklilisi ühendeid, mis on struktuuri poolest seotud diketopiperasiinidega, ja meetodeid nende ravialaseks kasutuseks. Täpsemalt käsitleb käesolev leiutis selliste ühendite närve kaitsvat aktiivsust. Täpsemalt käsitleb käesolev leiutis tsüklilise glütsüülproliini (cyclic Glycyl Proline, cpg ) ja selle analoogide, sealhulgas tsüklilise glütsüül-2-allüülproliini ( tsükliline G-2-allüülP või cg-2- allüülp või NNZ 291 ) ja nende farmatseutiliste kompositsioonide kasutust autismispektri häirete (autism spectrum disorder, ASD) ja neuroloogiliste arenguhäirete (neurodevelopmental disorder, NDD), nagu fragiilse X-i sündroomi (Fragile X Syndrome, FXS), ravis. TAUST 2 30 Autismispektri häireid (ASD) diagnoositakse üha enam. ASD-d on seotud arenguhäirete kogum, mida iseloomustavad sotsiaalse interaktsiooni ja kommunikatsiooni häired, piiratud huvid ning korduvad käitumised. Lisaks klassikalisele autismile või autistlikule häirele tunnistatakse Ameerika Psühhiaatrite Assotsiatsiooni (APA) diagnostilise ja statistilise psüühikahäirete käsiraamatu (DSM-) viiendas väljaandes ASD-ks Aspergeri sündroomi, laste desintegratiivset häiret ning täpsustamata pervasiivset arenguhäiret (Pervasive Developmental Disorder Not Otherwise Specified, PDD-NOS). Neuroloogilised arenguhäired (NDD) hõlmavad fragiilse X-i sündroomi (FXS), Angelmani sündroomi, tuberoosset skleroosset kompleksi, Phelani-McDermidi

3 2 EE - EP B sündroomi, Retti sündroomi, CDKL-mutatsioone (mis on ka assotsieerunud Retti sündroomi ja X-seoseliste varajases eas avalduvate krampide häirega) ja teisi. Paljusid, kuid mitte kõiki NDD-sid, põhjustavad geneetilised mutatsioonid ning seega nimetatakse neid mõnikord monogeenseteks häireteks. Mõnedel patsientidel, kellel on NDD-d, ilmnevad autismi käitumised ja sümptomid. NDD näitena on fragiilse X-i sündroom X-seoseline geneetiline häire, milles mõjutatud isikud on erineval määral vaimse puudega ja neil ilmnevad erinevad assotsieerunud psühhiaatrilised sümptomid. Kliiniliselt iseloomustavad fragiilse X-i sündroomi vaimne puue, hüperaktiivsuse ja tähelepanu probleemid, autismispektri sümptomid, emotsionaalne labiilsus ja epilepsia (Hagerman, 1997a). Fragiilse X-i sündroomi puhul ilmnev epilepsia on kõige sagedamini olemas lapsepõlves, kuid remiteerub seejärel järkjärgult täiskasvanuikka jõudmisel. Hüperaktiivsus on olemas ligikaudu 80 protsendil mõjutatud meestest (Hagerman, 1997b). Füüsilised tunnused, nagu esileulatuvad kõrvad ja lõualuu ning liigeste hüpervenitatavus on tihti olemas, kuid ei ole diagnostilised. Vaimne puue on sagedasim fenotüüpi määratlev tunnus. Üldjuhul on mehed raskemini mõjutatud kui naised. Varased muljed, et naised on mõjutamata, on asendunud spetsiifiliste õppimisraskuste ja teiste neuropsühhiaatriliste tunnuste olemasolu mõistmisega naistel. Meestel olemasolev õpiraskus muutub vanusega selgemalt määratletuks, ehkki selle pikaajaline toime peegeldab tõenäolisemalt arengutrajektooride laugemaks muutumist kui ilmset neurodegeneratiivset protsessi. Paralleelselt ajutalitluse kahjustumisega, mis ilmneb fragiilse X-i sündroomi puhul, esinevad muutused inimeste ajustruktuuris. MRT-skannimisuuringud näitavad, et fragiilne X-i sündroom on assotsieerunud suuremate ajumahtudega, kui eeldataks sobivatel kontrolliindiviididel, ja et see muutus korreleerub trinukleotiidi laienemisega FMRP-promootorpiirkonnas (Jakala et al., 1997). Mikroskoopilisel tasemel ilmnevad inimestel, kellel on fragiilse X-i sündroom, neuronaalse dendriitse struktuuri hälbed, täpsemalt ebaküpsete dendriitjätkete ebanormaalselt suur arv (Irwin et al., 00). Hetkel saadavalolevad NDD-de raviviisid on sümptomaatilised suunatud sümptomite ravile ja toetavad, nõudes multidistsiplinaarset lähenemisviisi. Varakult rakendatakse haridus- ja sotsiaalsete oskuste koolitust ja teraapiaid, et tegeleda õppimise viivituse ja sotsiaalsete häirete põhiprobleemidega. Tihti on nõutavad spetsiaalsed akadeemilised, sotsiaalsed, kutseõppe- ning tugiteenused. Ravimit, psühhoteraapiat või käitumisteraapiat võib kasutada koos esineva ärevuse, tähelepanu defitsiidi ja

4 3 EE - EP B1 hüperaktiivsuse sündroomi (Attention Deficit Hyperactivity Disorder, ADHD ), depressiooni, toimetulekut mittesoodustavate käitumiste, nagu agressiooni ning uneprobleemide ravimiseks. Epilepsiavastaseid ravimeid võib kasutada krampide kontrolli all hoidmiseks LEIUTISE OLEMUS Oleme eelnevalt näidanud patenditaotluses PCT/US04/02830, mis esitati 31. augustil 04, et tsükliline glütsüülproliin ( cpg ) ja selle analoogid, sealhulgas, kuid mitte ainult, tsükliline tsüklopentüül-cg-2-allüülp ja tsükliline G-2-allüülP) cg-2- allüülp ) on närve kaitsvad ja neuroregeneratiivsed. Hetkel ei ole efektiivset ASD-de või NDD-d ravi ja patsientidele osutatav meditsiiniline abi piirdub sümptomaatilise raviga, kasutades sotsiaalseid ja käitumuslikke sekkumisi. Leiutise autorid on nüüd avastanud, et siin avaldatud tsükliline G-2-allüülP ja teised bitsüklilised ühendid võivad olla efektiivsed ASD-de ja NDD-de ravis ning täpsemalt ebanormaalse sotsiaalse käitumise normaliseerimiseks. Avastasime ootamatult, et cg-2-allüülp-l on tugev ravitoime ärevusele, hüperaktiivsusele, mälule, õppimisele ja liigi jaoks tüüpilisele ebanormaalsele sotsiaalsele käitumisele ja korduvale käitumisele loomadel, kellel on fragiilse X-i sündroom ( FXS ) või muud ASD-d. Lisaks leidsime, et ERK1/2 ja Akt-i fosforüülimise muutused cg-2-allüülp-ga ravitud fmr1 väljalülitusega loomadel, võimaldavad ASD-de in vitro diagnostilist hindamist ning toetavad hüpoteesi, et fragiilse X-i sündroomi fenotüübid on muutunud mgiur-i ekspressiooni tulemus. Lisaks vähendas cg-2- allüülp manustamine oluliselt neuronaalsete jätkete arvu fmr1 väljalülitusega hiirtel. Kuna siin avaldatud in vivo-uuringuteks kasutatavatel fmr1 väljalülitusega loomadel on sama geneetiline mutatsioon mis inimestel, kellel on fragiilse X-i sündroom, võib käesoleva leiutise kohaste tsüklilise glütsüülproliini (cyclic Glycyl Proline, cgp ) ühendite, sealhulgas cg-2-allüülp, manustamine olla kasulik autismispektri häirete, neuroloogiliste arenguhäirete ja fragiilse X-i sündroomi sümptomite ravimisel inimestel. Lisaks leidsime ootamatult, et käesoleva leiutise kohased cgp-d suudavad ravida efektiivselt kahjulikke sotsiaalseid käitumisi ja korduvaid käitumisi loomadel, kellel on ASD-d, taastades seega normaalsemad sotsiaalsed interaktsioonid. Seega esitatakse käesoleva leiutise ühe eripäraga uudsed tsüklilised ühendid, millel on allpool kirjeldatud struktuurivalemid ja asendajad.

5 4 EE - EP B1 Mõnedes eripärades hõlmavad ühendid valemiga 1 asendajaid, kus X 1 on valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: NR', O ja S; X 2 on valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: CH2, NR', O ja S; 1 R 1, R 2, R 3, R 4 ja R 3 on sõltumatult valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: -H, -OR',-SR', -NR'R', -NO2, -CN, -C(O)R', -C(O)OR', -C(O) NR'R', -C(NR') NR'R', trihalometüül, halogeen, alküül, asendatud alküül, heteroalküül, asendatud heteroalküül, alkenüül, asendatud alkenüül, alkünüül, asendatud alkünüül, arüül, asendatud arüül, heteroarüül, asendatud heteroarüül, arüülalküül, asendatud arüülalküül, heteroarüülalküül ja asendatud heteroarüülalküül; iga R' on sõltumatult valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: -H, alküül, heteroalküül, alkenüül, alkünüül, arüül, arüülalküül, heteroarüül ja heteroarüülalküül, või R 4 ja R koos võetuna on -CH2-(CH2)N-CH2-, kus n on täisarv 0-6, või R 2 ja R 3 koos võetuna on -CH2-(CH2)N-CH2-, kus n on täisarv 0 6; tingimusel, et kui R 1 = metüül ja R 2 = R 3 = R 4 = H, siis R bensüül, ja kui R 1 = H, vähemalt üks R 2 ja R 3 hulgast H. Järgmistes eripärades esitatakse käesoleva leiutisega valemiga 1 ühend või selle farmatseutiliselt aktsepteeritav sool, stereoisomeer või hüdraat, milles R 1 = allüül, R 2 = R 3 = R 4 = R = H, X 1 = NH, X 2 = CH2 (tsükliline glütsüül-2-allüülproliin). 2 Järgmistes eripärades esitatakse käesoleva leiutisega farmatseutilised kompositsioonid, mis sisaldavad farmatseutiliselt aktsepteeritavat abiainet ja tsüklilise G-2allüülP-raviks efektiivset kogust. Järgmistes eripärades esitatakse käesoleva leiutisega meetodid, millega ravitakse looma, kellel on kognitiivne häire, mis hõlmab sellele loomale kompositsiooni efektiivse koguse manustamist, mis sisaldab tsüklilist G-2-allüülP-d. Järgmistes eripärades on ravitav loom inimene. JOONISTE LÜHIKIRJELDUS

6 EE - EP B1 Leiutist kirjeldatakse viitega selle konkreetsetele teostustele. Käesoleva leiutise muud eripärad on mõistetavad lähtuvalt joonistest, milles: 1 Joonis FIG 1A on graafik, mis näitab tsüklilise G-2-allüülP-ga ravi toimeid sooritusele Morrise veelabürindi testi (Morris Water Maze Test, MWMT) omandamisfaasis (päev 1 4) pärast skopolamiiniga töötlemist. Joonis FIG 1B on graafik, mis näitab tsüklilise G-2-allüülP-ga ravi toimeid latentsusele platvormikvadrandi suhtes MWMT sonditestis (päev ). Joonis FIG 1C on graafik, mis näitab aega, mis kulub platvormi leidmiseks omandamisfaasi 4. päeval loomadel 3 rühmas: (1) vehiikliga ravitud, (2) skopolamiini ja cg-2- allüülp-ga ravitud ja (3) skopolamiiniga töödeldud. Joonis FIG 2 on graafik, mis näitab aja erinevust, mis kulub tuttava vs. uudse eseme avastamisele sonditesti ajal päevadel 2 pärast ravi. Tuttavate esemete andmepunktid peegeldavad aja keskmist, mis kulub 3 tuttava eseme avastamisele. Uudse eseme äratundmise andmepunkt on tegelik aeg, mis kulub uudse eseme avastamisele. Joonis FIG 3 on graafik, mis näitab korrelatsiooni CA1-hipokampuse piirkonna AMPA-glutamaadi retseptori 1 värvimise ning uudse eseme ja tuttava eseme uurimisele kuluva aja suhtarvu vahel uudse eseme äratundmise testi (Novel Object Recognition Test, NORT) testimisfaasis päeval 24. Joonis FIG 4 on graafik, mis näitab cg-2-allüülp toimeid (t) AMPA GluR1-i tihedusele CA1 granulaarrakulises kihis päevadel 6 ja 24 võrreldes vehiikliga (veh). Joonis FIG on graafik, mis näitab cg-2-allüülp toimeid (t) AMPA GluR1 tihedusele CA1 stratum oriens'is päeval 24 pärast ravi Joonis FIG 6 on graafik, mis näitab cg-2-allüülp toimet presünaptilise värvimise tiheduse suurendamise trendile hipokampuse CA3-piirkonnas päeval 24 pärast ravi. Joonis FIG 7 on graafik, mis näitab cg-2-allüülp toimet presünaptilise värvimise tiheduse suurendamise trendile CA1-piirkonna stratum oriens'is päeval 24 pärast ravi.

7 6 EE - EP B1 Joonis FIG 8 on graafik, mis näitab cg-2-allüülp toimet presünaptilise värvimise tiheduse suurendamiseks CA1-piirkonna stratum radiatum'is päeval 24 pärast ravi. Joonised fig 9A, B, C on graafikud, mis näitavad cg-2-allüülp-ravi toimet NMDAR-1 tihedusele CA1 ja CA3 puhul. Joonis FIG on graafik, mis näitab cg-2-allüülp toimeid Krox24-värvimise tihedusele hipokampuse CA1-2-s. Joonis FIG 11 on graafik, mis näitab cg-2-allüülp toimeid vehiiklite arvule 0 nm 2 ruudus, mis asub postsünaptilise tiheduse lähedal keskeas rottide hipokampuse allpiirkondades CA3 ja CA1 (n = 2 igas rühmas). Joonis FIG 12 on graafik, mis näitab tsüklilise G-2-allüülP toimeid neuronaalsele elumusele loomadel pärast ekstsitotoksilist oksüdatiivset stressi. Joonis FIG 13 on graafik, mis näitab tsüklilise tsüklopentüülcg-2-allüülp toimeid neuronaalsele elumusele loomadel pärast ekstsitotoksilist oksüdatiivset stressi. 1 Joonis FIG 14 on graafik, mis näitab tsüklilise G-2-allüülP närve kaitsvaid toimeid loomadel, kellele rakendati üldist aju isheemiat. Joonis FIG 1 on graafik, mis näitab tsüklilise G-2-allüülP erinevate annuste toimeid neurokaitsele loomadel, kellele rakendati üldist aju isheemiat. 2 Joonised fig 16A D kujutavad kambrit (joonis FIG 16A), mida kasutatakse hipokampuse neuronite in vitro-uuringute jaoks. Joonis FIG 16B kujutab fotot hipokampuse neuronitest pärast 17 päeva kultuuris. Joonis FIG 16C kujutab GFP-märgistatud Fmr1 väljalülitusega hipokampuse neuroneid. Joonis FIG 16D kujutab fotot hipokampuse neuronitest Fmr1 väljalülitusega hiirtelt, keda on ravitud cg-2-2allüülp-ga. Joonis FIG 17 kujutab fotot avaväljaku testiseadmest, mida kasutatakse käesoleva leiutise kohase cg-2-allüülp toimete testimiseks. Joonis FIG 18 kujutab graafikut ajast T1, mis kulub avaväljakutestis metsiktüüpi loomadel ja fmr1 väljalülitusega loomadel, keda on ravitud kas vehiikli või cg-2- allüülp-ga.

8 7 EE - EP B1 Joonis FIG 19 kujutab graafikut lühiajalise mälu tulemustest avaväljakutestis metsiktüüpi loomadel ja fmr1 väljalülitusega loomadel, keda on ravitud kas vehiikli või cg-2-allüülp-ga. Joonis FIG kujutab graafikut pikaajalise mälu tulemustest avaväljakutestis metsiktüüpi loomadel ja fmr1 väljalülitusega loomadel, keda on ravitud kas vehiikli või cg-2-allüülp-ga. Joonis FIG 21 kujutab graafikut järjestikuste käiguradade testi tulemustest metsiktüüpi loomadel ja fmr1 väljalülitusega loomadel, keda on ravitud vehiikliga. Joonis FIG 22 kujutab graafikut järjestikuste käiguradade testi tulemustest metsiktüüpi loomadel ja fmr1 väljalülitusega loomadel, keda on ravitud cg-2- allüülp-ga. Joonis FIG 23 kujutab fotot kõrgendatud pluss-labürindist, mida on kasutatud käesoleva leiutise kohase cg-2-allüülp toimete uuringutes metsiktüüpi hiirtel ja fmr1 väljalülitusega hiirtel. 1 Joonis FIG 24 kujutab graafikut tulemustest kõrgendatud pluss-labürindi suletud haru testis metsiktüüpi loomadel ja fmr1 väljalülitusega loomadel, keda on ravitud kas vehiikli või cg-2-allüülp-ga. Joonis FIG 2 kujutab graafikut tulemustest kõrgendatud pluss-labürindi avatud haru testis metsiktüüpi loomadel ja fmr1 väljalülitusega loomadel, keda on ravitud kas vehiikli või cg-2-allüülp-ga. 2 Joonis FIG 26 kujutab graafikut tulemustest kõrgendatud pluss-labürindi keskme testis metsiktüüpi loomadel ja fmr1 väljalülitusega loomadel, keda on ravitud kas vehiikli või cg-2-allüülp-ga. Joonis FIG 27 kujutab fotot seadmest, mida on kasutatud hirmu konditsioneerimisele avalduvate cg-2-allüülp toimete uurimiseks metsiktüüpi ja fmr1 väljalülitusega hiirtel. Joonis FIG 28 kujutab graafikut tulemustest hirmu konditsioneerimise testis metsiktüüpi loomadel ja fmr1 väljalülitusega loomadel, keda on ravitud kas vehiikli või cg-2-allüülp-ga. 30 Joonised fig 29A E kujutavad fotosid pesitsemisskooridest, mida kasutatakse pesitsemiskäitumisele avalduvate cg-2-allüülp toimete hindamisel metsiktüüpi hiirtel ja fmr1 väljalülitusega hiirtel. Joonis FIG 29A kujutab skoori 1,

9 8 EE - EP B1 joonis FIG B kujutab skoori 2, joonis FIG 29C kujutab skoori 3, joonis FIG D kujutab skoori 4 ning joonis FIG 29E kujutab skoori. Joonis FIG 30 kujutab graafikut tulemustest seltsivuse testis metsiktüüpi loomadel ja fmr1 väljalülitusega loomadel, keda on ravitud kas vehiikli või cg-2- allüülp-ga. Joonis FIG 31 kujutab graafikut fosforüülitud ERK-i (phosphorylated ERK, perk) ekspressioon tasemete tulemustest metsiktüüpi loomadel ja fmr1 väljalülitusega loomadel, keda on ravitud kas vehiikli või cg-2-allüülp-ga. 1 Joonis FIG 32 kujutab graafikut pakt-i ekspressioon tasemete tulemustest metsiktüüpi loomadel ja fmr1 väljalülitusega loomadel, keda on ravitud kas vehiikli või cg-2-allüülp-ga. Joonis FIG 33A kuni 33F kujutavad graafikuid põletiku mediaatorite interleukiin 1-beeta ( IL1-beeta ) ja interleukiin 6 ( IL-6 ) ekspressioonile avalduvate PBBI ja cg-2-allüülp toimete tulemustest. Joonised fig 33A 33C kujutavad IL1-beeta tulemusi ja joonised fig 33D 33F kujutavad IL-6 tulemusi. Joonis FIG 34A kuni 34 H kujutavad graafikuid BAX-i ja BCL-2 ekspressioonile avalduvate PBBI ja cg-2-allüülp toimete tulemustest. Joonised fig 34A 34C kujutavad BAX-i ekspressiooni tulemusi. Joonis FIG 34D 34H kujutavad BCL2 ekspressioon tulemusi. Joonis FIG 3A kuni 3C kujutavad graafikuid ATF3 ekspressioonile avalduvate PBBI ja cg-2-allüülp toimete tulemustest kolmes erinevas ajapunktis. Joonis FIG 36A kujutab graafikuid mitme neuroplastilisusega seonduva geneetilise markeri ekspressioonile avalduvate PBBI ja cg-2-allüülp toimete tulemustest. 2 ÜKSIKASJALIK KIRJELDUS Mõisted 30 Alkenüül tähendab küllastumata hargnenud, sirge ahelaga või tsüklilist süsivesinikuradikaali, millel on vähemalt üks süsinik-süsinik-kolmikside. Radikaal võib olla kas cis- või trans-konformatsioonis topeltsidemete ümber. Näitlikud alkenüülrühmad hõlmavad allüüli, etenüüli, propenüüli, isopropenüüli, butenüüli,

10 9 EE - EP B1 isobutenüüli, tsüklopentenüüli ja sarnaseid. Mõnedes teostustes on alkenüülrühmad (C2-C6) alkenüül ning teistes teostustes võib olla allüül eriti kasulik. Alküül tähendab küllastunud hargnenud, sirge ahelaga või tsüklilist süsivesinikuradikaali. Näitlikud alküülrühmad hõlmavad metüüli, etüüli, isopropüüli, tsüklopropüüli, tert -butüüli, tsüklopropüülmetüüli, heksüüli ja sarnaseid. Mõnedes teostustes on alküülrühmad (C1-C6) alküül. Alkünüül tähendab küllastumata hargnenud, sirge ahelaga või tsüklilist süsivesinikuradikaali, millel on vähemalt üks süsinik-süsinik-kolmikside. Näitlikud alkünüülrühmad hõlmavad etünüüli, propünüüli, butünüüli, isobutünüüli ja sarnaseid. Mõnedes teostustes on alkünüülrühm (C2-C6) alkünüül. Arüül tähendab küllastumata tsüklilist süsivesinikuradikaali, mis on konjugeeritud π- elektroni süsteemiga. Näitlikud arüülrühmad hõlmavad fenüüli, naftüüli ja sarnaseid. Mõnedes teostustes on arüülrühm (C-C) arüül. 1 Arüülalküül tähendab sirge ahelaga alküüli, alkenüüli või alkünüülrühma, milles üks terminaalse süsinikuga seondunud vesinikuaatomitest on asendatud arüülrühmaga. Näitlikud arüülalküülrühmad hõlmavad bensüüli, naftüülmetüüli, bensülideeni ja sarnaseid. Kognitiivset häiret võib täheldada patsientidel, kellel on ASD-d, NDD-d, Alzheimeri tõbi, Parkinsoni tõbi, Lewy kehadega dementsus ja teised häired, samuti vananevatel loomadel, sealhulgas inimestel. Sisaldav ning sisaldab tähendab, sealhulgas, kuid mitte ainult, loetletud elemente. Kasvufaktor tähendab rakuväliselt aktiivset polüpeptiidi, mis stimuleerib rakku kasvama või vohama, interakteerudes raku retseptoriga Heteroalküül tähendab alküülosa, milles üks või enam süsinikuaatomit on asendatud teise aatomiga, nagu N, P, O, S jne. Näitlikud heteroalküülrühmd hõlmavad pürrolidiini, morfoliini, piperidiini, piperasiini, imidasolidiini, pürasolidiini, tetrahüdrofuraani, (C1-C) asendatud amiine, (C2-C6) tioeetreid ja sarnaseid. Heteroarüül tähendab arüülosa, milles üks või enam süsinikuaatomit on asendatud teise aatomiga, nagu N, P, O, S jne. Näitlikud heteroarüülrühmd hõlmavad karbasooli, furaani, imidasooli, indasooli, indooli, isokinoliini, puriini, pürasiini, pürasooli, püridasiini, püridiini, pürrooli, tiasooli, tiofeeni, triasooli ja sarnast.

11 EE - EP B Vigastus hõlmab ükskõik millist looma ägedat või kroonilist kahjustust, mis annab tulemuseks rakkude degeneratsiooni, düsfunktsiooni või surma närvisüsteemis. Sellised rakud hõlmavad neuroneid ja mitteneuroneid. Vigastus hõlmab insulti, sealhulgas mitehemorraagilist insulti, ajutraumat, loote distressiga seonduvat perinataalset asfüksiat nagu pärast loote lahtirebenemist emaka küljest, väädi ummistumist või seoses loote üsasisese kasvupeetusega, piisava elustamise või hingamise nurjumisega seotud perinataalset asfüksiat, peaaegu toimunud uppumise, peaaegu toimunud väikelapse äkksurma, süsinikoksiidi, ammoniaagi sissehingamise või muu gaasilise mürgistusega seonduvaid KNS-i raskekujulisi vigastusi, südameseisakut, koomat, meningiiti, hüpoglükeemiat ning epileptilist seisundit, südame pärgarteri šuntimisoperatsiooni, hüpotensiooni episoodide ja hüpertensiivsete kriiside ja ajutraumaga seotud tserebraalse asfüksia episoode. Tuleb mõista, et eeltoodud näited on ainult illustreerimiseks ning ei ole mõeldud olema täielik loend vigastustest, mida on võimalik ravida käesoleva leiutise kohaste ühendite ja meetoditega. Farmatseutiliselt aktsepteeritav abiaine tähendab abiainet, mis on kasulik farmatseutilise kompositsiooni valmistamisel, mis on üldjuhul ohutu, mittetoksiline ja soovitav ning mis hõlmab abiaineid, mis on aktsepteeritavad kasutamiseks veterinaarias ja inimtervishoius kasutatavates ravimites. Sellised abiained võivad olla tahked, vedelad, pooltahked või aerosoolkompositsioonide puhul gaasilised. Farmatseutiliselt aktsepteeritav sool tähendab soola, mis on farmatseutiliselt aktsepteeritav ja millel on soovitud farmakoloogilised omadused. Sellised soolad hõlmavad moodustuda võivaid sooli, milles ühendites olevad happelised prootonid on võimelised reageerima anorgaaniliste ja orgaaniliste alustega. Sobivad anorgaanilised soolad hõlmavad neid, mis on moodustunud leelismetallidega, näiteks naatriumi ja kaaliumi, magneesiumi, kaltsiumi ning alumiiniumi. Sobivad orgaanilised soolad hõlmavad neid, mis on moodustunud orgaaniliste aluste, nagu amiinalustega, näiteks etanoolamiini, dietanoolamiini, trietanoolamiini, trometamiini, N-metüülglükamiini jms. Sellised soolad hõlmavad ka happeliitsooli, mis on moodustatud anorgaaniliste hapetega (nt sool- ja vesinikbromiidhappega) ja orgaaniliste hapetega (nt äädikhappe, sidrunhappe, õunhappe ja alkaan- ning areen-sulfoonhappe, nagu metaansulfoonhappe ja benseensulfoonhappega). Kui on kaks happerühma, võib farmatseutiliselt aktsepteeritav sool olla monohappe monosool või dihappesool ning

12 11 EE - EP B1 sarnaselt, kui on olemas enam kui kaks happelist rühma, võivad osad või kõik sellised rühmad olla olemas sooladena. Terminil kaitserühm on tähendus, mis on sellega tavapäraselt orgaanilises sünteesis assotsieerunud, tähendab rühm, mis blokeerib selektiivselt üht või enamat reaktiivset saiti multifunktsionaalses ühendis, nii et keemilise reaktsiooni saab teostada selektiivselt teisel kaitsmata reaktiivsel saidil ning rühma saab eemaldada hõlpsalt pärast seda, kui selektiivne reaktsioon on lõpule jõudnud. Stereoisomeer on molekul, millel on tsüklilise G-2-allüülproliini struktuur, kuid millel on kiraalne kese. Termin tsükliline G-2-allüülproliin hõlmab kõiki stereoisomeere Asendatud tähendab seda, kus üks või enam vesinikuaatomit alküül-, heteroalküül-, alkenüül-, alkünüül-, arüül-, heteroarüül- või arüülalküülradikaalil on sõltumatult asendatud teise asendajaga. Asendajad hõlmavad järgmisi: -R', -OR', -SR', -NR'R', - NO2, -CN, -C(O)R', -C(O)OR',-C(O) NR'R', -C(NR') NR'R', -NR'-C(NR')-OR', -NR'- C(NR')-SR', NR'-C(NR')- NR'R', trihalometüül ja halogeen, kus iga R' on sõltumatult - H, alküül, heteroalküül, alkenüül, alkünüül, arüül, arüülalküül, heteroarüül või heteroarüülalküül. Sümptom või sümptomid tähendab üht või enam järgmistest: kognitiivne häire või kognitiivne düsfunktsioon, üks või enam nähtu või sümptomit järgmistest: mälu kaotus, ruumilise orientatsiooni kaotus, vähenenud õppimisvõime, vähenenud lühi- või pikaajalise mälu moodustamise võime, vähenenud episoodiline mälu, vähenenud mälu konsolideerimise võime, vähenenud ruumiline mälu, vähenenud sünaptogenees, vähenenud sünaptiline stabiilsus, täidesaatva funktsiooni defitsiidid, kognitiivse kaardistamise ja stseenimälu defitsiidid, deklaratiivse ja relatsioonilise mälu defitsiidid, konfiguraalsete või konjunktiivsete assotsiatsioonide vähenenud kiire omandamine, vähenenud kontekstispetsiifiline kodeerimine ja konkreetsete sündmuste otsimine, vähenenud episoodiline ja/või episoodilisesarnane mälu, ärevus, ebanormaalne hirmu konditsioneerimine, ebanormaalne sotsiaalne käitumine, korduv käitumine, ebanormaalne öine käitumine, krambihoogude aktiivsus, ebanormaalne liikumine, Fosfo-ERK1/2 ja Fosfo-Akt-i ebanormaalne ekspressioon ning bradükardia. Raviks efektiivne kogus tähendab kogust, mis haiguse ravimiseks loomale manustamisel on piisav haiguse või vigastuse ravi teostamiseks. Raviks efektiivne

13 12 EE - EP B1 kogus tähendab kogust, mis vähendab kahjulikke sümptomeid või leide, soodustab soovitavaid sümptomeid või leide ja/või ravib põhihäiret ja/või on raviv. Haiguse ravimine või ravi hõlmab haiguse esinemise ennetamist loomal, kellel on eelsoodumus haigusele, kuid kellel ei esine või ilmne veel haiguse sümptomid (profülaktiline ravi), haiguse inhibeerimine (selle arengu aeglustamine või peatamine), haiguse sümptomite või kõrvaltoimete leevendamine (sealhulgas palliatiivravi) ning haiguse leevendamine (haiguse taandumise põhjustamine). Implitsiitsed vesinikuaatomid (nagu vesinikud pürroolitsüklil jne) on jäetud valemist selguse huvides välja, kuid neid tuleb mõista olemasolevana. ATF3 Activating Transcription Factor 3 tähendab aktiveerivat transkriptsioonifaktorit 3 BAX tähendab apoptoosi regulaatorit BAX, samuti tuntud kui bcl-2- sarnane valk BLC2 alfa B-cell lymphoma-2 tähendab B-rakklümfoomi 2 1 IL1-beeta Interleukin 1-beta tähendab interleukiin 1-beetat IL-6 Interleukin-6 tähendab interleukiini 6 BDNF Brain Derived Neurotropic factor tähendab ajust pärinevat neurotroopset faktorit Cdh2 Cadherin-2 tähendab kadheriini 2 Cebpb CCAAT/enhancer-binding protein beta tähendab CCAAT/võimendajat siduvat valku beetat Crem cyclic-amp response element binding tähendab tsüklilise AMP vastuselementi siduvat 2 Egr1 Early Growth Response Protein 1 tähendab varase kasvuvastuse valku 1 Gria 4 Glutamate Receptor Ionotropic AMPA 4 tähendab glutamaadi retseptorit, ionotroopset AMPA 4 Grm Metabotropic Glutamate Receptor tähendab metabotroopse glutamaadi retseptorit

14 13 EE - EP B1 Mapk 1 Mitogen-Activated Protein Kinase 1 tähendab mitogeenaktiveeritud valgu kinaasi 1 MeCP2 Methyl cpg Binding Protein 2 tähendab metüüli cpg siduvat valku 2 Nr4a1 Nuclear Receptor Subfamily 4 Group A member 1 tähendab tuumaretseptori allperekonna 4 rühma A liiget 1, mis on samuti tuntud kui närvikasvufaktor IB Ntf3 Neurotrophin 3 tähendab neurotrofiini 3 Ntf4 Neurotrophin 4 tähendab neurotrofiini 4 Pcdh8 Protocadherin-8 tähendab protokadheriini 8 Plm1 Pre-mRNA Leakage Protein 1 tähendab pre-mrna lekke valku 1 Ppp3ca Protein Phosphatase 3, Catalytic Subunit, Alpha tähendab valgu fosfataasi 3, katalüütiline allühik, alfa Tnf Tumor Necrosis Factor tähendab tuumorinekroosifaktorit Autismispektri häired Autismispektri häired (ASD) on seotud arenguhäirete kogum, mida iseloomustavad sotsiaalse interaktsiooni ja kommunikatsiooni häired, piiratud huvid ning korduvad käitumised. Lisaks klassikalisele autismile või autistlikule häirele tunnistatakse Ameerika Psühhiaatrite Assotsiatsiooni (APA) diagnostilise ja statistilise psüühikahäirete käsiraamatu (DSM-) viiendas väljaandes ASD-ks Aspergeri sündroomi, laste desintegratiivset häiret ning täpsustamata pervasiivset arenguhäiret (PDD-NOS). Neuroloogilised arenguhäired (NDD) hõlmavad fragiilse X-i sündroomi (FXS), Angelmani sündroomi, tuberoosset skleroosset kompleksi, Phelani-McDermidi sündroomi, Retti sündroomi, CDKL-mutatsioone (mis on ka assotsieerunud Retti sündroomi ja X-seoseliste varajases eas avalduvate krampide häirega) ja teisi. Paljusid, kuid mitte kõiki NDD-sid, põhjustavad geneetilised mutatsioonid ning seega nimetatakse neid mõnikord monogeenseteks häireteks. Mõnedel patsientidel, kellel on NDD-d, ilmnevad autismi käitumised ja sümptomid. Kliinilised tööriistad ASD-de ja NDD-de hindamiseks

15 14 EE - EP B1 1 2 ASD-sid ja NDD-d võib hinnata, kasutades üht või enam kliinilist testi, näiteks Retti sündroomi loomuliku kulu / kliinilise raskusastme skaala, käitumishälvete nimekiri (Aberrant Behavior Checklist Community Edition, ABC) väljaanne kogukondadele, käitumishälvete nimekiri (stereotüüpia), Vinelands, haiguse raskusastme kliiniline üldmulje (Clinical Global Impression of Severity, CGI-S), hooldaja kurnatuse küsimustik (Caregiver Strain Questionnaire, CSQ), laste Yale'i-Browni obsessiivkompulsiivne skaala (Yale-Brown OC Scale, CYBOCS-PDD), lapsepõlve autismi hindamisskaala, korduvate käitumiste intervjuu, Nisongeri laste käitumise hindamisskaala, pervasiivse arenguhäire käitumise küsimustik, stereotüüpse käitumise skaala, korduva käitumise skaala, Rossago skaala, korduva käitumise küsimustik ning stereotüüpse käitumise skaala või üks või enam füsioloogilist testi, mis on valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: elektroentsefalogrammi (EEG) teravike sagedus, EEG sagedusalade üldine võimsus, käeliigutus, QTc ja südamelöögisageduse varieeruvus (heart rate variability, HRV) ning hingamise ebakorrapärasus võrreldes kontroll-loomadega, kellel ei ole nimetatud häiret. Nendest tööriistadest mõnede töökindlus ja asjakohasus, nagu näidatud tabelis 1 allpool. Käesolevas jaotises kasutatuna tähendab termin asjakohane tööriista, mis mõõdab kliiniliselt olulist tulemust hea kuni suurepärase töökindluse ja valiidsusega, kusjuures teave on saadaval kõikide asjassepuutuvate kategooriate kohta. Termin asjakohane tingimustega tähendab tööriista, mis mõõdab kliiniliselt olulist tulemust, mille puhul on asjassepuutuvad ainult teatud allskaalad, või see võib olla asjassepuutuv ainult noorema vanusevahemiku puhul. Terminid paljutõotav ja potentsiaalselt asjakohane tähendavad tööriista, mis mõõdab kliiniliselt olulist tulemust, kuid on arenev või sellel on ebaühtlane töökindlus ja valiidsus (nt hea kuni suurepärane töökindlus/valiidsus, kuid andmed ei ole saadaval kõikides kategooriates, kuid vähemalt 2-s, piisavad kõikides kategooriates. 30

16 1 EE - EP B1 Tabel 1 Kliinilised tööriistad, mida peetakse ASD-de ja NDD-de puhul kitsendatud ja korduvate käitumiste seisukohast asjakohaseks või asjakohasekstingimustega Mõõdik Tüüp Usaldusväärne ja valiidne Muutuse suhtes tundlik Tingimus CYBOCS-PDD Klinitsist (intervjuu) jah jah Resistentsuse element ei ole asjassepuutuv ABC-stereotüüpia informaator jah jah Ainult 7 elementi Korduva käitumise skaala informaator jah jah (vähemalt üks uuring)? Allskaalad vs. koguskoor Stereotüüpse käitumise skaala informaator jah (täskasvanud) ei ole näidatud Sobib madalama funktsioneerimise korral Korduva käitumise küsimustik informaator jah ei ole näidatud Atüüpilise skoori määramine Ärevust võib hinnata, kasutades üht või enam mõõdikut, sealhulgas ärevuse, depressiooni ja meeleolu skaalat (Anxiety, Depression and Mood Scale, ADAMS), laste ja nooruki sümptomite küsimustikku (Child and Adolescent Symptom Inventory, CASI), laste käitumise kontroll-loendit (Child Behavior Checklist, CBCL), laste mitmemõõtmelise ärevuse skaalat (Multidimensional Anxiety Scale for Children, MASC), laste autismi hindamisskaalat (Pediatric Autism Rating Scale, PARS), täiustatud laste ärevuse ja depressiooni skaalat (Revised Child Anxiety and Depression Scale, RCAD), laste ärevusega seonduvate häirete sõelumist (Screen for Child Anxiety Related Disorders, SCARED). Nisongeri laste käitumise hindamise vorm ning ärevuse diagnostilise intervjuu skaala (Anxiety Diagnostic Interview Scale, ADIS). Nendest tööriistadest mõnede töökindlus ja asjakohasus on esitatud allpool tabelis 2.

17 16 EE - EP B1 Tabel 2 Kliinilised tööriistad, mida peetakse ärevuse hindamiseks asjakohaseks tingimustega CASI-ärevus informaator jah Mõõdik Tüüp Usaldusväärne ja valiidne Tundlikkus muutuse suhtes jah (pilootandmed ASD puhul) Tingimus mittetäielik katvus Laste mitmemõõtmeline ärevuse skaala (MASC) Informaator ja enesearuanne jah jah (piiratud kasutus ASD puhul) sõltuvus keelest Laste ärevuse hindamisskaala (PARS) Klinitsist (intervjuu) jah jah (piiratud kasutus ASD puhul) sõltuvus keelest Ärevuse diagnostilise intervjuu skaala Klinitsist (intervjuu) jah jah (piiratud kasutus ASD puhul) kõrge funktsioneerimisvõimega isikud Potentsiaalselt asjakohased kliinilised tööriistad ärevuse hindamiseks ASD-de ja NDDde puhul on näidatud allpool tabelis 3.

18 17 EE - EP B1 Tabel 3 Potentsiaalselt asjakohased kliinilised tööriistad ärevuse hindamiseks ASD-de ja NDD-de puhul Mõõdik Tüüp Usaldusväärne ja valiidne Muutuse suhtes tundlik Märkus SCARED Informaator ja enesearuanne jah jah (piiratud kasutus ASD puhul) sõltuvus keelest ADAMS informaator jah ei ole näidatud meeleolu ja ärevus; andmed täiskasvanutel RCADS Informaator ja enesearuanne jah ei ole näidatud meeleolu ja ärevus 1 Sotsiaalset kommunikatsiooni võib hinnata, kasutades kliinilisi tööriistu, näiteks ABAS- II valdkonna skoorid, käitumishälvete nimekiri (ABC) letargia / sotsiaalne eemaldumine, ADI-R, autismidiagnostika vaatlusskaala üldine (Autism Diagnostic Observation Scale-Generic, ADOS-G) uued raskusastme skoorid, autismi mõju mõõdik, autismispektri hindamisskaalad, autismi ravi hindamise kontroll-loend (Autism Treatment Evaluation Checklist, ATEC), palliviskemäng, käitumise hindamise skaala (BAS), laste käitumise hindamise süsteem, 2. väljaanne, BASC-2 (sotsiaalse suhtes olulised allskaalad), täidesaatva funktsiooni käitumise hindamise küsimustik, California verbaalse õppimise ülesanne laste versioon (Verbal Learning Task-Children's Version, VLT-C) ja modifitseeritud VLT-C (MVLT-C), hooldaja ja lapse Interaktsioon, Jahromi 09, CGI, lapsepõlve autismi hindamisskaala (Childhood Autism Rating Scale, CARS), laste sotsiaalse käitumise küsimustik, keele põhialuste kliiniline hindamine (Clinical Evaluation of Language Fundamentals, CELF-3 ja 4) pragmaatika profiil, kommunikatsiooni ja sümboolse käitumise skaalad (Communication and Symbolic Behavior Scales, CSBS), afektiivse kõneülesande mõistmine, üldise usalduse skaala, Gilliami autismi hindamisskaala (Gilliam Autism Rating Scale, GARS), tähelepanu liitmõõdik ESCS-ilt (Joint Attention Measure from the ESCS, JAMES), Let's Face It!, spontaanse ekspressiivse keele vaatluslik

19 18 EE - EP B1 1 hindamine (Observational Assessment of Spontaneous Expressive Language, OSEL), vanemate hindamise küsimustik, Nagaraj et al., 06, Parent's Rating Questionnaire, Chan et al., 09, Pervasive Developmental Disorder Behavior Inventory (Pervasive Developmental Disorder Behavior Inventory, PDD-BI) (lühike versioon saadaval: PDD- BI sõelumise versioon), mõtete lugemine filmides täiskasvanu, mõtete lugemine filmides laps, mõtete silmades lugemise ülesanne parandatud (Reading the Mind in the Eyes Task-Revised, RMET-R) täiskasvanu, mõtete silmades lugemise ülesanne parandatud (RMET-R) laps, mõtete lugemine hääles täiskasvanu, sotsiaalse kommunikatsiooni küsimustik (Social Communication Questionnaire, SCQ), sotsiaalse vastamisvõimelisuse skaala, sotsiaalsete oskuste parandamise süsteem (Social Skills Improvement System, SSiS), vaimu teooria test ning VABS sotsialiseerumine ja kommunikatsioon. Sotsiaalse kommunikatsiooni hindamiseks kasutatavatest tööriistadest peetakse järgmisi asjakohaseks tingimustega : käitumishälvete nimekiri (ABC): Letargia / sotsiaalse eemaldumise allskaala, BASC-2: sotsiaalsed oskused, eemaldumine, funktsionaalne allskaala, CSBS, ESCS, JAMES, SSiS, Vinelandi kohaneva käitumise skaalade sotsialiseerumise ja kommunikatsiooni allskaalad. Tööriistad, mida peetakse potentsiaalselt asjakohaseks hõlmavad ABAS-II: kontseptuaalne ja sotsiaalne valdkond, ADGS raskusastme skoore, autismispektri hindamisskaalasid: sotsiaalne kommunikatsioon, CSBQ: mõistmise allskaalad ning PDD-BI-d. Autism 2 30 Klassikaline autism on äärmiselt varieeruv neuroloogilise arengu häire. Tavaliselt diagnoositakse see imikueas või varases lapsepõlves, selged sümptomid ilmnevad tihti 6. elukuust ja kujunevad välja eluaastaks. DSM--s esitatud kriteeriumite kohaselt nõuab autismi diagnoos sümptomite triaadi olemasolu, mis hõlmab (a) sotsiaalse interaktsiooni häireid, (b) kommunikatsioonihäireid ning (c) piiratud ja korduvaid huve ning käitumisi. Muud düsfunktsioonid, nagu atüüpiline söömine, on samuti sagedased, kuid ei ole diagnoosi seisukohast olulised. Nendest häiretest on diagnoosi seisukohast eriti olulised sotsiaalse interaktsiooni häired ja autismi diagnoosi jaoks peab olema olemas kaks järgmistest häiretest: (i) häired mitme mitteverbaalse käitumise (nt silmside) kasutamisel sotsiaalse interaktsiooni reguleerimiseks;

20 19 EE - EP B1 (ii) arengutasemele kohaste eakaaslastega suhete tekkimise puudumine; (ii) naudingu, huvide või saavutuste jagamise spontaanse taotlemise puudumine; (iv) sotsiaalse või emotsionaalse vastastikususe puudumine. 1 Kommunikatsioonihäired autismis võivad ilmneda ühel või enamal viisil järgmistest: kõne arengu viibimine (või täielik puudumine); vestluse algatamise või hoidmise võime märkimisväärne häire; keele stereotüüpne ning korduv kasutus ja/või spontaanse kujutlusel põhineva mängimise puudumine. Piiratud, korduvad ja stereotüüpsed käitumismustrid on samuti nõutavad diagnoosi jaoks nagu keskendumine ühele või enamale huvile, mis peetakse intensiivsuse poolest ebanormaalseks, jäik kinnipidamine rutiinidest või rituaalidest, korduvad motoorsed maneerid ja/või püsiv keskendumine esemete osadele. Viimasena on autismi diagnoosi jaoks vaja, et vähemalt ühe valdkonna (st sotsiaalse interaktsiooni, keele või kujutlusel põhineva mängimise) funktsioneerimise häire algaks nooremalt kui 3 aasta vanuselt. Aspergeri sündroom 2 Aspergeri sündroom on sarnane autismiga ning jagab sellega teatud tunnuseid. Aspergeri sündroomi nagu autismi iseloomustab sotsiaalse interaktsiooni häire ja sellega kaasnevad piiratud ning korduvad huvid ja käitumine. Seega iseloomustab Aspergeri sündroomi diagnoosi sama häirete triaad mis autismi. Siiski erineb see teistest ASD-dest selle poolest, et ei ole keele või kognitiivse arengu üldist aeglustumist ega indiviidi keskkonna vastu tuntava huvi defitsiiti. Pealegi on Aspergeri sündroom tavaliselt vähem raske sümptomatoloogiaga kui klassikaline autism ja Aspergeri sündroomiga patsiendid võivad funktsioneerida iseseisvalt ning elada suhteliselt normaalset elu. Lapse desintegratiivne häire 30 Lapse desintegratiivne häire (childhood disintegrative disorder, CDD), mis tuntakse ka Helleri sündroomina, on seisund, milles lapsed arenevad normaalselt kuni 2 4 aasta vanuseni (st hiljem kui autismi ja Retti sündroomi puhul), kuid ilmutavad seejärel raskekujulist sotsiaalsete, kommunikatsiooni- ning muude oskuste kadu. Lapse desintegratiivne häire on väga sarnane autismiga ja mõlemad hõlmavad normaalset

21 EE - EP B1 arengut, millele järgneb keele, sotsiaalse mängimise ning motoorsete oskuste oluline kadu. Siiski esineb lapse desintegratiivne häire tavaliselt hiljem kui autism, hõlmab oskuste järsemat kadu ja on palju vähem sage. CDD diagnoos sõltub eelnevalt omandatud oskuste järsust kadumisest kahes või enamas valdkonnas järgmistest: keel, sotsiaalsed oskused, mängimine, motoorsed oskused (nt kõndimis-, ronimis-, haaramis- jne võime järsk vähenemine), soole või põie kontroll (vaatamata eelnevale potilkäimise õpetamisele). Arenguoskuste kadu võib olla järsk või toimuda päevade kuni nädalate jooksul või olla järk-järgulisem. Täpsustamata pervasiivne arenguhäire (PDD-NOS) Täpsustamata pervasiivne arenguhäire (PDD-NOS) on ASD, millega kirjeldatakse patsiente, kellel ilmnevad osad, ent mitte kõik teiste hästi määratletud ASD-dega seotud sümptomid. ASD diagnoosi põhikriteeriumis hõlmavad raskusi teistega suhtlemisel, korduvaid käitumisi ja kõrgenenud tundlikkust teatud stiimulite suhtes. Neid kõiki võib leida eespool kirjeldatud ASD-de puhul. Siiski on nii autismil, Aspergeri sündroomil, Retti sündroomil kui ka CDD-l muid tunnuseid, mis võimaldavad nende spetsiifilist diagnoosi. Kui sellest neljast häirest ühe konkreetset diagnoosi ei ole võimalik panna, kuid ASD on ilmne, pannakse PDD-NOS-i diagnoos. Sellise diagnoosi võivad põhjustada sümptomid, mis algavad hilisemas eas kui selles, mis on rakendatav spektri teiste seisundite puhul. Retti sündroom Retti sündroom (RTT) on neuroloogiline arenguhäire, mis mõjutab peaaegu eranditult naisi (1 elussünd 000-st). Kuni hiljutise ajani liigitati RTT autismispektri häireks (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, neljas, parandatud väljaanne (DSM-IV-R)). Hetkel mõjutab see USA-s ligikaudu patsienti (Retti sündroom Research Trusti andmed). Retti sündroomi diagnoosi puhul on iseloomulikud järgmised sümptomid: arengu häire alates vanusest 6 18 kuud; pea kasvu kiiruse aeglustumine alates vahemikust 3 kuud kuni 4 aastat; raske keele häire; korduvad ja stereotüüpsed käeliigutused ning kõnnaku häired, näiteks varvastel kõndimine või ebakindel jäikade jalasäärtega kõndimine. Lisaks on hulk toetavaid kriteeriume, mis võivad aidata diagnoosida Retti sündroomi, kuid ei ole diagnoosi seisukohast olulised. Need hõlmavad hingamisraskusi, EE-häireid, hooge, lihaste rigiidsust ja spastilisust, skolioosi (selgroo kõverdumist), hammaste kiristamist, pikkuse suhtes väikseid käe-

22 21 EE - EP B1 ning jalalabasid, kasvupeetust, vähenenud keharasva ja lihasmassi, ebanormaalset une struktuuri, ärrituvust või agitatsiooni, mälumis- ja/või neelamisraskusi, kehva vereringet ning kõhukinnisust. 1 2 RTT esimesed nähud algavad tavaliselt alates elukuust koos arengu- ja kasvukiiruse aeglustumisega. Sellele järgneb regressioonifaas (tavaliselt lastel vanuses 1 4 aastat), pseudostatsionaarne faas (vanuses 2 aastat) ning edasine progressiivse hilise motoorse halvenemise olek. RTT sümptomid hõlmavad kasvu järsku aeglustumist, keele- ja motoorsete oskuste regressiooni, sealhulgas sihikindlate käeliigutuste asendumist stereotüüpsete liigutustega, autistlikke tunnuseid, paanikataolisi atakke, unetsükli häireid, treemoreid, hooge, hingamisdüsfunktsioone (episoodiline apnoe, hüperpnoe), apraksiat, düstooniat, düskineesiat, hüpotooniat, progressiivset küfoosi või skolioosi ja rasket kognitiivset häiret. Enamik RTT patsiente elab täiskasvanuks raskete puuetega ja vajab ööpäevaringset hooldamist. Teadete kohaselt põhjustab 8 9% RTT juhtudest mutatsioon Mecp2-geenis (Amir et al Nat Genet 23:18 188; Retti sündroom Research Trust), mis kodeerib metüül-cpg-d siduvat valku 2 (MeCP2). Mecp2 asub X-kromosoomil (asukoht Xq28) ja seetõttu on geeni mutatsioonid meestel tavaliselt letaalsed. Ehkki RTT on geneetiline häire, on vähem kui 1% dokumenteeritud juhtumitest päritud; peaaegu kõik Mecp2 mutatsioonid esinevad de novo, kusjuures kaks kolmandikku on põhjustatud mutatsioonidest 8 CpG-dinukleotiidis (R6, R133, T18, R168, R2, R270, R294 ja R306), mis asuvad kolmandal ning neljandal eksonil. MeCP2 on valk, mis seob metüleeritud CpG-dinukleotiide, et rakendada KNS-is DNA transkriptsioonilist vaigistamist. MeCP2 vähenemise või puudumise põhitoime näib olevat dendriitjätkete arengu ja sünapside moodustumise häire. MeCP2 näib korreleeruvat ajaliselt aju küpsemisega, mille tõttu ilmnevad sümptomid tavaliselt umbes 18. elukuul. ASD-de ühiste tunnuste ilmnemine 30 ASD-sid koos vaadeldes on selge, et kõigi vormi puhul on ilmnevate sümptomite suhtes ühiseid tunnuseid. Need ühised tunnused on normaalsete sotsiaalsete pädevuste häired ja korduvad käitumised. Kõikidel peale Aspergeri sündroomi ilmneb ka järjekindlalt aeglustunud intellektuaalne areng, mis avaldub kõige sagedamini keeleoskuste puudujäägina. Kognitiivne kadu võrreldes vanuse normaalsete

23 22 EE - EP B1 parameetritega on tihti üsna märkimisväärne autismi, Retti sündroomi, CDD ja PDD- NOS-i puhul. ASD-de geneetilised mudelid Valiidsuse pakkumiseks peavad ASD-de loommudelid näitama kliiniliste tingimustega sarnaseid sümptomeid ja omama mõistlikul määral nominaalset valiidsust nende sümptomite etioloogia suhtes. On teada, et klassikalist autismi võib põhjustada palju erinevaid geneetilisi häireid ning ei arvata, et üks geneetiline defekt põhjustab enam kui paari protsenti autismi juhtudest. Tegelikult on viimastest uuringutest ilmnenud kromosoomide asukohtade arvukaid struktuurilisi de novo-variatsioone, mis on arvatavasti ASD aluseks, lisaks haruldastele pärilikele geneetilistele defektidele (Marshall et al., 08; Sebat et al., 07). Seega on koopiaarvu variatsioon (copy number variation, CNV), geenijärjestuste translokatsioon ja inversioon või enamal põhisaidil, sealhulgas 1p, q, 7q, 1q, 16p, 17p ning Xq, kaardistatud ASD-lookustena. Siiski vaatamata ASD-d põhjustavale polügeensele taustale ja etioloogia keerukusele on teada, et teatud geneetilised defektid võivad tekitada ASD-d. Osad kõige paremini iseloomustatud defektidest tekivad geenide kromosoomaberratsioonidest, mis kodeerivad postsünaptilise tiheduse valkude klastrit, sealhulgas neuroligin-3 (NLGN3), neuroligin-4 (NLGN4), neureksiin-1α (NRXN1) ja Shank3 (Sebat et al., 07). NLGN3 ja NLGN4 on postsünaptilised rakuadhesioonimolekulid, mis esinevad glutamaatergilistes sünapsides. Neil on oma roll presünaptilise kontakti koordineerimisel postsünaptilise saidiga ning nad interakteeruvad ka postsünaptilise kinnitusvalguga Shank3. NLGN3 ja NLGN4 mutatsioone täheldatakse ASDpopulatsioonis ning need moodustavad võib-olla 1% kõikidest ASD-de juhtudest (Lintas ja Persico, 08). Jamain ja kolleegid teatasid esimesena NLGN3 missenssmutatsioonist ja NLGN4 raaminihkemutatsioonist kahel sugulussuhetes mitteoleval indiviidil, põhjustades vastavalt Aspergeri sündroomi ning klassikalist autismi (Jamain et al., 03). Ehkki NLGN3 või NLGN4 mutatsioonide esinemissagedus ASD-populatsioonis on kahtlemata madal (tegelikult ei täheldatud Kanadas korraldatud 96 ASD-patsiendi uuringus selliseid mutatsioone; Gauthier et al., 0), on prekliinilistes uuringutes kinnitatud, et neuroligiinide mutatsioonid võivad tekitada tegelikult autistlike sümptomite mudeli. Seega põhjustab hiirtel sama R41C missenssmutatsiooni tekitamine NLGN3-s, millest on kliiniliselt teatatud, mutantse

24 23 EE - EP B1 hiiretüve, millel ilmneb vähenenud sotsiaalne interaktsioon ja suurenenud inhibeeriv sünaptiline ülekanne (Tabuchi et al., 07) Seega kujutab R41C mutatsioon hiirel NLGN3 mutatsioonil põhinevat ASD mudelit. Sellisel juhul põhjustab mutatsioon NLGN3 positsioonis R41 funktsiooni saamise mutatsiooni. Seevastu saavutatakse hiirtel NLGN4 kliinilise mutatsiooni modelleerimine NLGN4 funktsiooni kao mutatsiooni abil (klassikaline väljalülitusega mudel). Selles mudelis ilmneb mutantsetel hiirtel sotsiaalse interaktsiooni defitsiit ja vähenenud ultrahelihäälitsemine (Jamain et al., 08). Kommunikatsioonidefitsiidid on kliiniliste ASD-de puhul keskse tähtsusega ja NLGN4 väljalülitusega hiirtel toetab ultrahelihäälitsuste vähenemine isastelt hiirtelt, kes puutuvad kokku metsiktüüpi emaste hiirtega, tüve nominaalset valiidsust ASD mudelina. Presünaptilised neureksiinvalgud indutseerivad postsünaptilist diferentseerumist vastasdendriitides postsünaptiliste neuroligiinteisikutega toimuvate interaktsioonide kaudu. NeureksiiN-1α (NRXN1) geeni mutatsioonidest on teatatud arvukates uuringutes (Sebat et al., 07; Marshall et al., 08; Kim et al., 08; Yan et al., 08) ning neid täheldatakse koopiaarvu variantide kujul. Nagu NLGN-i mutatsioonide puhulgi, kui hiirtel tekitatakse NRXN1-geeni mutatsioon (geeni funktsiooni täieliku väljalülituse kujul), tekib teatud ASD-laadsete tunnustega mutantne tüvi (Etherton et al., 09). Nendel NRXN1 väljalülitusega hiirtel ilmnes vähenemine hipokampuse miniatuurse ekstsitatoorse postsünaptilise voolu (miniature excitatory postsynaptic current, mepsc) sageduses ja erutusvoolude vähenenud sisend-väljund-suhtes. See elektrofüsioloogiline toime on seotud vähenenud ekstsitatoorse ülekandega hipokampuses. Lisaks vähenenud ekstsitatoorsele neurotransmissioonile ilmneb NRXN1 väljalülitusega hiirtel suurem impulsieelne inhibitsioon, ehkki sotsiaalsele käitumisele ei näi mõju avalduvat (Etherton et al., 09). Jagades neureksiin-nlgn-i transsünaptilise konstrukti teatud tunnuseid, on raku adhesioonimolekul 1 (cell adhesion molecule 1, CADM1) immunoglobuliinide pere valk, mis on olemas pre- ja postsünaptiliselt ning mis on kaasatud sünaptilise rakuülese adhesiooni aktiivsusse (Biederer et al., 02). CADM1-geeni mutatsioone on tuvastatud ASD-patsientidel ja need näivad esindavat nende seisundite täiendavat võimalikku põhjust (Zhiling et al., 08).

25 24 EE - EP B CADM1 väljalülitusega hiirte analüüsist ilmneb, et nendel loomadel ilmneb suurenenud ärevusega seotud käitumine, sotsiaalse interaktsiooni häire ning sotsiaalse mälu ja äratundmise häire. Lisaks ilmnevad CADM1 väljalülitusega hiirtel kehvemad motoorsed oskused (Takayanagi et al., ). Need düsfunktsioonid on jällegi kooskõlas ASD sümptomatoloogiaga. 21q13 kustutuse sündroom (samuti tuntud kui Phelani-McDermidi sündroom), on haruldane geneetiline häire, mida põhjustab mikrokustutus 22. kromosoomi q13.3 terminaalses otsas. Seda mikrokustutust tuvastatakse tüüpilisel geneetilisel skriinimisel harva ja diagnoosi kinnitamiseks on soovitatav fluorestsentsi in situhübridisatsioonitest. Viimased uuringud näitavad, et sündroomi põhjustavad vead geenis Shank3, mis kodeerib normaalse neuronaalse funktsioneerimise seisukohast üliolulist postsünaptilise tiheduse valku. Huvitaval kombel on vead selles geenis olnud seotud ASD-ga ja 22q13 kustutuse sündroom võib sageli tuua ASD-diagnoosi (Durand et al., 07; Moessner et al., 07; Sykes et al., 09). Arvestades 22q13 kustutuse sündroomi ja sellest tuleneva ASD diagnoosi tihedat seost, on töötatud välja mutatsiooni mutantne hiirmudel. Shank3 väljalülitusega hiirel ilmneb mitu defitsiiti, mis peegeldavad ASD sümptomeid, sealhulgas vähenenud ultrahelihäälitsused (st vähenenud sotsiaalne kommunikatsioon) ja hiirtevahelise sotsiaalse interaktsiooni aja häire. Lisaks on nendel hiirtel ka hipokampuse CA1 ekstsitatoorse transmissiooni häire, mida mõõdetakse erutusvoolude ja pikaajalise võimendamise (long-term potentiation, LTP) häire sisendväljund-suhtega. Arvatakse, et LTP on füsioloogiline protsess, mis on mälu moodustumise ja konsolideerumise aluseks. Seega ilmneb mudelil NLGN4 väljalülitusega hiirega sarnane fenotüüp, mis on kooskõlas ASD-ga. Nagu märgitud, on 22q13 kustutuse sündroom ise väga haruldane. Siiski annab see teavet selle kohta, kuidas konkreetsetel geenidel võib olla kaasatud ASD-de etioloogias määrav roll. Lisaks Shank3-le näitab see häire täiendavat võimalikku geenidefekti ASD puhul. Umbes 0 kirjeldatud 22q13 kustutuse sündroomi juhtumist on kõigil peale ühe geenikustutus, mis ulatub Shank3-st kaugemale ja hõlmab täiendavat geeni, mida tuntakse Islet BraiN-2 (EB2) geenina (Sebat et al., 07). IB2- valk interakteerub paljude teiste valkudega, sealhulgas mitogeenaktiveeritava valgu (mitogen-activated protein, MAP) kinaaside ning amüloideellasvalguga, näib mõjutavat valkude liiklust neuriitides ja on rikastatud postsünaptiliste tiheduste juures (Giza et al.,

26 2 EE - EP B1 ). Hiirtel, kellel valk puudub (IB2 / väljalülitusega hiirtel), ilmneb sotsiaalse interaktsiooni häire (sotsiaalse nuusutamise ja suhtluse aja vähenenud aeg), vähenenud uurimine ning kognitiivsed ja motoorsed defitsiidid (Giza et al., ). See käitumuslik fenotüüp oli seotud vähenenud ekstsitatoorse ülekandega tserebellaarsetes rakkudes. Nagu Shank3-geeni funktsiooni täieliku väljalülituse puhul, on IB2-mutatsiooni fenotüüp seega ASD-ga kooskõlas. Lisaks eespool kirjeldatud postsünaptilise tiheduse valkude defektide loommudelitele võivad autismi põhjustada muud monogeneetilised sündroomid, mis jagavad erinevaid tunnuseid ASD-dega Hiljuti on määratud fragiilse X-i sündroom teise häirete perekonda, mida nimetatakse neuroloogilisteks arenguhäireteks (NDD). Kirjeldustes siin ei eristata häire ametliku klassifikatsiooni alusel. Kui tulevikus üks või teine ASD või NDD klassifitseeritakse ümber, rakenduvad käesolevad kirjeldused ja käesolevaga avaldatu siin nendele uutele klassifikatsioonidele olenemata nende nimedest. Fragiilse X-i sündroom Fragiilse X-i sündroomi (FXS) põhjustab ühe trinukleotiidi geenijärjestuse (CGG) ekspansioon X-kromosoomil, mis põhjustab finr1-geeni kodeeritava valgu mitteekspresseerimist. FMR1 (fragile X mental retardation 1 fragiilse X-i vaimne alaareng 1) on närvide normaalseks arenguks vajalik valk. Fragiilse X-i sündroom võib põhjustada lapsel autismi (Hagerman et al., ); 2 6%-l kõikidest lastest, kellel on diagnoositud autism, on põhjuseks FMR1-geeni mutatsioon. Lisaks on ligikaudu 30%- l FXS-iga lastest teatud määral autism ning veel 30%-l on diagnoositud PDD-NOS (Hagerman et al., ). Tegelikult on fragiilse X-i sündroom sagedasim teadaolev autismi põhjustav geen. FMR1 väljalülitusega hiired on arendatud FXS-i mudelina ja seega on näidatud, et täiendava mudelina annab fmr1-geeni mutatsioon tulemuseks dendriitjätkete ebanormaalse arengu ja kärbituse (Comery et al., 1997) koos dendriitsete kinnitusvalkude (sealhulgas shank1) ja glutamaadiretseptorite allühikute seonduva düsregulatsiooniga postsünaptilistes tihedustes (Schütt et al., 09). Need dendriitide morfoloogia toimed annavad tulemuseks LTP häire korteksis ja amügdaloidkehas (Zhao et al., 0) ning hipokampuses (Lauterborn et al., 07) ja kognitsiooni häire (Kreuger et al., 11) ning sotsiaalse ärevuse suurenemise (Spencer et al., 0).

27 26 EE - EP B1 Retti sündroom Erinevalt autismi, Aspergeri sündroomi ja CDD ja PDD-NOS ASD-dest näib Retti sündroomil olevat peaaegu monogeenne alus ning seda on võimalik modelleerida hiirtel nõuetekohase nominaalse valiidsusega. Arvatakse, et Retti sündroomi põhjustab kuni 96%-l juhtudest Mecp2-geeni defekt (Zoghbi, 0). Seetõttu pakuvad MeCP2 väljalülitusega mutantsed hiired loommudelit kliinilise Retti sündroomi kõikide tunnustega, fenotüübiga, mis näitab osalist kattuvust NLGN4, Shank3 ning IB2 väljalülitusega ASD-mudelitega. Seega ilmneb MeCP2 väljalülitusega hiirtel selge LTP häire hipokampuses koos vastava sotsiaalse ja ruumimälu vähenemise (Moretti et al., 06) ning esemete äratundmise häirega (Schaevitz et al., ). Seega on inimestel esinevatel ASD-del palju ühiseid tunnuseid loomadel, sealhulgas närilistel, esinevate kognitiivsete ja arenguhäiretega. Seega võimaldavad ASD-de teraapiate uuringud närilistega, nagu hiirte ja rottidega, mõistlikult prognoosida inimestel saadavaid tulemusi. 1 Leiutisekohased ühendid Käesoleva leiutise teatud teostused hõlmavad tsüklilise prolüül-glutamaadi ( cpg ) uudseid derivaate, millel on struktuurid, nagu kirjeldatud allpool. Teatud teostustes hõlmavad ühendid valemiga 1 asendajaid, kus X 1 on valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: NR', O ja S; X 2 on valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: CH2, NR', O ja S; 2 R 1, R 2, R 3, R 4 ja R on sõltumatult valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: -H, -OR',-SR', -NR'R', -NO2, -CN, -C(O)R', -C(O)OR', -C(O) NR'R', -C(NR') NR'R', trihalometüül, halogeen, alküül, asendatud alküül, heteroalküül, asendatud heteroalküül, alkenüül, asendatud alkenüül, alkünüül, asendatud alkünüül, arüül, asendatud arüül, heteroarüül, asendatud heteroarüül, arüülalküül, asendatud arüülalküül, heteroarüülalküül ja asendatud heteroarüülalküül; iga R' on

28 27 EE - EP B1 sõltumatult valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: -H, alküül, heteroalküül, alkenüül, alkünüül, arüül, arüülalküül, heteroarüül ja heteroarüülalküül; või R 4 ja R koos võetuna on -CH2-(CH2)N-CH2-, kus n on täisarv 0 6; või R 2 ja R 3 koos võetuna on -CH2 (CH2)N-CH2-, kus n on täisarv 0 6; tingimusel, et kui R 1 = metüül ja R 2 = R 3 = R 4 = H, siis R bensüül, ja kui R 1 = H, vähemalt üks R 2 ja R 3 hulgast H. Järgmistes teostustes hõlmavad ühendid valemiga 1 asendajaid, kus R 1 = metüül, R 2 = R 3 = R 4 = R = H, X 1 = NH, X 2 = CH2; R 1 = allüül, R 2 = R 3 = R 4 = R = H, X 1 -NH, X 2 = CH2; R 1 = R 2 = R 3 = H, R 4 = R = metüül, X 1 = NH, X 2 = CH2; R 1 = R 4 = R = H, R 2 = R 3 = metüül, X 1 -NH, X 2 = CH2. Leiutise teistes teostustes hõlmavad ühendid valemiga 1 asendajaid, kus R 4 ja R koos võetuna on -CH2-(CH2)n -CH2- ja R 1 = metüül, R 2 = R 3 = H, n = 0, X 1 = NH, X 2 = CH2; 1 R 1 = metüül, R 2 = R 3 = H, n = 2, X 1 = NH, X 2 = CH2; R 1 = allüül, R 2 = R 3 = H, n = 0, X 1 -NH, X 2 = CH2; R 1 = allüül, R 2 = R 3 = H, n = 2, X 1 = NH, X 2 = CH2. R 1 = metüül, R 2 = R 3 = H, n = 3, X 1 = NH, X 2 = CH2; R 1 = allüül, R 2 = R 3 = H, n = 3, X 1 = NH, X 2 = CH2. 2 Leiutise järgmistes teostustes hõlmavad ühendid valemiga 1 asendajaid, kus R 1 = metüül või allüül, R 2 = R 3 = R 4 = H ja R on valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: aminohapete külgahelad: alaniin, arginiin, asparagiin, asparagiinhape, tsüsteiin, glutamiinhape, glutamiin, histidiin, isoleutsiin, leutsiin, lüsiin, metioniin, proliin, seriin, treoniin, trüptofaan, türosiin, valiin, norvaliin, norleutsiin, tsitrulliin, ornitiin, homotsüsteiin, homoseriin, alloisoleutsiin, isovaliin, sarkosiin ja sarnased. Leiutise järgmistes teostustes hõlmavad ühendid valemiga 1 asendajaid, kus R' = metüül, R 2 = R 3 = metüül, R 4 = R = H, X 1 = NH ja X 2 = S; R 1 = allüül, R 2 = R 3 = metüül, R 4 = R = H, X 1 = NH ning X 2 = S.

29 28 EE - EP B1 Vastava ala asjatundjad mõistavad, et eeltoodud struktuuride kujutised võivad sisaldada kiraalseid keskmeid, mille arv sõltub erinevatest asendajatest. Kiraalsus võib olla igas keskmes kas R või S. Struktuurijoonised võivad esindada ainult üht võimalikest tautomeersetest, konformatsioonilistest diastereomeersetest või enantiomeersetest vormidest ning tuleb mõista, et leiutise hõlmab ükskõik millist tautomeerset, konformatsioonilist isomeerset diastereomeerset või enantiomeerset vormi, mis ilmutab bioloogilist või farmakoloogilist aktiivsust, nagu siin kirjeldatud. Farmakoloogia ja kasulikkus 1 Tsüklilist glütsüül-2-allüülproliini (cg-2-allüülp) kirjeldatakse Ameerika Ühendriikide kasuliku mudeli taotluses nr 11/399,974, mis esitati 7. aprillil 06, pealkirjaga Cyclic G-2Allyl Proline in Treatment of Parkinson's Disease, mis on nüüd USA patent nr 7,776,876, väljastatud 17. augustil, Ameerika Ühendriikide kasuliku mudeli taotluses nr /70,39, mis esitati 2. märtsil 06 pealkirjaga Neuroprotective Bicyclic Compounds and Methods for Their Use, mis on nüüd USA patent nr 8,067,42, PCT rahvusvaheline patenditaotlus nr PCT/US04/028308, pealkirjaga Neuroprotective Bicyclic Compounds and Methods for Their Use, Ameerika Ühendriikide ajutine patenditaotlus seerianr 60/499,96, mis esitati 3. septembril 03, pealkirjaga Neuroprotective Bicyclic Compounds and Methods for Their Use, ning Ameerika Ühendriikide patenditaotlus nr 13/043,21, mis esitati 8. märtsil 11, pealkirjaga Cyclic Glycyl-2- AllylProline Improves Cognitive Performance in Impaired Animals. Käesoleva leiutise teatud eripärad hõlmavad tsüklilise G-2-allüülP kasutust neurodegeneratiivsete seisunditega vananemisega seotud kognitiivse häire ravis või olukordades, milles kognitiivne häire leitakse ilma ilmse neurodegeneratsioonita Skopolamiini kasutatakse tavaliselt Alzheimeri tõvega assotsieerunud koliinergilise hüpofunktsiooni loommudelites. Pärast skopolamiiniga töötlemist täheldatud funktsionaalsed defitsiidid hõlmavad neid, mis leiduvad inimesest patsientidel, kellel on Alzheimeri tõbi. Seega prognoosib skopolamiiniga töötlemine mõistlikult kognitiivset häiret, mis leidub inimeste haiguste puhul. Lisaks jäljendab skopolamiiniga töötlemine kognitiivset düsfunktsiooni inimestel, kellel ei ole neurodegeneratiivseid häireid. cg-2-allüülp, mis manustatakse loomadele, keda on töödeldud skopolamiinindutseeritud kognitiivse düsfunktsiooniga, tekitab kliinilise paranemise

30 29 EE - EP B1 1 nendel loomadel, sarnaselt terapeutilise paranemisega, mida täheldatakse inimestel, kellel on koliinergiline hüpofunktsioon. Näiteks Alzheimeri tõvega assotsieerunud koliinergiline hüpofunktsioon. Seega prognoosivad tsüklilise G-2-allüülP skopolamiiniga töödeldud loomade toimete uuringud mõistlikult toimeid, mida täheldatakse inimestel, kellel on koliinergiline düsfunktsioon. Muud toimeained võib manustada koos käesoleva leiutise kohase ühendiga. Sellised teised toimeained võib valida rühmast, mis koosneb näiteks kasvufaktoritest ja assotsieerunud derivaatidest, näiteks insuliinisarnasest kasvufaktorist 1 (insulin-like growth factor-i, IGF-I), insuliinisarnasest kasvufaktorist 2 (IGF-II), tripeptiidist GPE, transformeerivast kasvufaktorist β1, aktiviinist, kasvuhormoonist, närvikasvufaktorist, kasvuhormooni siduvast valgust ja/või IGF-i siduvatest valkudest. Täiendavad ühendid hõlmavad glütsüül-2-metüülprolüülglutamaati ja/või teisi ühendeid, mis on avaldatud USA patenditaotluses nr /1,864, mis on nüüd USA patent nr 7,041,314, väljastatud 9. mail 06. Terapeutilised rakendused Leiutisekohased kompositsioonid ja meetodid leiavad kasutust loomade, nagu inimesest patsientide, ravis, kellel on kognitiivne häire ja ASD-de ja NDD-dega assotsieerunud sümptomid. Veelgi üldisemalt leiavad leiutisekohased kompositsioonid ja meetodid kasutust imetajate, nagu inimesest patsientide, ravis, kellel on mälu häire, vaimne puue, nõrgenenud sotsiaalne interaktsioon, kommunikatsioonihäired, kitsendatud ja korduvad huvid ja käitumised ja hood. Farmatseutilised kompositsioonid ja manustamine 2 30 Tsüklilist G-2-allüülP-d võib manustada ravimi või ravimpreparaadi osana. See võib hõlmata leiutisekohase ühendi kombineerimist ükskõik millise farmatseutiliselt asjakohase kandeaine, adjuvandi või abiainega. Kandeaine, adjuvant või abiaine valik on mõistagi tavaliselt sõltuv rakendatavast manustamisviisist. Üldjuhul võib manustada käesoleva leiutise kohased ühendid raviks efektiivsetes kogustes ükskõik millisel tavapärasel viisil, mis on tehnika tasemes tuntud, kas üksikult või koos teiste traditsiooniliste raviainetega ravitava haiguse jaoks. Raviks efektiivne kogus võib erineda laias ulatusest olenevalt haigusest või vigastusest, raskusastmest, ravitava looma vanusest ja suhtelisest tervisest, ühendite võimekusest ning muudest teguritest. Antiapoptootiliste, põletikuvastaste ja antinekrootiliste toimeainetena võivad

31 30 EE - EP B tsüklilise G-2-allüülP-raviks efektiivsed kogused olla vahemikus 0,001 0 milligrammi looma massi kilogrammi kohta, kusjuures madalamad annused, nagu 0,001 0,1 mg/kg on asjakohased manustamiseks läbi tserebrospinaalvedeliku, nagu intratserebroventrikulaarse manustamise teel, ning kõrgemad annused, nagu 1 0 mg/kg on asjakohased manustamiseks meetoditega, nagu oraalse, süsteemse (nt transdermaalse) või parenteraalse (nt intravenoosse) manustamise teel. Vastava valdkonna asjatundja suudab tarbetu eksperimenteerimiseta oma asjatundlikkuse ja käesolevaga avaldatu alusel määrata käesoleva leiutise kohase ühendi raviks efektiivse koguse konkreetse haiguse või vigastuse puhul. Tsüklilist G-2-allüülP-d ja teisi cgp-ga seotud ühendeid võib manustada perifeerselt ükskõik millise tehnika tasemes tuntud perifeerse viisi teel. Need võivad hõlmata parenteraalseid viise, näiteks süstimist perifeersesse vereringesse, subkutaanset, intraorbitaalset, oftalmilist, intraspinaalset, intratsisternaalset, paikset, infusiooni (kasutades näiteks toimeainet aeglaselt vabastavaid seadmeid või minipumpasid, nagu osmootilisi pumpasid või nahaplaastreid), implantaati, aerosooli, inhalatsiooni, skarifikatsiooni, intraperitoneaalset, kihnusisest, intramuskulaarset, intranasaalset, oraalset, bukaalset, transdermaalset, pulmonaarset, rektaalset või vaginaalset. Kompositsioonid võib formuleerida parenteraalseks manustamiseks inimestele või teistele imetajatele raviks efektiivsetes kogustes (nt kogustes, mis kõrvaldavad või vähendavad patsiendi patoloogilise seisundi), et anda eespool kirjeldatud neuroloogiliste haiguste teraapia. Soovitavalt võimaluse korral manustamisel antiapoptootilise, põletikuvastase ja antinekrootilise toimeainena võib tsüklilist G-2-allüülP-d manustada oraalselt. Käesoleva leiutise kohase ühendi kogus sellises kompositsioonis võib varieeruda ulatuslikult olenevalt kompositsiooni tüübist, üksikannuse suurusest, abiainete liigist ja teistest teguritest, mis on vastava valdkonna asjatundjatele hästi tuntud. Üldjuhul võib lõplik kompositsioon sisaldada 0,0001 protsenti massi järgi (massi%) kuni massi% käesoleva leiutise kohast ühendit, eelistatavalt 0,001 1 massi%, kusjuures ülejäänu on abiaine või abiained. Muud mugavad manustamisviisid hõlmavad subkutaanset süstimist (nt lahustatud füsioloogiliselt ühilduvas kandeaines, nagu 0,9% naatriumkloriid) või otsemanustamist KNS-i. Kasutades stereotaktilisi seadmeid ja loomade KNS-i täpseid kaarte, võib ühendi süstida otse närvikahjustuste kohta. Sellised manustamisviisid võivad olla eriti

32 31 EE - EP B1 1 soovitud olukordades, milles perfusiooni selles asukohas ohustab kas vähenenud vaskulaarne perfusioon või vähenenud aju-seljaajuvedeliku (cerebral spinal fluid, CSF) vool sellesse piirkonda. Näited hõlmavad manustamist lateraalse tserebroventrikulaarse süstimise teel või läbi kirurgiliselt sisestatud šundi patsiendi aju lateraalsesse ajuvatsakesse, intravenoosselt, otse süstimisega soovitud asukohta, kas otse või kaudselt vereringe või teiste viiside kaudu. Fraasiga otse või kaudselt vereringe kaudu mõtleme cg-2-allüülp manustamist ükskõik millisesse koesse, millel on verevool, mis on piisav toimeaine viimiseks vereringesse. Mittepiiravad näited hõlmavad nahka, nina, neelu, seedetrakti või muud sellist kude. Manustamisel sellisesse koesse absorbeerib toimeaine kude, kus toimeaine siseneb koe rakuvahevedelikku ning seejärel absorbeerivad selle veenulid, kapillaarid, arterioolid või lümfijuhad. Toimeaine kantakse seejärel üldisse süsteemsesse vereringesse, kus selle võib viia mõjutatud kohta, sealhulgas ajusse. Kui toimeaine manustatakse subkutaanselt või peritoneaalselt, absorbeerib toimeaine külgnev kude ning toimeaine siseneb seejärel vereringesse lokaalselt ning viiakse seejärel kohale üldisse vereringesse, kus selle võib transportida ajusse. Kui toimeaine läheneb hematoentsefaalsele barjäärile, võib toimeaine seejärel hajuda ajusse, kas närvikoesse või tserebrospinaalvedelikku, kus selle saab viia kohale närvikudedesse. Ühendi efektiivset kogust KNS-is võib suurendada ühendi eelravimvormi manustamise teel, mis sisaldab leiutisekohast ühendit ja kandeainet, kus kandeaine on liidetud leiutisekohase ühendiga sidestuse teel, mis on vastuvõtlik lõikamisele või digereerimisele patsiendis. Kasutada võib ükskõik millist sobivat sidestust, mis lõigatakse või digereeritakse pärast manustamist. Siiski ei ole taotlejate poolt kavatsust välistada teised manustamise vormid Leiutise täiendavates teostustes võib närvifunktsiooni taastamine loomal hõlmata tsüklilise G-2-allüülP terapeutilise koguse manustamist kombinatsioonis teise närve kaitsva toimeainega, mis on valitud näiteks kasvufaktorite ja assotsieerunud derivaatide (insuliinisarnase kasvufaktori 1 (IGF-I), insuliinisarnase kasvufaktori 2 (IGF-II), transformeeriva kasvufaktori β1, aktiviini, kasvuhormooni, närvikasvufaktori, kasvuhormooni siduva valgu, IGF-i siduvate valkude (eriti IGFBP-3), aluselise fibroblastide kasvufaktori, happelise fibroblastide kasvufaktori, hst/kfgk-geeniprodukti, FGF-3, FGF-4, FGF-6, keratinotsüütide kasvufaktori, androgeenindutseeritud kasvufaktori hulgast. FGF-ide pere täiendavad liikmed hõlmavad näiteks järgmisi: int-

33 32 EE - EP B , fibroblastide kasvufaktori homoloogiline faktor 1 (fibroblast growth factor homologous factor-1, FHF-1), FHF-2, FHF-3 ja FHF-4, keratinotsüütide kasvufaktor 2, gliiat aktiveeriv faktor, FGF- ning FGF-16, tsiliaarne neurotroofne faktor, ajust pärinev kasvufaktor, neurotrofiin 3, neurotrofiin 4, luu morfogeenne valk 2 (bone morphogenetic protein 2, BMP-2), gliiarakkude liinist pärinev neurotroofne faktor, aktiivsusest sõltuv neurotroofne faktor, tsütokiinide leukeemiat inhibeeriv faktor, onkostatiin M, interleukiin, α-, β-, γ- või konsensusinterferoon ja tuumorinekroosifaktori alfa (tumour necrosis factor alfa, TNF-α). Närve kaitsvate raviainete muud vormid hõlmavad näiteks järgmisi: klometiasool; kinureniinhape, Semax, takroliimus, L-treo-1- fenüül-2-dekanoüülamino-3-morfolino-1-propanool, adrenokortikotropiin-(4-9) analoog [ORG 2766] ja disotsilpiin (MK-801), selegiliin; glutamaadi antagonistid nagu NPS6, GV260, MK-801, GV26; AMPA antagonistid nagu 2,3-dihüdroksü-6-nitro-7- sulfamoüülbenso(f)kinoksaliin (NBQX), LY ning LY300164; põletikuvastased ained, mis on suunatud adressiini MAdCAM-1 ja/või selle integriini α4 retseptorite vastu (α4β1 ja α4β7), nagu anti-madcam-lmab MECA-367 (Ameerika Tüüpkultuuride Kollektsiooni (American Type Culture Collection, ATCC) registreerimisnumber HB- 9478). Tsüklilist G-2-allüülP-d ja teisi cgp-ga seotud ühendeid manustatakse sobivalt toimeainet pidevalt vabastava süsteemi abil. Sobivad näited toimeainet pidevalt vabastavatest kompositsioonidest hõlmavad poolläbilaskvaid polümeermaatrikseid vormitud toodete kujul, näiteks kilesid või mikrokapsleid. Toimeainet pidevalt vabastavad maatriksid hõlmavad polülaktiide (USA patent nr 3,773,919; EP 8,481), L-glutamiinhappe ja gamma-etüül-l-glutamaadi kopolümeere (Sidman et al., 1983, Biopolymers: 22: 47 6), polü(2-hüdroksüetüülmetakrülaati) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res.: ), etüleenvinüülatsetaati (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res.: ) või polü-d-(-)-3-hüdroksübutüürhapet (EP 133,988). Toimeainet pidevalt vabastavad kompositsioonid hõlmavad ka liposoomi kaasahaaratud ühendit. Ühendit sisaldavad liposoomid valmistatakse iseenesest tuntud meetoditega: DE 3,218,121, EP 2,322, EP 36,676, EP 88,046, EP 143,949, EP 142,641, Jaapani patenditaotlus , USA patent nr 4,48,04 ja 4,44,4 ning EP 2,324. Tavaliselt on liposoomid väikest (alates või umbes ongströmi) unilamellaarset tüüpi, milles lipiidisisaldus on suurem kui 30 mooliprotsenti kolesterooli, kusjuures valitud proportsiooni kohandatakse tõhusaima teraapia saavutamiseks.

34 33 EE - EP B Parenteraalseks manustamiseks võib ühes teostuses olla tsükliline G-2-allüülP formuleeritud üldjuhul, segades igaüht soovitud puhtuse astmega, üksikannuse süstitavas vormis (lahus, suspensioon või emulsioon), farmatseutiliselt või parenteraalselt, aktsepteeritava kandeainega, see tähendab, sellisega, mis on rakendatud annustes ja kontsentratsioonides saajatele mittetoksiline ja mis on ühilduv ravimvormi teiste koostisosadega. Käesoleva leiutise kohase ühendi kohaleviimiseks limaskestakoesse võib lisada ühendi geelravimvorm. Pärast kohaleviimist limaskesta (nt suuõõnde, seedetrakti, pärasoole) võib toimeaine hajuda geelist välja või geel võib laguneda, vabastades seeläbi toimeaine koesse, kus see võib absorbeeruda vereringesse. Näitlikud geelravimvormid võivad hõlmata neid, mis on valmistatud karboksüpolüsahhariididega, nagu karboksümetüültselluloos, karboksüetüültselluloos, kitiin, kitosaan, tärklis, tselluloos, valkudega, nagu hüaluroonhape, või teiste polümeeridega, nagu polüvinüülpürolidiin, polüvinüülalkoholide ning teiste tehnika tasemes tuntud geelmaterjalidega. Üldjuhul valmistatakse ravimvormid, viies tsüklilise G-2-allüülP kokkupuutesse vedelate kandeainete või peenestatud tahkete kandeainete või mõlematega. Seejärel kujundatakse saadus vajaduse korral soovitud ravimvormiks. Eelistatavalt on kandeaine parenteraalne kandeaine, eelistatavamalt lahus, mis on isotooniline retsipiendi verega. Näited sellistest kandeainevehiiklitest hõlmavad vett, soolalahust, Ringeri lahust, puhverdatud lahust ning dekstroosi lahust. Mittevesilahusvehiiklid, nagu fikseeritud õlid ja etüüloleaat on ka siin kasulikud. Kandeaine sisaldab sobivalt väiksemaid lisandite koguseid, nagu aineid, mis võimendavad isotoonilisust ja keemilist stabiilsust. Sellised materjalid on saajatele rakendatud annustes ja kontsentratsioonides mittetoksilised ning hõlmavad puhvreid, nagu fosfaat, tsitraat, suktsinaat, äädikhape ning teised orgaanilised happed või nende soolad; antioksidante, nagu askorbiinhape; madalmolekulaarseid (vähem kui umbes kümme jääki) polüpeptiide, näiteks polüarginiin või tripeptiidid; valke, nagu seerumi albumiin, želatiin või immunoglobuliinid; hüdrofiilseid polümeere, nagu polüvinüülpürrolidoon; glütsiini; aminohappeid, nagu glutamiinhape, asparagiinhape, histidiin või arginiin; monosahhariide, disahhariide ning teisi süsivesikuid, sealhulgas tselluloos või selle derivaadid, glükoos, mannoos, trehaloos või dekstriinid; kelaadimoodustajaid, nagu EDTA; suhkrualkohole, nagu mannitool või sorbitool;

35 34 EE - EP B1 vastasioone, nagu naatrium; mitteioonseid surfaktante, nagu polüsorbaadid, poloksameerid või polüetüleenglükool (PEG), ja/või neutraalseid sooli, näiteks NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2 jne Tsükliline G-2-allüülP ja teised cgp-ühendid formuleeritakse tavaliselt sellistes vehiiklites ph-ga alates või umbes 4, 8. On mõistetav, et teatud eelnevate abiainete, kandeainete või stabilisaatorite kasutus annab tulemuseks ühendi soolade moodustumise. Lõplik preparaat võib olla stabiilne vedelik või lüofiliseeritud tahkis. Tsüklilise G-2-allüülP-ravimvormid farmatseutilistes kompositsioonides võivad hõlmata ka adjuvante. Tüüpilised adjuvandid, mida võib lisada tablettidesse, kapslitesse ja sarnastesse, on sideaine, nagu kummiaraabik, maisitärklis või želatiin; abiaine, nagu mikrokristalne tselluloos; disintegrant nagu maisitärklis või algiinhape; määrdeaine, nagu magneesiumstearaat; magusaine, nagu sahharoos või laktoos; lõhna- ja maitseaine, nagu piparmünt, talihali või kirss. Kui annusevormid on tabletid, võivad tsüklilise G-2-allüülP kompositsioonid sisaldada sideaineid ja valikul siledat pinnet. Kui annusevorm on kapsel, võib see lisaks eeltoodud materjalidele sisaldada ka vedelat kandeainet, nagu rasvõli. Muid erinevat tüüpi materjale võib kasutada annustamisühiku pinnete või füüsikalise vormi modifikaatoritena. Siirup või eliksiir võib sisaldada toimeainet, magusainet, nagu sahharoos, säilitusaineid nagu propüülparabeen, värvainet ning lõhna- ja maitseainet, nagu kirss. Steriilsed kompositsioonid süstimiseks võib formuleerida vastavalt tavapärasele farmatseutilisele praktikale. Näiteks võib olla soovitud aktiivse ühendi lahustamine või suspensioon vehiiklis, nagu vees või looduslikult esinevas taimeõlis nagu seesami-, maapähkli- või puuvillaseemneõlis või sünteetilises rasvvehiiklis nagu etüüloleaadis või sarnases. Puhvreid, säilitusaineid, antioksüdante ja sarnaseid võib lisada vastavalt aktsepteeritud farmatseutilisele praktikale. Süstimise, intraventrikulaarse manustamise ning teiste invasiivsete manustamisviiside jaoks peab olema tsükliline G-2-allüülP steriilne. Steriilsuse võib saavutada ükskõik millise tehnika tasemes tuntud meetodiga, näiteks filtreerides läbi steriilsete filtreerimismembraanide (nt 0,2-mikroniliste membraanide). Terapeutilised kompositsioonid pannakse üldjuhul steriilse avaga mahutitesse, nagu intravenoosse lahuse kotti või viaali, millel on hüpodermilise süstenõelaga läbistatav sulgur. Farmatseutilist ravimvormi, mis sisaldab tsüklilist G-2-allüülP-d, ladustatakse tavaliselt ühik- või mitme annuse mahutites, näiteks tihendatud ampullides või viaalides,

36 3 EE - EP B1 vesilahuse või lüofiliseeritud ravimvormina kasutamiskõlblikuks muutmiseks. Lüofiliseeritud ravimvormi näitena täidetakse ml viaalid ml steriilselt filtreeritud 1% (mass/maht) ühendi vesilahusega ning tekkinud segu lüofiliseeritakse. Infusioonilahus valmistatakse, muutes kasutuskõlblikuks lüofiliseeritud ühendi, kasutades bakteriostaatilist süstimisvett. On hõlpsalt mõistetav, et võib kasutada teisi annusevorme ja preparaatide tüüpe, ning kõiki peetakse käesoleva leiutise osaks. Ühendite valmistamine Tsüklilise cg-2-allüülp valmistamisel kasutatavad lähtematerjalid ja reaktiivid on kas saadaval kaubanduslikelt tarnijatelt, nagu Aldrich Chemical Company (Milwaukee, Wis.), Bachem (Torrance, Calif.), Sigma (St. Louis, Mo.), või valmistatavad meetodite abil, mis on hästi tuntud vastava valdkonna asjatundjale, järgides protseduure, mida kirjeldatakse viidatud allikates nagu Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, köited 1 17, John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1991; Rodd's Chemistry of Carbon Compounds, köited 1 ja lisad, Elsevier Science Publishers, 1989; Organic Reactions, köited 1 40, John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1991; March J; Advanced Organic Chemistry, 4. väljaanne, John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1992, ning Larock: Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Enamikel juhtudel on aminohapped ja nende estrid või amiidid ning kaitstud aminohapped laialdaselt kaubanduslikult saadaval ja modifitseeritud aminohapete ning nende amiidide või estrite valmistamist kirjeldatakse ulatuslikult keemia- ja biokeemiaalases kirjanduses ning see on seega hästi tuntud vastava valdkonna asjatundjatele. Käesoleva leiutise lähtematerjalid, vaheühendid ja lõppsaadused saab isoleerida ning puhastada, kasutades traditsioonilisi meetodeid, sealhulgas filtreerimist, destilleerimist, kristallimist, kromatograafiat jms. Neid võib iseloomustada, kasutades traditsioonilisi meetodeid, sealhulgas füüsilisi kontakte ja spektraalandmeid. Tsükliline G-2-allüülP on tsükliline dipeptiiid (bitsükliline 2,-diketopiperasiin) ning on ühendite klassi liige, mis on tuntud kui tsükliline GPx ( cgp ). Üldjuhul võib valmistada cgp-d ja tsüklilise G-2-allüülP meetoditega nagu need, mis on juba hästi tuntud peptiidide ja modifitseeritud peptiidisünteesi asjatundjatele, järgides reaktsiooniskeeme, mis on esitatud käesolevale leiutiskirjeldusele järgnevatel joonistel, või muid meetodeid, mis on hästi tuntud peptiidide ja analoogide sünteesi

37 36 EE - EP B1 asjatundjatele. Vaadake näiteks Bodanzsky: Principles of Peptide Synthesis, Berlin, New York: Springer-Verlag Käesoleva leiutise kohaste diketopiperasiini ühendite süntees võib olla lahusefaasi sünteesi teel, nagu käsitletakse näidetes, või tahke faasi sünteesi meetodi teel, mida on näitestanud Merrifield et al., 1963 J. Amer. Chem. Soc.: 8, Tahke faasi sünteesi võib teostada, kasutades kaubanduslikke peptiidisüntesaatoreid, nagu Applied Biosystems Model 430A, kasutades instrumendi jaoks kehtestatud protokolle. Konkreetsed näited diketopiperasiini sünteesist võib leida järgmistes näidetes ja näiteks allikas Fischer, 03, J. Peptide Science: 9: 9 3 ja viited seal. Vastava valdkonna asjatundjal ei ole raskusi, arvestades asjatundlikkust ja saadavalolevaid teadmisi ning käesolevaga avaldatut, ühe või enama sobiva sünteetilise meetodi väljatöötamisel käesoleva leituise kohaste ühendite jaoks. Valitud meetodi (tahke faasi või lahusefaasi) asjakohaste kaitserühmade ning tahke faasi sünteesi kasutamise korral on asjakohaste substraatide valik vastava ala asjatundja oskuste piires. Peptiidisünteesi asjakohased kaitserühmad hõlmavad t- butüüloksükarbonüüli (butyloxycarbonyl, Boc), fluorenüülmetüüloksükarbonüüli (fluorenylmethyloxycarbonyl, Fmoc), bensüüli (benzyl, Bzl), t-amüüloksükarbonüüli (amyloxycarbonyl, Aoc), tosüüli (Tos), bensüüloksükarbonüüli (benzyloxycarbonyl, Z või Cbz), o-bromo-bensüüloksükarbonüüli (bromo-benzyloxycarbonyl, BrZ) ja sarnaseid. Täiendavad kaitserühmad on tuvastatud allikas Heaman M. (toimetaja), Synthesis of Peptides and Peptidomimetics väljaandes Methods of organic chemistry (HoubeN-Weyl) (Workbench Edition, E22a,b,c,d,e; 04; Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York). Sidestusaine valik valitud meetodi jaoks on samuti vastava ala asjatundja oskuste piires. Sobivad sidestusained hõlmavad DCC-d (N, N'-ditsükloheksüülkarbodiimiid), Bop-i (bensotriasool-1-üül-oksü-tris-(dimetüülamino)-fosfoniumheksafluorofosfaat), PyBop-i (bensotriasol-1-üül-oksütripürroolidinofosfoniumheksafluorofosfaat), BopCl-i (bis(2-okso-3-oksasolidinüül)fosfiinkloriid), 2-kloro-1,3-dimetüülimidasolidiiniumheksafluorofosfaati (CIP) ja sarnaseid. Muid ühendeid võib kasutada näiteks sünteesis ratsemisatsiooni ennetamiseks, nagu HOBt (N-hüdroksübensotriasool) ja HOAt (1- hüdroksü-7-asabensotriasool). Teostused

38 37 EE - EP B1 Teostus 1. Meetod autismispektri häire (ASD) või neuroloogilise arenguhäire (NDD) sümptomi ravimiseks loomal, kellel on selline häire, mis hõlmab loomale ühendi, millel on valem või selle farmatseutiliselt aktsepteeritava soola või hüdraadi manustamist, milles X 1 on valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: NR', O ja S; X 2 on valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: CH2, NR', O ja S; 1 R 1, R 2, R 3, R 4 ja R on sõltumatult valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: -H, -OR',-SR', -NR'R', -NO2, -CN, -C(O)R', -C(O)OR', -C(O) NR'R', -C(NR') NR'R', trihalometüül, halogeen, alküül, asendatud alküül, heteroalküül, asendatud heteroalküül, alkenüül, asendatud alkenüül, alkünüül, asendatud alkünüül, arüül, asendatud arüül, heteroarüül, asendatud heteroarüül, arüülalküül, asendatud arüülalküül, heteroarüülalküül ja asendatud heteroarüülalküül; iga R' on sõltumatult valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: -H, alküül, heteroalküül, alkenüül, alkünüül, arüül, arüülalküül, heteroarüül ja heteroarüülalküül; või R 4 ja R koos võetuna on -CH2-(CH2)N-CH2-, kus n on täisarv 0 6; või R 2 ja R 3 koos võetuna on -CH2-(CH2)N-CH2-, kus n on täisarv 0 6; tingimusel, et kui R 1 = metüül ja R 2 = R 3 = R 4 = H, siis R bensüül, ja kui R 1 = H, vähemalt üks R 2 ja R 3 hulgast H. Teostus 2. Meetod autismispektri häire (ASD) või neuroloogilise arenguhäire (NDD) sümptomi ravimiseks loomal, kellel on selline häire, mis hõlmab loomale ühendi, millel on valem 2 või selle farmatseutiliselt aktsepteeritava soola või hüdraadi manustamist, milles

39 38 EE - EP B1 X 1 on valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: NR', O ja S; X 2 on valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: CH2, NR', O ja S; R 1, R 2 ja R 3 on sõltumatult valitud rühmast, mis koosneb rühmast, mis koosneb järgmistest: -H, -OR', -SR', -NR'R', -NO2, -CN, -C(O)R', - C(O)OR', -C(O) NR'R', -C(NR') NR'R', trihalometüül, halogeen, alküül, asendatud alküül, heteroalküül, asendatud heteroalküül, alkenüül, asendatud alkenüül, alkünüül, asendatud alkünüül, arüül, asendatud arüül, heteroarüül, asendatud heteroarüül, arüülalküül, asendatud arüülalküül, heteroarüülalküül ja asendatud heteroarüülalküül; iga R' on sõltumatult valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: -H, alküül, heteroalküül, alkenüül, alkünüül, arüül, arüülalküül, heteroarüül ja heteroarüülalküül; või R 2 ja R 3 koos võetuna on -CH2-(CH2)N-CH2-, kus n on täisarv 0 6; tingimusel, et vähemalt üks R H. 1 Teostus 3. Meetod autismispektri häire (ASD) või neuroloogilise arenguhäire (NDD) sümptomi ravimiseks loomal, kellel on selline häire, mis hõlmab loomale ühendi, millel on valem või selle farmatseutiliselt aktsepteeritava soola või hüdraadi manustamist, milles X 1 on valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: NR', O ja S; X 2 on valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: CH2, NR', O ja S; 2 R 1, R 2 ja R 3 on sõltumatult valitud rühmast, mis koosneb rühmast, mis koosneb järgmistest: -H, -OR', -SR', -NR'R', -NO2, -CN, -C(O)R', - C(O)OR', -C(O) NR'R', -C(NR') NR'R', trihalometüül, halogeen, alküül, asendatud alküül, heteroalküül, asendatud heteroalküül, alkenüül, asendatud alkenüül, alkünüül, asendatud alkünüül, arüül, asendatud arüül, heteroarüül, asendatud heteroarüül, arüülalküül, asendatud arüülalküül, heteroarüülalküül ja asendatud heteroarüülalküül; iga R' on

40 39 EE - EP B1 sõltumatult valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: -H, alküül, heteroalküül, alkenüül, alkünüül, arüül, arüülalküül, heteroarüül ja heteroarüülalküül; või R 2 ja R 3 koos võetuna on -CH2-(CH2)N-CH2-, kus n on täisarv 0 6. Teostus 4. Meetod autismispektri häire (ASD) või neuroloogilise arenguhäire (NDD) sümptomi ravimiseks loomal, kellel on selline häire, mis hõlmab loomale ühendi, millel on valem või selle farmatseutiliselt aktsepteeritava soola või hüdraadi manustamist, milles X 1, X 3 ning X 4 on sõltumatult valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: S, O ning NH; X 2 on valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: S, O, CH2 ja NH; 1 R 1, R 2, R 3, R 4 ja R on sõltumatult valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: -H, -OR',-SR', -NR'R', -NO2, -CN, -C(O)R', -C(O)OR', -C(O) NR'R', -C(NR') NR'R', trihalometüül, halogeen, alküül, asendatud alküül, heteroalküül, asendatud heteroalküül, alkenüül, asendatud alkenüül, alkünüül, asendatud alkünüül, arüül, asendatud arüül, heteroarüül, asendatud heteroarüül, arüülalküül, asendatud arüülalküül, heteroarüülalküül ja asendatud heteroarüülalküül; iga R' on sõltumatult valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: H, alküül, heteroalküül, alkenüül, alkünüül, arüül, arüülalküül, heteroarüül ja heteroarüülalküül; või R 4 ja R koos võetuna on -CH2-(CH2)N-CH2-, kus n on täisarv 0 6; või R 2 ja R 3 koos võetuna on -CH2-(CH2)N-CH2-, kus n on täisarv 0 6; tingimusel, et vähemalt üks R H ja et nii X 3 kui ka X 4 O. 2 Teostus. Meetod autismispektri häire (ASD) või neuroloogilise arenguhäire (NDD) sümptomi ravimiseks loomal, kellel on selline häire, mis hõlmab loomale ühendi, millel on valem

41 40 EE - EP B1 või selle farmatseutiliselt aktsepteeritava soola või hüdraadi manustamist, milles R 1 ja R 2 on sõltumatult valitud rühmast, mis koosneb rühmast, mis koosneb järgmistest: -H, -OR', -SR', -NR'R', -NO2, -CN, -C(O)R', - C(O)OR', -C(O) NR'R', -C(NR') NR'R', trihalometüül, halogeen, alküül, asendatud alküül, heteroalküül, asendatud heteroalküül, alkenüül, asendatud alkenüül, alkünüül, asendatud alkünüül, arüül, asendatud arüül, heteroarüül, asendatud heteroarüül, arüülalküül, asendatud arüülalküül, heteroarüülalküül ja asendatud heteroarüülalküül; iga R' on sõltumatult valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: -H, alküül, heteroalküül, alkenüül, alkünüül, arüül, arüülalküül, heteroarüül ja heteroarüülalküül; või R 1 ja R 2 koos võetuna on -CH2-(CH2)N-CH2-, kus n on täisarv Teostus 6. Meetod autismispektri häire (ASD) või neuroloogilise arenguhäire (NDD) sümptomi ravimiseks loomal, kellel on selline häire, mis hõlmab loomale ühendi, millel on valem või selle farmatseutiliselt aktsepteeritava soola või hüdraadi manustamist, milles 2 R 1, R 2 ja R 3 on sõltumatult valitud rühmast, mis koosneb rühmast, mis koosneb järgmistest: -H, -OR', -SR', -NR'R', -NO2, -CN, -C(O)R', - C(O)OR', -C(O) NR'R', -C(NR') NR'R', trihalometüül, halogeen, alküül, asendatud alküül, heteroalküül, asendatud heteroalküül, alkenüül, asendatud alkenüül, alkünüül, asendatud alkünüül, arüül, asendatud arüül, heteroarüül, asendatud heteroarüül, arüülalküül, asendatud arüülalküül, heteroarüülalküül ja asendatud heteroarüülalküül; iga R' on sõltumatult valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: -H, alküül,

42 41 EE - EP B1 heteroalküül, alkenüül, alkünüül, arüül, arüülalküül, heteroarüül ja heteroarüülalküül; või R 2 ja R 3 koos võetuna on -CH2-(CH2)N-CH2-, kus n on täisarv 0 6. Teostus 7. Meetod autismispektri häire (ASD) või neuroloogilise arenguhäire (NDD) sümptomi ravimiseks loomal, kellel on selline häire, mis hõlmab loomale ühendi, millel on valem või selle farmatseutiliselt aktsepteeritava soola või hüdraadi manustamist, milles 1 R on valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: alküül, asendatud alküül, heteroalküül, asendatud heteroalküül, alkenüül, asendatud alkenüül, alkünüül, asendatud alkünüül, arüül, asendatud arüül, heteroarüül, asendatud heteroarüül, arüülalküül, asendatud arüülalküül, heteroarüülalküül ja asendatud heteroarüülalküül. Teostus 8. Meetod vastavalt ükskõik millisele teostusele 1 4 või 6, kus R 1 = metüül. Teostus 9. Meetod vastavalt ükskõik millisele teostusele 1 4 või 6, kus R 1 = allüül. Teostus. Meetod vastavalt ükskõik millisele teostusele 1 4, kus R 2 = R 3 = metüül ja X 2 = S. Teostus 11. Meetod vastavalt teostusele 1, kus R 1 = allüül, R 2 = R 3 = R 4 = R = H, X 1 = NH, X 2 = CH2. Teostus 12. Meetod vastavalt teostusele 1, kus R 1 = metüül, R 2 = R 3 = H, R 4 ja R koos võetuna on -CH2-(CH2)3-CH2-, X 1 = NH, X 2 = CH2. 2 Teostus 13. Meetod vastavalt teostusele 1, kus R 1 = metüül, R 2 = R 3 =H, R 4 ja R koos võetuna on -CH2-(CH2)2-CH2-, X 1 = NH, X 2 = CH2. Teostus 14. Meetod vastavalt ükskõik millisele teostusele 1 13, mis hõlmab lisaks farmatseutiliselt aktsepteeritava abiaine manustamist.

43 42 EE - EP B1 Teostus 1. Meetod vastavalt ükskõik millisele teostusele 1 13, mis hõlmab lisaks farmatseutiliselt aktsepteeritava abiaine ja sideaine manustamist. Teostus 16. Meetod vastavalt ükskõik millisele teostusele 1 13, mis hõlmab lisaks farmatseutiliselt aktsepteeritava abiaine ja kapsli manustamist. 1 2 Teostus 17. Meetod vastavalt ükskõik millisele teostusele 1 13, mis hõlmab lisaks vähemalt ühe teise antiapoptootilise, antinekrootilise või närve kaitsva toimeaine manustamist. Teostus 18. Meetod vastavalt teostusele 17, kus teine antiapoptootiline või närve kaitsev toimeaine on valitud järgmiste hulgast: kasvufaktorid ja assotsieerunud derivaadid (insuliinisarnane kasvufaktor 1 [IGF-I], insuliinisarnane kasvufaktor 2 [IGF-II], transformeeriv kasvufaktor β1, aktiviin, kasvuhormoon, närvikasvufaktor, kasvuhormooni siduv valk, IGF-i siduvad valgud [eriti IGFBP-3], aluseline fibroblastide kasvufaktor, happeline fibroblastide kasvufaktor, hst/kfgk-geeniprodukt, FGF-3, FGF-4, FGF-6, keratinotsüütide kasvufaktor, androgeenindutseeritud kasvufaktor, int-2, fibroblastide kasvufaktori homoloogiline faktor 1 (FHF-1), FHF-2, FHF-3 ja FHF- 4, keratinotsüütide kasvufaktor 2, gliiat aktiveeriv faktor, FGF- ja FGF-16, tsiliaarne neurotroofne faktor, ajust pärinev kasvufaktor, neurotrofiin 3, neurotrofiin 4, luu morfogeneetiline proteiin 2 [BMP-2], gliiarakkude liinist pärinev neurotroofne faktor, aktiivsusest sõltuv neurotroofne faktor, tsütokiinide leukeemiat inhibeeriv faktor, onkostatiin M, interleukiin, α-interferoon, β- interferoon, γ-interferoon, konsensusinterferoon, TNF-α, klometiasool; kinureniinhape, Semax, takroliimus, L-treo-1-fenüül-2-dekanoüülamino-3- morfolino-1-propanool, adrenokortikotropiin-(4-9) analoog [ORG 2766], disotsilpiin [MK-801], selegiliin, glutamaadi antagonist, AMPA-antagonist ning põletikuvastane toimeaine. Teostus 19. Meetod vastavalt teostusele 18, milles nimetatud glutamaadi antagonist on valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: NPS6, GV260, MK-801 ning GV Teostus. Meetod vastavalt teostusele 18, milles nimetatud AMPA-antagonist on valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: 2,3-dihüdroksü-6-nitro-7- sulfamoüülbenso(f)kinoksaliin (NBQX), LY ja LY

44 43 EE - EP B1 Teostus 21. Meetod vastavalt teostusele 18, milles nimetatud põletikuvastane toimeaine on valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: MAdCAM-1-vastane antikeha ja integriin α4β1 retseptori ja integriin α4β7 retseptori vastane antikeha. Teostus 22. Meetod vastavalt teostusele 21, milles nimetatud MAdCAM-1- vastane antikeha on MECA-367. Teostus 23. Meetod vastavalt teostusele 1, milles nimetatud ühend on tsükliline G-2-AllüülP. Teostus 24. Meetod vastavalt teostusele 1, milles nimetatud ühend on tsükliline tsükloheksüül-g-2mep. 1 Teostus 2. Meetod vastavalt teostusele 1, milles nimetatud ühend on tsükliline tsüklopentüül-g-2mep. Teostus 26. Meetod autismispektri häire (ASD) või neuroloogilise arenguhäire (NDD) sümptomi ravimiseks loomal, kellel on selline häire, mis hõlmab loomale tsüklilise glütsüül-2-allüülproliini (cg-2-allüülp) farmatseutiliselt efektiivse koguse manustamist nimetatud imetajale. Teostus 27. Meetod vastavalt teostusele 26, milles nimetatud cg-2-allüülp sisaldab vesilahust ja üht või enam farmatseutiliselt aktsepteeritavat abiainet, lisandit, kandeainet või adjuvanti Teostus 28. Meetod vastavalt teostusele 26, mis hõlmab lisaks üht või enam abiainet, kandeainet, lisandit, adjuvanti või sideainet tabletis või kapslis. Teostus 29. Meetod vastavalt ükskõik millisele teostusele 1 28, kus häire on valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: autistlik häire, Aspergeri sündroom, lapse desintegratiivne häire ja täpsustamata pervasiivne arenguhäire (Pervasive Developmental Disorder Not Otherwise Specified, PDD-NOS) ning nõudmiste patoloogiline vältimine (Pathological Demand Avoidance, PDA). Teostus 30. Meetod vastavalt ükskõik millisele teostusele 1 28, kus häire on valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: fragiilse X-i sündroom (FXS), Angelmani sündroom, tuberoosne skleroosne kompleks, Phelani-McDermidi sündroom, Retti sündroom, CDKL-mutatsioonid ning X-seoseliste varajases eas avalduvate krampide häire.

45 44 EE - EP B1 Teostus 31. Meetod vastavalt ükskõik millisele teostusele 1 30, kus ühend manustatakse kas otse või kaudselt vereringe kaudu Teostus 32. Meetod vastavalt ükskõik millisele teostusele 1 31, kus nimetatud ühend manustatakse oraalse, intraperitoneaalse, intravaskulaarse, perifeerse vereringe, subkutaanse, intraorbitaalse, oftalmilise, intraspinaalse, intratsisternaalse, paikse, infusiooni, implantaadi, aerosooli, inhalatsiooni, skarifikatsiooni, intraperitoneaalse, kihnusisese, intramuskulaarse, intranasaalse, bukaalse, transdermaalse, pulmonaarse, rektaalse või vaginaalse viisi teel. Teostus 33. Meetod vastavalt ükskõik millisele teostusele 1 32, kus nimetatud efektiivsel kogusel on madalam piirväärtus umbes 0,001 milligrammi looma massi kilogrammi kohta (mg/kg) ja ülemine piirväärtus umbes 0 mg/kg. Teostus 34. Meetod vastavalt ükskõik millisele teostusele 1 33, kus mõjususe hindamine on fosforüülitud ERK-i (perk) või fosforüülitud Akt-i (pakt) mõõtmise teel looma lümfotsüütides, kus kas perk-i või pakt-i normaliseerimine näitab nimetatud häire raskusastme vähenemist. Teostus 3. Meetod vastavalt ükskõik millisele teostusele 1 33, milles nimetatud ravi annab ASD või NDD sümptomi paranemise, mida hinnatakse, kasutades üht või enam kliinilist testi, mis on valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: Retti sündroomi loomulik kulg / kliinilise raskusastme skoor, käitumishälvete nimekirja (ABC) väljaanne kogukondadele, Vinelandi kohaneva käitumise skaalad, haiguse raskusastme kliiniline üldmulje (CGI-S), kliinilise üldmulje paranemine (Clinical Global Impression of Improvement, CGI-I), hooldaja kurnatuse küsimustik (CSQ) või üks või enam füsioloogilist testi, mis on valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: elektroentsefalogrammi (EEG) teravike sagedus, EEG sagedusribade üldine võimsus, EEG sageduste poolkera sidusus, stereotüüpne käeliigutus, QTc ja südame löögisageduse varieeruvus (HRV), Fosfo-ERK1/2 ja Fosfo-Akt-i ebanormaalne rakusisene ekspressioon, kasvuga seotud valgu 43 (growth-associated protein-43, GAP-43) ebanormaalne ekspressioon, sünaptofüsiini (synaptophysin, SYN) ebanormaalne ekspressioon, hingamisteede ebakorrapärasused ja südame-ja hingamisfunktsiooni sidestus võrreldes kontroll-loomadega, kellel ei ole nimetatud häiret.

46 4 EE - EP B1 1 Teostus 36. Meetod vastavalt ükskõik millisele teostusele 1 3, kus nimetatud ASD sümptom on kognitiivne häire või kognitiivne düsfunktsioon, üks või enam nähtu või sümptomit järgmistest: mälu kaotus, ruumilise orientatsiooni kaotus, vähenenud õppimisvõime, vähenenud lühi- või pikaajalise mälu moodustamise võime, vähenenud episoodiline mälu, vähenenud mälu konsolideerimise võime, vähenenud ruumiline mälu, vähenenud sünaptogenees, vähenenud sünaptiline stabiilsus, täidesaatva funktsiooni defitsiidid, kognitiivse kaardistamise ja stseenimälu defitsiidid, deklaratiivse ja relatsioonilise mälu defitsiidid, konfiguraalsete või konjunktiivsete assotsiatsioonide vähenenud kiire omandamine, vähenenud kontekstispetsiifiline kodeerimine ja konkreetsete sündmuste otsimine, vähenenud episoodiline ja/või episoodilisesarnane mälu, ärevus, ebanormaalne hirmu konditsioneerimine, ebanormaalne sotsiaalne käitumine, korduv käitumine, ebanormaalne öine käitumine, krambihoogude aktiivsus, ebanormaalne liikumine, Fosfo-ERK1/2 ja Fosfo-Akt-i ebanormaalne rakusisene ekspressioon ning bradükardia. Teostus 37. Meetod ükskõik milliste eelnevate teostuste terapeutilise mõjususe olemasolu, raskusastme tuvastamiseks või hindamiseks, mis sisaldab Fosfo- ERK1/2 või Fosfo-Akt-i ekspressiooni mõõtmist ASD-ga indiviidi perifeerses lümfotsüüdis võrreldes Fosfo-ERK1/2 või Fosfo-Akt-i ekspressiooniga indiviidide rühma perifeerses lümfotsüüdis, kellel ei ole ASD-d, või Fosfo- ERK1/2 või Fosfo-Akt ekspressiooniga indiviidi perifeerses lümfotsüüdis enne ravi. NÄITED 2 Lisaks illustreerivad käesolevat leiutist järgmised näited. Neid näiteid pakutakse ainult illustreerimiseks ja need ei ole mõeldud piirama leiutise ulatust. Ühendite sünteesi üldised meetodid 30 Kiirkromatograafia teostati, kasutades Scharlau 60 (40 60 m mešš) silikageeli. Analüütiline õhekihikromatograafia teostati 0, mm eelkattega silikageelplaatidel (ALUGRAM SIL G/UV24) ja ühendid visualiseeriti, kasutades UV-fluorestsentsi või plaatide kuumutamist, mis kasteti kaaliumpermanganaati leeliselises lahuses. Sulamispunktid Celsiuse kraadides ( C) määrati sulamispunktiseadmega Electrothermal ja on korrigeerimata.

47 46 EE - EP B1 1 Optilisi pööranguid mõõdeti temperatuuril C polarimeetriga Perkin Elmer 341, kasutades cm raja pikkuse rakke ja need on antud ühikutes 1 degcm 2 g 1. Proovid valmistati näidatud lahustis määratud kontsentratsioonis (mõõdetuna grammides 0 cm 3 kohta). IR-spektrid salvestati FT-IR-spektromeetriga Perkin Elmer Spectrum One. Proovid valmistati õhukeste kiledena naatriumkloriidist ketastel või tahkistena kaaliumbromiidist ketastes. Lai signaal, mida näitab br. Sagedused ( ) absorptsiooni maksimumidena on antud lainearvudes (cm 1 ). NMR-spektrid salvestati spektromeetriga Bruker AVANCE DRX400 ( 1 H, 400 MHz; 13 C, 0 MHz) või Bruker AVANCE 300 ( 1 H, 300 MHz; 13 C, 7 MHz) ümbrustemperatuuridel. 1 H NMR-andmetele puhul kirjeldatakse keemilisi nihkeid miljondikosades SiMe4-st allpool ja esitatakse järjestikuselt kui asend (δh), suhteline integraal, kordsus (s = singlett, d = dublett, t = triplett, dd = dublettide dublett, m = multiplett, br = lai), sidestuskonstant (J/Hz) ja määrang. 13 C NMR-andmete puhul kirjeldatakse keemilisi nihkeid miljondikosadena CDCl3 suhtes ja esitatakse järjestikuselt kui asend (δc), hübridisatsiooni aste, mis määratakse DEPT-katsetega, ning määrang. 1 H NMR-spektritele määrati etalonid sisemiselt, kasutades SiMe4 (δ 0,00) või CDCl3 (δ 7,26). 13 C NMR-spektritele määrati etalonid sisemiselt, kasutades CDCl3 (δ 77,0). Kui NMR-spektrites tekib kaks piikide kogumit erinevate konformatsioonide tõttu glütsiini-proliini amiidsideme ümber, on väiksema ciskonformeeri keemiline nihe tähistatud tärniga (*). Täpsed massimõõtmised salvestati massispektromeetriga VG-70SE. Heksaan ja diklorometaan destilleeriti enne kasutust. Metanool kuivatati, kasutades magneesiumilaaste ja joodi, ning destilleeriti lämmastiku keskkonnas. Trietüülamiin kuivatati kaltsiumhüdriidi kohal ja destilleeriti lämmastiku keskkonnas. 2 Näide 1. (8aS)-metüül-heksahüdropürrolo[1,2-a]pürasiin-1,4-diooni (tsüklilise G-2MeP) süntees

48 47 EE - EP B1 Skeem 1. Reaktiivid, tingimused ja saagised: (i) LDA, THF, 78 C, jodometaan, 78 C -> 0 C, 2 h (63%); (ii) SOCl2, CH3OH, püstjahutiga keetmine, N2, 2, h (98%); (iii) Et3N, BoPCl, CH2Cl2, RT, N2,, h (78%); (iv) % Pd/C, CH3OH, RT, 1 h (98%). 1 (2R,S)-4-metüül-2-triklorometüül-1-asa-3-oksabitsüklo[3,3,0]oktan-4-oon 9 N-BuLi (1,31 M, 4,68 cm 3, 6,14 mmol) lisati tilkhaaval diisopropüülamiini (0,86 cm 3, 6,14 mmol) segatud lahusele kuivas tetrahüdrofuraanis ( cm 3 ) temperatuuril 78 C lämmastiku keskkonnas. Lahust segati min, soojendati temperatuurini 0 C ja segati 1 min. Lahus lisati seejärel tilkhaaval oksasolidinooni 8 (1,00 g, 4,09 mmol) lahusele kuivas tetrahüdrofuraanis ( cm 3 ) temperatuuril 78 C min jooksul (läks tumepruuni värvi), segati täiendavalt 30 min, seejärel lisati tilkhaaval jodometaan (0,76 cm 3, 12,3 mmol) min jooksul. Lahust soojendati temperatuurini 0 C 2 h jooksul. Lisati vett (1 cm 3 ) ja lahust soojendati toatemperatuurini ja ekstraheeriti kloroformiga (3 40 cm 3 ). Kombineeritud orgaanilised ekstraktid kuivatati (MgSO4), filtreeriti ja aurustati kuivuseni in vacuo, et anda tumepruun pooltahkis. Jäägi puhastamise kiirkolonnkromatograafia teel (1% etüülatsetaat-heksaan) andis oksasolidinooni 9 (0,67 g, 63%) kahvatukollase tahkisena: mp 7 C (lit, 7 60 C); δh (300 MHz, CDCl3) 1,3 (3H, s, CH3), 1,72-2,02 (3H, m, Proβ-H ja Proγ-H2), 2,18-

49 48 EE - EP B1 2,26 ( 1 H, m, Proβ-H), 3,1-3,22 ( 1 H, m, Proδ-H), 3,3-3,44 ( 1 H, m, Proδ-H) ja 4,99 ( 1 H, s, NCH). Metüül L-2-metüülprolinaathüdrokloriid a) kasutades atsetüülkloriidi Oksasolidinoon 9 (0,60 g, 2,33 mmol) lahustati kuivas metanoolis (1 cm 3 ) lämmastiku keskkonnas ja atsetüülkloriid (0,33 cm 3, 4,66 mmol) lisati tilkhaaval jääjahutatud lahusele. Lahus kuumutati püstjahutiga keetes 4, h, seejärel eemaldati lahusti vähendatud rõhu all, et anda pruun õli, mis puhastati kiirkolonnkromatograafia teel (% CH3OH-CH2Cl2), andes hüdrokloriidi (0,2 g, 48%) helbelise valge tahkisena: mp 7 9 C (lit, 6 8 C); δh (300 MHz, CDCl3) 1,81 (3H, s, CH3), 1,93-2,14 (3H, m, Proβ-HAHB ja Proγ-H2), 2,33-2,39 ( 1 H, m, Proβ-HAHB), 3,2-3,6 (2H, m, Proδ-H2) ja 3,82 (3H, s, CO2CH3). b) kasutades tionüülkloriidi 1 Oksasolidinooni 9 (3 mg, 0,21 mmol) jääjahutatud lahust kuivas metanoolis (1 cm 3 ) töödeldi tilkhaaval tionüülkloriidiga (0,04 cm 3, 0,62 mmol). Lahust kuumutati püstjahutiga keetes 2, h, jahutati ja lahusti eemaldati vähendatud rõhu all, et anda pruun õli. Õli lahustati tolueenis ( cm 3 ), kontsentreeriti kuivuseni jääktionüülkloriidi ja metanooli eemaldamiseks, seejärel puhastati kiirkolonnkromatograafia teel (% CH3OH-CH2Cl2), et anda hüdrokloriid (16 mg, 43%) helbelise valge tahkisena. 1 H NMR määrangud olid kooskõlas eespool teatatutega. Metüül-N-bensüüloksükarbonüül-glütsüül-L-2-metüülprolinaat Kuiv trietüülamiin (0,27 cm 3, 1,96 mmol) lisati tilkhaaval hüdrokloriidi (0,11 g, 0,61 mmol) ja N-bensüüloksükarbonüül-glütsiini 11 (98,%) (0,17 g, 0,79 mmol) lahusele kuivas diklorometaanis (3 cm 3 ) lämmastiku keskkonnas toatemperatuuril ning reaktsioonisegu segati min. Lisati bis(2-okso-3-oksasolidinüül)fosfiinkloriid (BoPCl, 97%) (0,196 g, 0,77 mmol) ja tekkinud värvitut lahust segati, h. Lahust uheti järjestikku % soolhappe vesilahuse (30 cm 3 ) ja küllastunud naatriumvesinikkarbonaadi vesilahusega (30 cm 3 ), kuivatati (MgSO4), filtreeriti ja aurustati kuivaks in vacuo. Tekkinud jäägi puhastamine kiirkolonnkromatograafia teel (0 80% etüülatsetaat-heksaan; gradientelueerimine) andis dipeptiiidi 12 (0,18 g, 92%) värvitu õlina. Näidati, et amiid 12 eksisteerib 98:2 trans:cis konformeeride seguna, 13 C NMR-analüüsi teel (suhtarvu hinnati resonantside suhtelistest intensiivsustest tasemel

50 49 EE - EP B1 1 2 δ,8 ja 23,, mis on määratud vastavalt väiksemate ja suuremate konformeeride Proy-C-aatomitele): [α]d 33,0 (c 1,0 MeOH-is); vmax (kile)/cm , 292, 1732, 161, 121, 1434, 1373, 1329, 13, 1284, 127, 12, 119, 1172, 113, 17, 82, 2, 29, 986, 96, 907, 876, 829, 77, 738 ja 699; δh (300 MHz, CDCl3) 1,49 (3H, s, CH3), 1,77-2,11 (4H, m, Proβ-H2 ja Proγ-H2), 3,43-3,48 (2H, m, Proδ-H2), 3,61 (3H, s, OCH3), 3,8-3,89 (2H, m, Glyα-H2),,04 (2H, s, PhCH2),,76 ( 1 H, br s, N-H) ja 7,21-7,28 (H, s, ArH); δc (7 MHz, CDCl3) 13,8 (CH3, Proα-CH3), 21,1 (CH3, Proα-CH3),,8 (CH2, Proy-C), 23, (CH2, Proy-C), 38,0 (CH2, Prop-C), 40,8 (CH2, Prop-C), 43,3 (CH2, Glyα-C), 4, (CH2, Glyα-C), 46,6 (CH2, Proδ-C), 48,7 (CH2, Prοδ-C), 1,9* (CH3, OCH3), 2,1 (CH3, OCH3), 60,0* (kvat, Proα-C), 66,0 (kvat, Proα-C), 66,3 (CH2, PhCH2), 68,6* (CH2, PhCH2), 127, (CH, Ph), 127,6 (CH, Ph), 127,9* (CH, Ph), 128,1 (CH, Ph), 128,3* (CH, Ph), 136,2 (kvat, Ph), 1,9 (kvat, NCO2), 166,0 (kvat, Gly-CON), 169,4* (kvat, Gly-CON) ja 173,6 (kvat, CO2CH3); m/z (EI+) 334,13 (M +. C17H12N2O nõuab 334,129). (8aS)-metüül-heksahüdropürrolo[1,2-a]pürasiin-1,4-dioon (tsükliline G-2MeP) Dipeptiiidi 12 (0,167 g, 0,1 mmol) lahusele metanoolis (8,0 cm 3 ) lisati % Pd aktiivsöel (8,1 mg, 0,076 mmol) ja nõu uheti läbi gaasilise vesinikuga. Tekkinud suspensiooni segati jõuliselt vesiniku keskkonnas 1 h. Segu filtreeriti seejärel läbi Celite'i padja, seejärel lühikese silikageeli korgi metanooliga ning lahusti eemaldati vähendatud rõhu all, et tekitada tsükliline G-2MeP (83 mg, 98%) kollase tahkisena: mp C; [α]d 128,1 (c 0,2 MeOH-is); δh (300 MHz, CDCl3) 1,36 (3H, s, CH3), 1,87-2,01 (3H, m, Proβ-HAHB ja Proγ-H2), 2,07-2,21 ( 1 H, m, Proβ-HAHB), 3,4-3,64 (2H, m, Proδ-H2), 3,82 ( 1 H, dd, J 17,1 ja 4,1, CHAHBNH), 3,99 ( 1 H, d, J 17,1, CHAHBNH) ja 7,66 ( 1 H, br s, N-H); δc (7 MHz, CDCl3),2 (CH2, Proy-C), 23,2 (CH3, Proα-CH3), 3,0 (CH2, Proβ-C), 44,7 (CH2, Proδ-C), 4,9 (CH2, CH2NH), 63,8 (kvat, Proα-C), 163,3 (kvat, NCO) ja 173,3 (kvat, CONH); m/z (EI+) 168,08986 (M +. C8H12N2O2 nõuab 168,08988). Näide 2. (8aS)-metüül-spiro[tsükloheksaan-1,3(4H)-tetrahüdropürrolo[1,2-a]pürasiin]- 1,4(2H)-diooni (tsüklilise tsükloheksüül-cg-2-allüülp) süntees

51 0 EE - EP B1 Skeem 2. Reaktiivid, tingimused ja saagised: (i) BnO2CCl, Na2CO3, H2O-dioksaan (3:1), 19 h, 96%; (ii) Et3N, HOAt, CIP, 1,2-dikloroetaan, püstjahutiga keetmine, N2, 19 h (23%); (iii) % Pd/C, CH3OH, RT, 17 h (6%). 1 N-bensüüloksükarbonüül-1-aminotsükloheksaan-1-karboksüülhape (14) 1-aminotsükloheksaankarboksüülhappe 13 (0,72 g,,02 mmol) ja naatriumkarbonaadi (1,6 g, 1,1 mmol) suspensioonile, mis lahustati vees-dioksaanis (21 cm 3, 3:1), lisati tilkhaaval bensüülkloroformaat (0,79 cm 3,,2 mmol) ja lahust segati toatemperatuuril 19, h. Vesilahuse kihti uheti dietüüleetriga (60 cm 3 ), hapestati 2 M HCl-iga ja ekstraheeriti etüülatsetaadiga (2 60 cm 3 ). Orgaanilised kihid kombineeriti, kuivatati (MgSO4), filtreeriti ja aurustati vähendatud rõhu all, et tekitada värvitu õli, mis tahenes seismisel tooreks karbamaadiks 14 (1,23 g, 88%) valge tahkisena: mp C (lit, 148 C); δh (400 MHz, CDCl3) 1,27-1,6 (3H, m, 3 tsükloheksüül-h), 1,9-1,73 (3H, m, 3 tsükloheksüül-h), 1,8-1,91 (2H, m, 2 tsüklopentüül-h), 2,0-2,09 (2H, m, 2 tsüklopentüül-h),,02 ( 1 H, br s, N-H),,12 (2H, s, OCH2Ph) ja 7,27-7,36 (H, s, Ph); δc (0 MHz, CDCl3) 21,1 (CH2, 2 tsükloheksüül-c), 2,1 (CH2, 2 tsükloheksüül-c), 32,3 (CH2, tsükloheksüül-c), 9,0 (kvat,1-c), 67,1 (CH2, OCH2Ph),

52 1 EE - EP B1 128,1 (CH, Ph), 128,2 (CH, Ph), 128, (CH, Ph), 136,1 (kvat, Ph), 1,7 (kvat, NCO2) ja 178,7 (kvat, CO2H). Metüül-N-bensüüloksükarbonüül-tsükloheksüül-glütsüül-L-2-metüülprolinaat (1) Kuiv trietüülamiin (0,21 cm 3, 1, mmol) lisati tilkhaaval hüdrokloriidi (84,0 mg, 0,47 mmol), karboksüülhappe 14 (0,17 g, 0,61 mmol) ja 1-hüdroksü-7- asabensotriasooli (16 mg, 0,12 mmol) lahusele kuivas 1,2-dikloroetaanis (26 cm 3 ) lämmastiku keskkonnas toatemperatuuril ning reaktsioonisegu segati min. Lisati 2- kloro-1,3-dimetüülimidasolidiiniumheksafluorofosfaat (0,13 g, 0,47 mmol) ja tekkinud lahust kuumutati püstjahutiga keetes 21 h, seejärel uheti järjestikku % soolhappe vesilahuse (30 cm 3 ) ja küllastunud naatriumvesinikkarbonaadi vesilahusega (30 cm 3 ), kuivatati (MgSO4), filtreeriti ja aurustati kuivuseni in vacuo. Tekkinud jäägi puhastamine kiirkolonnkromatograafia teel (40 0% etüülatsetaat-heksaan; gradientelueerimine) andis amiidi 1 (16 mg, 9%) valge tahkisena. Näidati, et amiid 1 eksisteerib 11:1 trans:cis konformeeride seguna, 13 C NMR-analüüsi teel (suhtarvu hinnati resonantside suhtelistest intensiivsustest tasemel δ 41,3 ja 48,2, mis on määratud vastavalt väiksemate ja suuremate konformeeride Proδ-C-aatomitele): mp C; [α]d 44,9 (c 1,31 CH2Cl2-s); vmax (kile)/cm , 2927, 1736, 1707, 1617, 130, 140, 1403, 1371, 1281, 1241, 18, 1194, 116, 1, 1132, 89, 71, 28, 984, 912, 796, 749, 739 ja 699; δh (400 MHz, CDCl3) 1,24-2, (17H, m, Proα- CH3, Proβ-H2, Proγ-H2 ja tsükloheksüül-h2), 3,2-3,48 ( 1 H, br m, Proδ-HAHB), 3,61-3,87 (4H, br m, OCH3 ja Proδ-HAHB), 4,92-,19 (3H, m, N-H ja OCH2Ph) ja 7,3-7,37 (H, s, Ph); δc(0 MHz, CDCl3) 21,26 (CH2, tsükloheksüül-c), 21,33 (CH2, tsükloheksüül-c), 21,7 (CH3, Proα-CH3), 24,8 (CH2, tsükloheksüül-c), 2,0 (CH2, Proγ- C), 29,4* (CH2, tsükloheksüül-c), 29,7* (CH2, tsükloheksüül-c), 31,1 (CH2, tsükloheksüül-c), 31,6 (CH2, tsükloheksüül-c), 31,9* (CH2, tsükloheksüül-c), 32,2* (CH2, tsükloheksüül-c), 32,8* (CH2, tsükloheksüül-c), 37,3 (CH2, Proβ-C), 41,4* (CH2, Proδ-C), 48,2 (CH2, Proδ-C), 2,1 (CH3, OCH3), 9,1 (kvat, Glyα-C), 66,7 (CH2, OCH2Ph), 67,3* (CH2, OCH2Ph), 67,4 (kvat, Proα-C), 128,0* (CH, Ph), 128,1* (CH, Ph), 128,3 (CH, Ph), 128, (CH, Ph), 128,7 (CH, Ph), 136,6 (kvat, Ph), 13,7 (kvat, NCO2), 171,0 (kvat, Gly-CO) ja 174,8 (kvat, CO2CH3); m/z (EI+) 402,211 (M +. C22H30N2O nõuab 402,21). (8aS)-metüül-spiro[tsükloheksaan-1,3(4H)-tetrahüdropürrolo[1,2-a]pürasiin]-1,4(2H)- dioon (tsükliline tsükloheksüül-g-2mep)

53 2 EE - EP B1 1 Amiidi 1 (40 mg, 0,01 mmol) lahusele metanoolis (3,3 cm 3 ) lisati % Pd aktiivsöel (1,6 mg, 0,01 mmol) ja nõu uheti läbi gaasilise vesinikuga. Tekkinud suspensiooni segati jõuliselt vesiniku keskkonnas 61, h, seejärel filtreeriti läbi Celite -i padja metanooliga (1 cm 3 ). Filtraat kontsentreeriti kuivuseni vähendatud rõhu all, et tekitada kollane pooltahkis, mis puhastati pöördfaas-c18-kiirkolonnkromatograafia teel (0 % CH3CN/H2O; gradientelueerimine), et tekitada tsükliline tsükloheksüül-g-2mep (19 mg, 81%) valge tahkisena: mp C; [α]d 63,8 (c 1,13 CH2Cl2-s); vmax (kile)/cm 1 321, 292, 284, 1667, 1646, 1463, 1427, 1276, 1232, 1171, 8, 14, 900, 868, 818, 783, 726 ja 71; δh, (400 MHz, CDCl3) 1,31-1,89 (12H, m, 9 tsükloheksüül-h ja 8a-CH3), 1,94-2,1 (4H, m, 7-H2 ja 8-H2), 2,26 ( 1 H, td, J 13,7 ja 4,, 1 tsükloheksüül- H), 3,44-3,1 ( 1 H, m, 6-HAHB), 3,79-3,86 ( 1 H, m, 6-HAHB) ja 6,40 ( 1 H, br s, N-H); δc (0 MHz, CDCl3) 19, (CH2, 7-C),,6 (CH2, tsükloheksüül-c),,8 (CH2, tsükloheksüül-c), 24, (CH2, tsükloheksüül-c), 2,0 (CH3, 8a-CH3), 33,7 (CH2, tsükloheksüül-c), 36,3 (CH2, 8-C), 36, (CH2, tsükloheksüül-c), 44,7 (CH2, 6-C), 9, (kvat, 8a-C), 64,0 (kvat, 3-C), 168,1 (kvat, 4-C) ja 171,6 (kvat, 1-C); m/z (EI+) 236,1246 (M +. C13HN2O2 nõuab 236,1248). Näide 3. (8aS)-allüül-heksahüdropürrolo[1,2-a]pürasiin-1,4-diooni (tsüklilise G-2- allüülp) süntees

54 3 EE - EP B1 Skeem 3. Reaktiivid, tingimused ja saagised: (i) LDA, THF, 78 C, allüülbromiid, 78 C -> 30 C, N2, 4 h (60%); (ii) atsetüülkloriid, CH3OH, püstjahutiga keetmine, N2, 24 h (63%); (iii) Et3N, BoPCl, CH2Cl2, RT, N2, 19, h (4%); (iv) TFA, CH2Cl2, 1 h, seejärel Et3N, CH2Cl2, 23 h (37%). 1 2 (2R,S)-4-allüül-2-triklorometüül-1-asa-3-oksabitsüklo[3,3,0]oktan-4-oon 17 N-BuLi (1,31 M, 9,93 cm 3, 13,0 mmol) lisati tilkhaaval diisopropüülamiini (1,82 cm 3, 13,0 mmol) segatud lahusele kuivas tetrahüdrofuraanis ( cm 3 ) temperatuuril 78 C lämmastiku keskkonnas. Lahust segati min, soojendati temperatuurini 0 C, segati 1 min, seejärel lisati tilkhaaval pro-oksasolidinooni 16 (2,12 g, 8,68 mmol) lahusele kuivas tetrahüdrofuraanis (40 cm 3 ) temperatuuril 78 C min jooksul ja reaktsioonisegu segati täiendavalt 30 min, seejärel lisati tilkhaaval allüülbromiid (2,2 cm 3, 26,0 mmol) min jooksul. Lahust soojendati aeglaselt temperatuurini 30 C 4 h jooksul, kustutati H2O-ga (30 cm 3 ) ja segu soojendati toatemperatuurini ja ekstraheeriti kloroformiga (3 80 cm 3 ). Kombineeritud orgaanilised ekstraktid kuivatati (MgSO4), filtreeriti ja aurustati kuivuseni in vacuo, et tekitada tumepruun pooltahkis, mis puhastati kiirkolonnkromatograafia teel ( % etüülatsetaat-heksaan; gradientelueerimine), et tekitada oksasolidinoon 17 (1,48 g, 60%) oranži õlina, mis tahkestus temperatuuril 0 C, mille puhul nmr-andmed olid kooskõlas kirjanduses teatatuga: δh (400 MHz, CDCl3) 1,8-1,92 (2H, m, Proγ-H2), 1,96-2,14 (2H, m, Proβ- H2), 2,0-2,63 (2H, m, Proδ-H2), 3,12-3,23 (2H, m, CH2-CH=CH2), 4,97 ( 1 H, s, NCH),,13-,18 (2H, m, CH=CH2) ja,82-,92 ( 1 H, m, CH=CH2); δc (0 MHz, CDCl3) 2,1 (CH2, Proγ-C), 3,1 (CH2, Proβ-C), 41, (CH2, Proδ-C), 8,3 (CH2)CH2CH=CH2), 71,2 (kvat, Proα-C), 0,4 (kvat, CCl3), 2,3 (CH, NCH), 119,8 (CH2, CH2CH=CH2), 131,9 (CH, CH2CH=CH2) ja 176,1 (kvat, C=O); m/z (CI+) 284,0009 [(M + H)+. CH13 3 Cl3NO2 nõuab 284,0012], 28,9980 [(M + H)+. CH13 3 Cl2 37 ClNO2, nõuab 28,9982], 287,991 [(M + H)+. CH13 3 Cl 37 Cl2NO2 nõuab 287,993] ja 289,9932 [(M + H)+. CH13 37 Cl3NO, nõuab 289,9923]. Metüül L-2-allüülprolinaathüdrokloriid Oksasolidinooni 17 (0,64 g, 2,24 mmol) jääjahutatud lahust kuivas metanoolis (1 cm 3 ) töödeldi tilkhaaval atsetüülkloriidi (0,36 cm 3,,0 mmol) lahusega metanoolis ( cm 3 ). Lahust kuumutati püstjahutiga keetes 24 h, seejärel jahutati ja lahusti eemaldati vähendatud rõhu all. Tekkinud pruun õli lahustati tolueenis (40 cm 3 ) ja kontsentreeriti kuivuseni jääktionüülkloriidi ja metanooli eemaldamiseks, seejärel puhastati

55 4 EE - EP B1 kiirkolonnkromatograafia teel ( % CH3OH-CH2Cl2; gradientelueerimine), et anda hüdrokloriid 18 (0,29 g, 63%) rohelise tahkisena, mille puhul nmr-andmed olid kooskõlas kirjanduses teatatuga: δh (300 MHz, CDCl3) 1,72-2,2 (3H, m, Proβ-HAHB ja Proγ-H2), 2,32-2,2 ( 1 H, m, Proβ-HAHB), 2,72-3, (2H, m, Proδ-H2), 3,31-3,78 (2H, m, CH2CH=CH2), 3,84 (3H, s, CO2CH3),,-,33 (2H, m, CH=CH2),,7-,98 ( 1 H, m, CH=CH2) ja 8,06 ( 1 H, br s, N-H); m/z (CI+) 170,1183 [(M + H)+. C9H16NO2 nõuab 170,1181]. Metüül-N-tert-butüüloksükarbonüül-glütsüül-L-2-allüülprolinaat 1 2 Kuiv trietüülamiin (0,28 cm 3, 2,02 mmol) lisati tilkhaaval hüdrokloriidi 18 (0,13 g, 0,63 mmol) ja N-tert-butüüloksükarbonüül-glütsiini 19 (0,14 g, 0,82 mmol) lahusele kuivas diklorometaanis (3 cm 3 ) lämmastiku keskkonnas toatemperatuuril ning reaktsioonisegu segati min. Lisati bis(2-okso-3-oksasolidinüül)fosfiinkloriid (BoPCl, 97%) (0, g, 0,80 mmol) ja lahust segati 19, h, seejärel uheti järjestikku % soolhappe vesilahuse (3 cm 3 ) ja küllastunud naatriumvesinikkarbonaadi vesilahusega (3 cm 3 ), kuivatati (MgSO4), filtreeriti ja aurustati kuivuseni in vacuo. Tekkinud jäägi puhastamine kiirkolonnkromatograafia teel (40% etüülatsetaatheksaan) andis dipeptiiidi (0,09 g, 4%) helekollase õlina: [α]d +33,8 (c 0,83 CH2Cl2-s); vmax (kile)/cm , 307, 2977, 2930, 2874, 1739, 171, 166, 1499, 1434, 1392, 1366, 1332, 1268, 1248, 1212, 1168, 1122, 1, 26, 03, 943, 919, 867, 830, 779, 739, 699 ja 679; δh (300 MHz, CDCl3) 1,42 [9H, s, C(CH3)3], 1,93-2,08 (4H, m, Proβ-H2 ja Proγ-H2), 2,9-2,67 ( 1 H, m, CHAHBCH=CH2), 3,09-3,16 ( 1 H, m, CHAHBCH=CH2), 3,3-3,44 ( 1 H, m, Proδ-HAHB), 3,6-3,62 ( 1 H, m, Proδ-HAHB), 3,70 (3H, s, OCH3), 3,89 (2H, d, J 4,2, Glyα-H2),,06-,11 (2H, m, CH=CH2),,42 ( 1 H, br s, Gly-NH) ja,8-,72 ( 1 H, m, CH=CH2); δc (7 MHz, CDCl3) 23,7 (CH2, Proy-C), 28,3 [CH3, C(CH3)3], 3,0 (CH2, Prop-C), 37,6 (CH2, CH2 CH=CH2), 43,3 (CH2, Glyα-C), 47, (CH2, Proδ-C), 2, (CH3, OCH3), 68,8 (kvat, Proα-C), 79, [kvat, C(CH3)3], 119,4 (CH2, CH=CH2), 132,9 (CH, CH=CH3), 1,7 (kvat, NCO2), 166,9 (kvat, Gly-CON) ja 173,8 (kvat, CO2CH3); m/z (EI+) 326,184 (M +. C16H26N2O nõuab 326,1842). (8aS)-allüül-heksahüdropürrolo[1,2-a]pürasiin-1,4-dioon (tsükliline G-2allüülP) 30 Dipeptiiidi (0,09 g, 0,28 mmol) lahusele diklorometaanis (9 cm 3 ) toatemperatuuril lisati trifluoroäädikhape (1 cm 3, 0,013 mmol) tilkhaaval ja reaktsioonisegu segati 1 h lämmastiku keskkonnas. Lahus aurustati vähendatud rõhu all, et anda värvitu õli, mis lahustati diklorometaanis ( cm 3 ), lisati kuiv trietüülamiin (0,096 cm 3, 0,69 mmol) ja

56 EE - EP B1 1 reaktsioonisegu segati 4, h, mille järel lisati täiendav trietüülamiin (0,096 cm 3, 0,69 mmol). Reaktsioonisegu segati üle öö, kontsentreeriti kuivuseni, et anda roheline õli, mis puhastati kiirkolonnkromatograafia teel (% CH3OH-CH2Cl2), et tekitada tsükliline G-2allüülP ( mg, 37%) valkja tahkisena: mp 6 9 C; [α]d 2,7 (c 0,9 CH2Cl2-s); vmax (CH2Cl2)/cm 1 346, 3226, 29, 1666, 144, 132, 1306, 1299, 12, 1133, 19, 28,, 949, 928, 882, 793, 761 ja 733; δh (400 MHz, CDCl3) 1,92-2,01 (2H, m, Proγ-H2), 2,09-2,16 (2H, m, Proβ-H2) 2,39-2,6 (2H, m, CH2CH2=CH2), 3,46-3,3 ( 1 H, m, Proδ-HAHB), 3,78-3,87 (2H, m, Proδ-HAHB ja Glyα- HAHB), 4,09 ( 1 H, d, J 17,2, Glyα-HAHB),,16-, (2H, m, CH=CH2),,73-,84 ( 1 H, m, CH=CH2) ja 7,17 ( 1 H, br s, N-H); δc (0 MHz, CDCl3),1 (CH2, Proy-C), 34,1 (CH2, Prop-C), 41,7 (CH2, CH2CH2=CH2), 44,9 (CH2, Proδ-C), 46,4 (CH2, Glyα-C), 67,2 (kvat, Proα-C), 1,9 (CH2, CH=CH2), 131,0 (CH, CH=CH2), 163,4 (kvat, NCO) ja 171,7 (kvat, CONH); m/z (EI+) 19,1132 (M +. CH1N2O2 nõuab 19,1134). Näide 4. (8aS)-metüül-spiro[tsüklopentaan-1,3(4H)-tetrahüdropürrolo[1,2-a]pürasiin]- 1,4(2H)-diooni (tsüklilise tsüklopentüül-cg-2-allüülp) süntees

57 6 EE - EP B1 Skeem 4. Reaktiivid, tingimused ja saagised: (i) Et3N, HOAt, CIP, 1,2-dikloroetaan, 83 C, N2, 19 h (23%); (ii) % Pd/C, CH3OH, RT, 17 h (6%). N-bensüüloksükarbonüül-1-aminotsüklopentaan-1-karboksüülhape Bensüülkloroformaadi (0,290 g, 1,1 mmol) lahus dioksaanis (2, cm 3 ) lisati tilkhaaval 1-aminotsüklopentaankarboksüülhappe (Fluka) (0,2 g, 1,4 mmol) ja naatriumkarbonaadi (0,490 g, 4,64 mmol) lahusele vees ( cm 3 ) temperatuuril 0 C. Segamist jätkati toatemperatuuril üle öö ja reaktsioonisegu uheti eetriga. Vesilahuse kiht muudeti happeliseks 2M soolhappega, ekstraheeritud etüülatsetaadiga, kuivatati (Na2SO4), filtreeriti ja lahusti eemaldati, et anda karbamaat 21 (0,23 g, 62%) õlina, mis tahenes seismisel. Näidati, et karbamaat 21 on 70:30 konformeeride segu, 1 H NMR-analüüsi teel (suhtarvu hinnati resonantside integratsioonist tasemel δ,31 ja 7,29-7,40, mis on määratud vastavalt suuremate ja väiksemate konformeeride N-H prootonitele): mp C (lit C, etüülatsetaat, petrooleeter); δh (400 MHz; CDCl3; Me4Si) 1,83 (4H, br s, 2 tsüklopentüül-h2), 2,04 (2H, br s, tsüklopentüül-h2), 2,-2,40 (2H, m, tsüklopentüül-h2),,13 (2H, br s, OCH2 Ph),,31 (0,7H, br s, N-H) ja 7,29-7,40 (,3H, m, Ph ja N-H*); δc (0 MHz; CDCl3) 24,6 (CH2, tsüklopentüül-c), 37, (CH2, tsüklopentüül-c), 66,0 (kvat, tsüklopentüül-c), 66,8 (CH2, OCH2Ph), 128,0 (CH, Ph), 128,1 (CH, Ph), 128,4 (CH, Ph), 136,1 (kvat, Ph), 1,8 (kvat, NCO2) ja 179, (kvat, CO2H). Metüül N-bensüüloksükarbonüültsüklopentüül-glütsüül-L-2-metüülprolinaat 22 Kuiv trietüülamiin (0,19 cm 3, 1,4 mmol) lisati tilkhaaval hüdrokloriidi (78 mg, 0,43 mmol), karboksüülhappe 21 (0,1 g, 0,6 mmol) ja 1-hüdroksü-7- asabensotriasooli (Acros) (1 mg, 0,11 mmol) lahusele kuivas 1,2-dikloroetaanis (24 cm 3 ) lämmastiku keskkonnas toatemperatuuril ning reaktsioonisegu segati min. Lisati 2-kloro-1,3-dimetüülimidasolidiiniumheksafluorofosfaat (CIP) (Aldrich) (0,12 g, 0,43 mmol) ja tekkinud lahust kuumutati püstjahutiga keetes 19 h, seejärel uheti järjestikku % soolhappe vesilahuse (30 cm 3 ) ja küllastunud naatriumvesinikkarbonaadi vesilahusega (30 cm 3 ), kuivatati (MgSO4), filtreeriti ja aurustati kuivuseni in vacuo. Tekkinud jäägi puhastamine kiirkolonnkromatograafia teel (60% etüülatsetaat-heksaan) andis amiidi 22 (39 mg, 23%) valge tahkisena. Näidati, et amiid 22 eksisteerib 3:1 trans:cis karbamaadi konformeeride seguna, 13 C NMR-analüüsi teel (suhtarvu hinnati resonantside suhtelistest intensiivsustest tasemel δ 14,1 ja 1,7, mis on määratud vastavalt suuremate ja väiksemate konformeeride

58 7 EE - EP B1 1 karbamaadi karbonüül-c aatomitele): mp 0 3 C; [α]d 4, (c 1,2 CH2Cl2-s); vmax (kile)/cm , 3239, 3042, 293, 1736, 1712, 1627, 140, 14, 1417, 1439, 1374, 1282, 126, 1216, 1194, 1171, 116, 1136, 10, 81, 42,, 7, 93, 917, 876, 76 ja 701; δh (400 MHz, CDCl3) 1,33-1,3 (3H, br m, Proα-CH3), 1,62-2, (11H, m, Proβ-H2, Proγ-H2 ja 7 tsüklopentüül-h), 2,9-2,71 ( 1 H, br m, 1 tsüklopentüül-h), 3,31-3,42 ( 1 H, br m, Proδ-HAHB), 3,8-3,79 (4H, br m, OCH3 ja Proδ- HAHB), 4,92-,17 (3H, m, N-H ja OCH2Ph) ja 7,27-7,42 (H, s, Ph); δc (0 MHz, CDCl3) 21,7 (CH3, Proα-CH3), 24,1* (CH2, tsüklopentüül-c), 24,2 (CH2, tsüklopentüül-c), 24,4 (CH2, Proγ-C), 24, (CH2, tsüklopentüül-c), 36,4 (CH2, tsüklopentüül-c), 37,1 (CH2, tsüklopentüül-c), 37,2* (CH2, tsüklopentüül-c), 37,7 (CH2, Proβ-C), 38,2* (CH2, tsüklopentüül-c), 48, (CH2, Prοδ-C), 2,1 (CH3, OCH3), 66,6 (CH2, OCH2Ph), 66,9 (kvat, Proα-C), 67,2 (kvat, Glyα-C), 127,8 (CH, Ph), 128,2 (CH, Ph), 128,4 (CH, Ph), 136,6 (kvat, Ph), 14,1 (kvat, NCO2), 1,7* (kvat, NCO2), 170, (kvat, Gly-CO) ja 174,7 (kvat, CO2CH3); m/z (EI+) 388,1991 (M +. C21H28N2O nõuab 388,1998). * tähistab resonantsi, mis on määratud väiksemale konformeerile. (8aS)-metüül-1,3(4H)-tetrahüdropürrolo[1,2-a]pürasiin]-1,4(2H)-dioon tsüklopentüül-g-2mep) (tsükliline 2 30 Amiidi 22 (4 mg, 0,14 mmol) lahusele metanoolis (4,6 cm 3 ) lisati % Pd aktiivsöel (2,2 mg, 0,021 mmol) ja nõu uheti läbi gaasilise vesinikuga. Tekkinud suspensiooni segati jõuliselt vesiniku keskkonnas 17 h, seejärel filtreeriti läbi Celite -i padja metanooliga (1 cm 3 ). Filtraat kontsentreeriti kuivuseni vähendatud rõhu all, et anda kollane pooltahkis, mis puhastati pöördfaas-c18-kiirkolonnkromatograafia teel (0 % CH3CN/H2O; gradientelueerimine), et anda tsükliline tsüklopentüül-g-2mep ( mg, 6%) kollase tahkisena: mp C; [α]d 97,9 (c 1,61 CH2Cl2-s); vmax (kile)/cm , 296, 2928, 286, 1667, 1643, 1463, 1432, 1373, 1339, 124, 1224, 117, 86, 48, 976, 83, 774 ja 730; δh (300 MHz, CDCl3) 1,47 (3H, br s, 8a-CH3), 1,6-2,19 (11H, m, 8-H2, 7-H2 ja 7 tsüklopentüül), 2,8-2,67 ( 1 H, br m, 1 tsüklopentüül), 3,48-3,6 ( 1 H, m, 6-HAHB), 3,72-3,82 ( 1 H, m, 6-HAHB) ja 6,6 ( 1 H, br s, N-H); δc (7 MHz, CDCl3) 19,9 (CH2, 7-C), 24,6 (CH2, tsüklopentüül), 24,92 (CH3, 8a-CH3), 24,93 (CH2, tsüklopentüül), 36,0 (CH2, 8-C), 38,7 (CH2, tsüklopentüül), 41,9 (CH2, tsüklopentüül), 44,8 (CH2, 6-C), 64,3 (kvat, 8a-C), 66,8 (kvat, 3-C), 168,3 (kvat, 4-C) ja 172,2 (kvat, 1- C); m/z (EI+) 222,1369 (M +. C12H18N2O2 nõuab 222,1368). In vitro- ja in vivo-testimine

59 8 EE - EP B1 1 2 Järgmised farmakoloogilised uuringud demonstreerivad tsüklilise G-2-allüülP mõjusust kognitiivse häire nõrgendamisel. Nad ei ole mõeldud olema piiravad ning teisi käesoleva leiutise kohaseid kompositsioone ja meetodeid võib töötada välja tarbetu katsetamiseta. Kõiki neid kompositsioone ja meetodeid peetakse käesoleva leiutise osaks. Kõik järgmised katsed teostati, kasutades protokolle, mis töötati välja suuniste järgi, mille kiitis heaks Aucklandi Ülikooli loomaeetika komisjon või võrreldavad reguleerivad asutused. Nootroopiliste ravimite mõjusust võib mugavalt testida, kasutades koliinergilise hüpofunktsiooni mudeleid. On näidatud, et koliinergiline hüpofunktsioon soodustab dementsusega seotud kognitiivset allakäiku ja on endiselt terapeutilise sekkumise sihtmärk Alzheimeri tõve puhul (Hunter 04). Koliinergilise hüpofunktsiooni mudel on rakendatav ka teistele seisunditele. Näiteks on näidatud, et skopolamiinindutseeritud koliinergiline hüpofunktsioon võib selektiivselt häirida vastikuse ja viha näoilmete äratundmise täpsust, muutes skopolamiini toime emotsioonide äratundmisele sarnaseks nendega, mis leiduvad Huntingtoni tõve patsientidel (Kamboy 06). Skopolamiini on tavaliselt kasutatud koliinergilise hüpofunktsiooni indutseerimiseks ning on inimese Alzheimeri tõve, vananemise ja kognitiivse funktsiooni teiste häirete hästi tuntud mudel (Liskowsky et al., Int. J. Dev. Neurosci, 24(2-3): (06), Lindner et al., Psychopharmacology (Berl.) sept 27 (06), Bouger et al., Eur. Neuropsychopharmacol 1(3): (0), Ebert et al., Eur. J. Clin. Invest., 28(11): (1998), Barker et al., Int. J. Geriatr. Psychiatry, 13(4): (1998), G. Smith, Brain Res. 471(2):3 118 (1998), Flood et al., Behav. Neural. Biol. 4(2): (1986)). Näide. Kognitiivsele funktsioonile avalduvate tsüklilise G-2-allüülP toimete hindamiseks kasutatav õppimise ja mälu Morrise veelabürindi (Morris Water Maze Memory, MWM) mudel Uuringu otstarve oli uurida tsüklilist G-2allüülP-d kognitiivse defitsiidi ja afektiivse oleku (ärevuse) režiimides. Meetodid 30 Uuringu esimese osa hõlmas cg-2-allüülp ägedat testimist Morris veelabürindi (MWM) mälu mudelis. MWM-test on üks kõige sagedamini kasutatavatest testidest ruumilise mälu hindamiseks rottidel ja on üldtunnustatud ruumilisele mälule avalduvate haiguse

60 9 EE - EP B1 ja ravi toimete täpse prognoosimise poolest üldiselt. Seega peegeldab MWM-test haiguse ja ravi toimeid inimindiviididel. Järgiti MWM standardprotseduuri. Kasutasime läbipaistmatu veega täidetud ringikujulist ujumisbasseini (80 cm sügavus cm läbimõõt), temperatuuriga, mida säilitati C juures. Platvorm oli peidetud 1 cm veepinnast allpool, valge lipuga ( cm cm), mis asus kas cm platvormist kõrgemal visuaalse märguande puhul ja kella 3 asendis lähteasukoha suhtes ruumilise märguande puhul. Katse päevadel 1 4 läbisid rotid mälu omandamise uuringud 6 uuringuga (igaüks 60 sekundit) testimise igal päeval (harjumisfaas). Salvestati latentsus platvormile jõudmisel ja keskmise latentsuse igapäevast vähendamist kasutati, et mõõta võimet õppida, kus peidetud platvorm on. Katse päeval jagati normaalsed, mittevananenud Wistari rotid rühmadeks, et saada kas soolalahust (n = 28) või skopolamiini (0, mg/kg, i.p., n = 27) mälu defitsiidi indutseerimiseks. Skopolamiin manustati pool tundi enne sonditesti alustamist. 1 min pärast skopolamiiniga töötlemist manustati tsükliline G-2allüülP oraalselt tasemel 30 mg/kg (n = 31), kusjuures vehiikliga ravitud loomadele manustati lahjendit oraalse sundsöötmise teel, kasutades identset raviprotokolli (n = 24). Ägedaid cg-2-allüülp toimeid testiti seejärel skopolamiinindutseeritud mälu häirega loomadel ja samaealistel mälu häireta kontroll-loomadel ükskõik millise mälu töötlemisele avalduva otsese farmakoloogilise toime määramiseks. Katserühmad on esitatud üksikasjalikult tabelis 4 allpool. Tabel 4. Mälule avalduvate cg-2-allüülp toimete testimiseks kasutatud loomad Skopolamiin Vehiikel Vehiikel N = 12 N = 12 cg-2-allüülp N = 1 N = 16 2 Päeval teostati sondi MWM-test eemaldatud platvormiga. Oli 6 uuringut, igaüks maksimaalse kestusega 60 s, vähemalt min puhukust uuringute vahel. Aja hulk, mis rotid kulutasid platvormi lähedal ujudes, andis mõõdiku, kui palju nad sõltuvad visuaalsest ja ruumilisest märguandest platvormi asukoha leidmisel võrreldes

61 60 EE - EP B1 mitteruumilise strateegia kasutamisega. Andmed koguti ja analüüsiti, kasutades tarkvara Any-maze (v4.2). Käitumistestidest genereeritud andmeid analüüsiti, kasutades ühefaktorilist dispersioonanalüüsi (analysis of variance, ANOVA) erinevuse määramiseks vananenud rühmade vahel. Käitumistulemuste edenemise uurimiseks kasutati kahefaktorilist ANOVA-t, kusjuures ajapunkte koheldi sõltuvate faktoritena. Andmeanalüüsiks kasutati GraphPad Prismi versiooni Tulemused Töötlemine skopolamiiniga nõrgendas oluliselt ruumilise mälu omandamist ravitud loomadel (aeg platvormini ligikaudu 8% kontrollist päeval 4). Tsükliline G-2allüülP (30 mg/kg; iga päev) pööras oluliselt ümber kognitiivse häire, mille indutseeris skopolamiin (joonised fig 1A, 1B, 1C). Näide 6: cg-2-allüülp parandab sünaptilist plastilisust ja vananemisega seotud mälu kaotust Meetodid Vananenud rotid (isased Wistari rotid, 18 kuud vanad) jagati nelja rühma: kaks vehiikliga ravitud (rühmad 1 ja 3) ja kaks G-2-allüülP-ga ravitud (rühmad 2 ja 4) (all rühmad n = 6 8). Tsükliline G-2-allüülP sünteesiti meditsiinilise keemia osakonnas ja lahustati normaalses soolalahuses enne ravi. Päeval anti tsüklilise G-2-allüülP 1 üksik annus tsentraalselt ( ng/loom, i.c.v.) loomadele rühmades 2 ja 4; soolalahust manustati rühmadele 1 ja 3. Mälutestid, milles kasutati uudse eseme äratundmise testi, algasid kas päeval 3 (rühmad 1 ja 2) või 24 (rühmad 3 ja 4) pärast ravi. NORT-i lõpulejõudmisel surmati rotid naatriumpentobarbitaali üleannusega ja voolutati transkardiaalselt tavalise soolalahusega, millele järgnes % formaliin. Koed koguti päeval 7 rühmades 1 ja 2 ning päeval 28 rühmadest 3 ja 4. Ajusid hoiti samas kinnistis minimaalselt 2 päeva enne töötlemist, kasutades standardset parafiini sulundamise protseduuri. Lühidalt, väiksed koe plokid ( 3 mm) fikseeriti kuni 24 h. Plokid infiltreeriti seejärel ja sulundati parafiiniga ning lõigati ribadeks ja kinnitati alusklaasidele. Alusklaase säilitati seejärel kuni immunovärvimise alustamiseni. Sünaptogeneesi ajukoes uuriti, kasutades immunohistokeemilist värvimist. Uudse eseme äratundmise test (NORT)

62 61 EE - EP B1 1 Avastamisaktiivsus on tüüpiline õppimiskäitumine, mida loomad, sealhulgas inimesed ja rotid, ilmutavad uudsetes keskkondades. Avastamisaktiivsus väheneb aja jooksul, kui uudne muutub tuttavaks ja toimub harjumine. Tuttavas keskkonnas võib avastamisaktiivsuse reaktiveerida, tuues sisse uudse eseme. Avastamiskäitumise suurenemine pärast keskkonna muutumist pärast harjumist annab mälu mõõdiku lähedase tutvuse ja uudsuse äratundmise puhul. Selles näites teostasime kaks NORT-i, ühe päevadel 3 6 ja teise päevadel Rottidel võimaldati tutvuda testimisareeniga ( cm) NORT-i esimesel päeval. Iga testi järgmisel kahel päeval paigutati neli uudset eset testimisareeni ja rottidel oli 2 uuringut iga päev (iga üks 1 min kestusega ja 2-tunnise vahega). Aeg, mis kulub esemete avastamisele, vähenes pärast seda, kui testitud loom esemetega tutvus (koolitusefaas). Viimasel päeval (iga test päeval 4) asendati üks tuttav ese uudse esemega enne teist uuringut (test 6, testimisfaas). Keskmist aega, mis kulub 3 tuttava eseme avastamisele, ja aega, mis kulub uudse eseme avastamisele, kasutati lähedase tutvuse mälu ja uudsuse äratundmise mõõdikuna. cg-2-allüülp toimed NMDA-retseptorite, AMPA-retseptorite, rkrox-24 ja sünaptofüsiini mrna ekspressioonile hipokampuses 2 Ollakse nõus, et hipokampuse moodustised inimestel ja loomadel mängivad üliolulist rolli hulga mälutüüpide puhul (Morris et al., 06 Europ. J. Neurosci. 23, 2829). Spetsiifiline funktsionaalsus on endiselt vaieldav, kuid mõistetakse, et hipokampus mängib olulist rolli läbitud kogemuste automaatses kodeerimises ja esialgses salvestamises (episoodilise mälu moodustamine), mälu konsolideerimises ja uudsuse tuvastamises. Esimene eripära, mälestuste kodeerimine ja lühiajaline salvestamine, on sõltuvad sünaptilisest plastilisusest ja sünaptilisest transmissioonist, mis mõlemad on seotud glutaminergilise neurotransmissiooniga. Glutaminergilist transmissiooni hõlbustavad kaht tüüpi glutamaadi retseptorid: N- metüül-d-aspartaadi retseptorid (N-methyl-D-aspartate receptor, NMDAR) ja a-amino- 3-hüdroksü--metüül-4-isoksalooni propioonhappe retseptorid AMPA või mitte-nmdaretseptorid. 30 APMA-retseptori allühik GluR1 on postsünaptiline retseptor ja seda on tavaliselt kasutatud mälu mõõtmiseks. GluR1 vahendab arvatavasti kaltsiumi sissevoolu ning sellel on elutähtis funktsioon õppimisega seotud sünaptilises plastilisuses. Eelnevalt

63 62 EE - EP B1 on pakutud välja (Hayashi et al., 00), et GluR1 lisamine sünapsidesse võib olla oluline pikaajalise võimenduse (LTP) seisukohast, mis on oluline õppimise ja mälu seisukohast. Oli demonstreeritud, et NMDA-retseptori allühik NR1 on ülioluline ruumilise mälu moodustumiseks. Väljalülitusega mudelites, kus NMDA-retseptori R 1 -allühik CA1- piirkonna püramiidrakkudes lülitati selektiivselt välja, näidati, et pikaajaline võimendus on tühistatud (Tsien 1996). Sünaptofüsiin on presünaptiline vesiikulivalk. Selle kvantitatiivne tuvastamine tehakse kindlaks sünaptilise tiheduse molekulaarse markerina. 1 Neuronaalse transkriptifaktori Krox24 värvimist kasutatakse neuronaalse plastilisuse markerina. Krox24-perekonna valguproduktid (ning ajust pärineva neurotroofse faktoriga, BDNF) on hiljuti seostatud stabiliseerivate sünaptiliste modifikatsioonidega, mis toimuvad NMDA-retseptorvahendatud hipokampuse LTP ja pikaajalise depressiooni (long-term depression, LTD) ajal. (Dragunow. 06. Behaviour genetics. 23; 293). Immunohistokeemiline värvimine Kasutati tavapäraseid deparafinisatsiooni- ja rehüdratsioonitehnikaid, et võimaldada veepõhistel puhvritel ja antikehadel koelõikudesse tungida. Antigeeni võtmist kasutati ainult enne AMPA-retseptori (GluR1) värvimist, see tähendab, alusklaasid paigutati keevasse tsitraatpuhvrisse ja neil lasti jahtuda. Kasutati järgmisi antikehi: 2 i) NMDA NR1 allühiku vastane primaarne küüliku antikeha, kontsentratsioonis 1:0 puhvris, mida inkubeeriti 48 h (Chemicon AB116), millele järgnes Sigma fluorestseeruv sekundaarne antikeha (alexafluor 94), lahjendusega 1:0, mida inkubeeriti 24 tundi temperatuuril 40 C. ii) AMPA GluR1 allühiku vastane primaarne antikeha, kontsentratsioonis 1:0 puhvris, mida inkubeeriti 48 h (Chemicon AB4), millele järgnes 3,3'- diaminobensidiin (DAB) lahjendusega 1:0, mida inkubeeriti 24 tundi temperatuuril 40 C.

64 63 EE - EP B1 ii) msünaptofüsiini (Sigma S768) vastane primaarne antikeha, kontsentratsioonis 1:0 puhvris, millele järgnes DAB lahjendusega 1:0, mida inkubeeriti 24 tundi temperatuuril 40 C. iv) rkrox-24 (Santa Cruz katalooginumber SC-189) vastane primaarne antikeha kontsentratsioonis 1:0 puhvris, millele järgnes küülikuvastane sekundaarne antikeha kontsentratsioonis 1:0 lahjenduses, mida inkubeeritakse 24 tundi temperatuuril 40 C. (e) Antikehad tuvastati, kasutades valgusmikroskoopiat. Tulemused NORT Uudsuse äratundmise parandamise suundumust cg-2-allüülp-ga ravitud rühmades täheldati pärast 27 päeva (joonis FIG 2), ent mitte 6 päeva pärast ravi (joonist ei ole). Järeldame, et cg-2allüülp-ravi parandab uudsuse äratundmist ravimiga ravitud loomadel 27 päeva möödumisel. 1 AMPA-glutamaadi retseptori 1 värvimine Hipokampuse lõigud piirkondadest CA1 (granulaarrakuline kiht, strata oriens ja radiatum) ja CA3 (püramiidrakkude kiht) värviti AMPA-retseptorite GluR1 suhtes. CA3-s ei olnud retseptorite arvu muutust igas piirkonnas kas päeval 7 või 28. Esines siiski AMPA-retseptorite arvu oluline suurenemine CA1-s (granulaarrakuline kiht) (joonis FIG 4) ja CA1 stratum oriens'is (joonis FIG ) ja päeval 28. See histoloogiline muutus oli korreleerunud paranenud sooritusega uudse eseme äratundmise testis. Paranenud mälu (joonis FIG 2) oli korreleerunud kõrgenenud AMPA-glutamaadi retseptoriga 1 (joonis FIG 3). Järeldasime, et cg-2-allüülp parandab glutaminergilist neurotransmissiooni (GluR1) postsünaptilisel tasandil. 2 Täheldasime, et cg-2-allüülp-ravi andis tulemuseks GluR1 värvimise pikaajalise suurenemise postsünapsidel ja suurendas presünaptiliste vesiikulite tihedust. Kuna enamik vesiikuleid hipokampuses on glutamiinivesiikulid, järeldasime, et pikaajalise mälu paranemine oli assotsieerunud suurenenud glutamiini neurotransmissiooniga. Sünaptofüsiini värvimine

65 64 EE - EP B1 Seejärel analüüsisime cg-2allüülp toimet sünaptofüsiini värvimise tasemetele hipokampuse CA3- ja CA1-piirkonnas. Kõikides testitud piirkondades oli kas oluline suurenemine (CA3) või selge suundumus (CA1 strata oriens ja radiatum) sünaptofüsiini värvimise tiheduse suurenemise suunas 28 päeva jooksul pärast ravi. See suurenemine on suurenenud sünaptilise plastilisuse tähis ja sünaptogeneesi selge näidik, mis on ravitud rühmade soorituse paranemise tõenäolisim põhjus rakendatud mälutestides. NMDA-retseptori 1 värvimine Ehkki esineb AMPA-retseptorite oluline paranemine pärast ravi, ei ole NMDAretseptorite muutused nii silmatorkavad (joonised fig 9A, 9B ja 9C). Krox24-värvimine 1 Analüüsisime Krox24-värvimise tihedust hipokampuse CA1-2-piirkondades. Täheldasime suundumust suurenenud tiheduse suunas ravirühmas võrreldes vehiikliga ravitud rühmaga. Järeldame, et Krox24-värvimise tulemused korreleeruvad positiivselt paranenud mälu funktsiooniga (joonis FIG ). Näide 7: cg-2-allüülp suurendab presünaptiliste vesiikulite arvu keskeas rottide hipokampuses Meetodid 2 30 Neli keskeas isast Wistari rotti (12 kuud) jagati kaheks rühmaks: vehiikliga ravitud (n = 2) ja cg-2-allüülp-ga ravitud (n = 2). Rotte raviti subkutaanselt kas soolalahuse või cg-2-allüülp-ga 3 mg/kg päevas 7 päeva. Katse päeval 21 loomad surmati ja eemaldati hipokampuse kude. Koe poolõhukesed lõiked fikseeriti OsO4-ga ja sulundati vaiku. CA1 stratum oriens ja CA3 lõiked lõigati seejärel üliõhukesteks, 80 nm lõikudeks ja värviti uranüülatsetaadi ja pliitsitraadiga. Analüüsiti ligikaudu 0 sünapsi looma kohta, sünapsi tüüp klassifitseeriti ja vesiikulite tihedust mõõdeti, kasutades AnalySIS -i. Transmissioonelektronmikroskoopiat kasutati vesiikulite koguarvu loendamiseks alusklaasidel. Keskmine tihedus arvutati, mõõtes kogupindala (kasutades tarkvara AxioVision) ning kasutades vesiikulite arvu. Järgisime protokolli allikast Yoshida et al., 97, Journal of Neurochemistry, et arvutada vesiikulite tihedus 0 nm 0 nm ruudus, mis asuvad postsünaptiline tiheduse (post-synaptic density, PSD) lähedal. Tulemused

66 6 EE - EP B1 Joonis FIG 6 on graafik, mis näitab cg-2-allüülp toimet presünaptilise värvimise tiheduse suurendamise trendile hipokampuse CA3-piirkonnas päeval 24 pärast ravi. Joonis FIG 7 on graafik, mis näitab cg-2-allüülp toimet presünaptilise värvimise tiheduse suurendamise trendile CA1-piirkonna stratum oriens'is päeval 24 pärast ravi. Joonis FIG 8 on graafik, mis näitab cg-2-allüülp toimet presünaptilise värvimise tiheduse suurendamiseks CA1-piirkonna stratum radiatum'is päeval 24 pärast ravi. Presünaptiliste vesiikulite arvu hipokampuse CA1- ja C3-allpiirkonnas suurendati pärast cg-2-allüülp-ravi (3 mg/kg päevas 7 päeva, s.c.) võrreldes vehiikliga ravitud loomadega 21 päeva pärast ravi (joonis FIG 11). 1 Järeldame nendest uuringutest, et skopolamiiniga töötlemine võib vähendada kognitiivset funktsiooni loomadel ning et need muutused võivad jäljendada kognitiivset häiret inimestel, kellel on üks või enam erinevat neuroloogilist seisundit. Lisaks järeldame, et cg-2-allüülp võib parandada kognitiivset funktsiooni skopolamiiniga töödeldud loomadel ja loomadel, kellel on normaalne vananemisega seotud kognitiivne häire. Lisaks järeldame, et cg-2-allüülp võib suurendada sünaptogeneesi, suurendada AMPA-retseptoreid, suurendada neuraalset plastilisust, võib stabiliseerida sünaptilisi modifikatsioone ja võib suurendada uudsuse äratundmist. Need uuringud toetavad seega cg-2-allüülp kasutust efektiivse farmakoloogilise toimeainena erinevate kognitiivsete häirete ravimiseks loomadel, sealhulgas inimestel, kellel on Alzheimeri tõbi, Parkinsoni tõbi ning teised kroonilised neuraalsed häired ning vananemisega seotud kognitiivne häire. Näide 8. Tsüklilise G-2-allüülP ja tsüklilise tsüklopentüül-g-2mep toimed väikeajurakkude eksplantaatidele 2 30 cg-2-allüülp ja tsüklilise tsüklopentüül-cg-2-allüülp toimete määramiseks neuronaalsetel rakkudel in vitro, teostati rida uuringuid, kasutades väikeaju eksplantaate täiskasvanud rottidelt. In vitro-süsteemid on sobivad neuronaalse proliferatsiooni, neuriitide kasvu, närvikimpude moodustumise ning neuronitele avalduvate toksiinide toimete, in vivo täheldavate toimetega paralleelsete toimete, uurimiseks. Seega prognoosivad uuringute tulemused, milles kasutatakse in vitro väikeaju eksplantaate, sekkumiste toimeid in vivo.

67 66 EE - EP B1 Esimeses uuringute seerias määrati glutamaadi toimed väikeaju eksplantaatidele. Füsioloogilistes kontsentratsioonides on glutamaat neurotransmitter imetajate, sealhulgas inimeste, KNS-is. Siiski on glutamaat piisavalt kõrgetes kontsentratsioonides neurotoksiline, andes tulemuseks neuronaalse rakusurma. Kuna glutamaat on looduslikult esinev neurotransmitter imetajate, sealhulgas inimeste, KNS-is ning kuna glutamaadi neurotoksilisus on tehnika tasemes tunnustatud peegeldavana neurotoksilisust üldiselt ning sealhulgas rakusurma ja degeneratsiooni, on see väärtuslik tööriist, mis on kasulik neurodegeneratsiooni ja neuronite surma ravis efektiivsete toimeainete tuvastamiseks ja iseloomustamiseks. Materjalid ja meetodid Katteklaasid paigutati suurde Petri tass ja uheti 70% alkoholis minutit, seejärel uheti Millipore'i H2O-ga. Katteklaasid õhkkuivatati ning kaeti polü-d-lüsiiniga (1 mg/ml põhilahus PBS-is, 90 0 µl) 2 tundi temperatuuril 34 C. Väikeajukoe ekstraheerimine Uuringuks kasutati sünnijärgse päeva 8 Wistari rotte. Rotid surmati ja paigutati jäässe 1 minutiks, peatustati ning väikeaju eemaldati ja paigutati jääle. Väikeajukude paigutati 1 ml 0,6% glükoostäiendatud PBS-i ( µl 6% põhilahus D (+)glükoos / 1 ml PBS) suures Petri tassis, tükeldati väiksemateks lõigeteks ja tritureeriti 1 ml insuliini süstlaga 23 G (0,4 mm) nõela kaudu ning pritsiti seejärel tagasi glükoosilahusesse suures Petri tassis. Kude sõeluti läbi (12 µm pooride suurusega marli) ja tsentrifuugiti (2 minutit tasemel 60 g) kaks korda keskkonna vahetamiseks seerumivaba BSA-ga täiendatud START V keskkonnaks (Biochrom, Saksamaa). Teine tsentrifuugimise samm tehti 1 ml START V keskkonnaga. Mikroeksplantaadid muudeti kasutuskõlblikuks 00 µl START V keskkonda ja pandi jääle. Väikeajurakkude kultiveerimine Kaks tundi pärast PDL-pinnet uheti alusklaase Millipore'i H2O-ga ja õhkkuivatati. Iga alusklaas paigutati väiksesse Petri tassi (läbimõõt: 3 mm) ja lisati 40 µl START V rakususpensiooni. Kude inkubeeriti 2 tundi temperatuuril 34 C (sadestusperiood). START V-keskkond (1 ml) lisati seejärel Petri tassi ja kultiveeriti temperatuuril 34 C % CO2 manulusel õhus 0% niiskuse juures 48 tundi. Ravimi rakendus

68 67 EE - EP B1 Uuringu jaoks eksponeeriti teatud eksplantaadikultuurid ainult vehiiklile (PBS). Esimeses uuringus rakendati (uuring 1) µl toksiini 1 (L-glutamaat 0 mm Millipore'i vees; lõplik kontsentratsioon: 1 mm) ja µl toksiini 2 (3-nitropropioonhape 0 mm ph 7 Millipore'i vees, lõplik kontsentratsioon: 0, mm) samaaegselt testitava ravimiga ( mm põhilahus valmistati PBS-is ja lahjendati lõplike kontsentratsioonideni 1 0 nm). Igal juhul jäeti ravimid uuringu kestuse jooksul eksplantaatidega kokkupuutesse. Meetodid ravimi toimete määramiseks 1 Pärast eksplantaatide eksponeerimist ravimitele uuringuperioodi jooksul loputati rakke seejärel PBS-is ja fikseeriti seejärel paraformaldehüüdi suurenevates kontsentratsioonides (rakendati 00 µl 0,4% PFA; seejärel 1,2% PFA; seejärel 3% PFA ja lõpuks 4% PFA (iga fikseerimissamm: 2 3 minutit). Lõpuks loputati mikroeksplantaate PBS-is. Neuroneid eksplantaatides hinnati seejärel morfoloogia (neuriidide olemasolu) suhtes ja loendati elusrakkudena mikroskoobi vaatevälja kohta. Loendati neli kõrgeimat rakutihedust ilmutanud välja katteklaasi kohta ja andmed esitati kui keskmine ± keskmise standardhälve (standard error of the mean, SEM); igaüks n = 4. Statistilist olulisust hinnati, kasutades mitteseotud Studenti t-testi. Tulemused, tsükliline G-2-allüülP 2 Uuringu tulemused on näidatud joonisel FIG 12. Glutamaadiga töötlus (1 mm; täidetud tulp) andis tulemuseks väikeaju neuriide omavate neuronite umbes 8% kaotuse võrreldes vehiikliga ravitud kontrollidega (avatud tulp). Seevastu cg-2-allüülp suurendas oluliselt rakkude arvu, millel on neuriidid annussõltuval viisil manustamisel samaaegselt glutamaadiga (viirutatud tulbad). Ravi cg-2-allüülp madalate annustega (0 pm kuni nm) näitas glutamaat-indutseeritud neurotoksilisus olulist vähenemist. Tsükliline tsüklopentüül-cg-2-allüülp 30 Uuringu tulemused on näidatud joonisel FIG 13. Tsükliline tsüklopentüül-g-2mep suurendas oluliselt rakkude arvu, millel on neuriidid, samaaegsel manustamisel glutamaadiga (heleda viirutusega tulbad). Ravi tsüklilise tsüklopentüül-g-2mep madalate annustega näitas glutamaat-indutseeritud neurotoksilisuse olulist vähenemist.

69 68 EE - EP B1 Järeldused Nii cg-2-allüülp kui tsükliline tsüklopentüül-cg-2-allüülp vähendasid või ennetasid sõltumatult glutamaat-indutseeritud neurotoksilisust, näidates, et mõlemad ravimid on närve kaitsvad ja neid võib kasutada neuronaalse degenereerimise või rakusurma inhibeerimiseks. Näide 9. cg-2-allüülp toimed hüpoksilis-isheemilisele vigastusele I Materjalid ja meetodid Selle määramiseks, kas cg-2-allüülp võib hoida ära neuronaalse vigastuse vastusena insuldile, koronaararteri šunteerimise (cardiac arterial bypass graft, CABG) operatsioonile või teistele hüpoksilistele vigastustele, teostati rida uuringuid rottidel, keda oli eksponeeritud hüpoksilis-isheemilisele (hypoxic-ischemic, HI) vigastusele. Kasutati täiskasvanud rotte (Wistar, g, isased). Kasutati modifitseeritud Levine'i mudeli valmistamist ja katseprotseduure (Rice et al., 1981, Ann. Neurol.:9: ; Guan et al., J., 1993, Cereb. Blood Flow Metab.: 13(4): ). Lühidalt, need protseduurid koosnevad HI-vigastusest, mis on indutseeritud unilateraalse unearteri ligeerimisega, millele järgneb inhalatsiooniasfüksia loomadel, kellel on implanteeritud lateraalne vatsakese kanüül. Juhtkanüül paigutati stereotaksiliselt 1, mm kõvakesta peale keskjoonest paremale ja 7, mm interauraalse nulltasandi suhtes ettepoole halotaananesteesia all. Parem unearter topeltligeeriti kaks päeva pärast kanüülimist. Pärast 1 tundi taastumist anesteesiast paigutati igaüks rottidest inkubaatorisse, kus niiskus (90 ± %) ja temperatuuri (31 ± 0, C) olid reguleeritud veel tunni, seejärel eksponeeriti hüpoksiale (6% hapnik) min. Loomi hoiti inkubaatoris täiendavad 2 tundi enne ravi. Üheksat paari rotte raviti intratserebraal-ventrikulaarselt (intracerebral ventricularly, icv) kas cg-2-allüülp (2 ng) või selle vehiikliga (tavalise soolalahusega) 2 tundi pärast hüpoksilis-isheemilist vigastust. Rottidele igas rühmas infundeeriti samaaegselt cg-2- allüülp või selle vehiikel kerge anesteesia all (1,% halotaan) 2 tundi pärast vigastust. Kogumaht µl infundeeriti (icv) minuti jooksul mikroinfusioonipumbaga. Histoloogiline uuring teostati rottidega päeva pärast hüpoksilis-isheemilist vigastust. Rotid surmati naatriumpentobarbitaali üleannusega ja voolutati transkardiaalselt tavalise soolalahusega, millele järgnes % formaliin. Ajusid hoiti samas kinnistis

70 69 EE - EP B1 minimaalselt 2 päeva enne töötlemist, kasutades standardset parafiini sulundamise protseduuri. Koronaalsed lõiked 8 µm paksusega lõigati juttkehast, suurajukoorest ja hipokampusest ja värviti tioniini ja happe fuksiiniga. Histoloogilist tulemust hinnati kolmel tasemel: (1) juttkeha kesktase, (2) see, kus lõpetatud hipokampus esimesena ilmus, ja (3) tase, kus hipokampuse ventraalne sarv parajasti ilmub. Koekahjustuse raskusastmele määrati skoor juttkehas, korteksis ja CA1-2-s, CA3-s, CA4-s ja hipokampuse hammaskäärus. Koekahjustus tuvastati neuronaalse kaotuse (atsidofiilne (punane) tsütoplasma ja kontraheerunud tuumad), pan-nekroosi ja rakureaktsioonidena. Koekahjustusele määrati skoor, kasutades järgmist skoori määramise süsteemi: 0: koel ei ilmnenud koekahjustust, 1: <% kude oli kahjustunud, 2: <0% kude oli kahjustunud, 3: >0% kude oli kahjustunud ja 4: >9% kude oli kahjustunud. Tulemused ja kokkuvõte 1 2 Selle uuringu tulemused on näidatud joonisel FIG 14. Joonis FIG 14 näitab, et hüpoksilis-isheemiline vigastus (iga kogumi vasakud tulbad) andis tulemuseks olulised kahjustuste skoorid igaühes uuritud ajupiirkondadest. Joonis FIG 14 näitab ka, et cg- 2-allüülP (iga kogumi paremad tulbad; 2 ng) suhteliselt madala annuse keskne manustamine vähendas oluliselt koekahjustust igas uuritud ajupiirkonnas võrreldes vehiikliga ravitud rühmaga (p < 0,001). Võib näha, et cg-2-allüülp võib olla närve kaitsev närvikahjustuste vastu, mida põhjustas hüpoksilis-isheemiline vigastus, isegi manustamisel pärast hüpoksilisisheemilist vigastust. See üllatav leid näitab, et cg-2-allüülp on kasulik toimeaine erinevate seisundite ravimiseks, mida iseloomustab neuraalne degeneratsioon või rakusurm. Näide. cg-2-allüülp toimed hüpoksilis-isheemilisele vigastusele II Materjalid ja meetodid 30 Kasutati näites 9 kirjeldatud materjale ja meetodeid ja suurendati ravirühmade arvu. Rotid jagati ravirühma, keda raviti intratserebraal-ventrikulaarselt (icv) ühega cg-2- allüülp 4 annusest või selle vehiikliga (normaalne soolalahus) 2 tundi pärast hüpoksilis-isheemilist insulti (1: n =, 2 ng; 2: n = 9, 4 ng; 3: n = 9, ng; 4: n =, 0 ng ning : n = 9, vehiikel).

71 70 EE - EP B1 Tulemused 1 Joonis FIG 1 näitab, et hüpoksia eraldi (vehiikel) annab neuronaalsete kahjustuste skoorid kõikides uuritud ajupiirkondades. cg-2-allüülp-ga ravitud loomadel oli hüpoksial vähem toimet, ehkki toimeaine manustati pärast hüpoksilist/isheemilist vigastust. Närve kaitsvat toimet täheldati cg-2-allüülp kõikide annuste puhul, välja arvatud kõrgeima annuse (0 ng) puhul, mis juttkehasse manustati. Siiski kõikides teistes kohtades ja kõikide teiste annustega vähendas cg-2-allüülp hüpoksia/isheemia närvikahjustuste toimeid. Lisaks oli cg-2-allüülp-l suurenenud mõjusus ajupiirkondades, milles esines viivitusega rakusurmaga assotsieerunud progressiivne vigastus, nagu apoptoosiga assotsieerunu. Ajupiirkondades, nagu hammaskäär ja suurajukoor, mis on resistentsemad HI vigastuse suhtes, on vigastuse progressioon teadaolevalt aeglasem ja raskem kui ajupiirkondades, mis on tundlikumad HI vigastuse suhtes, nagu juttkeha ja hipokampuse CA1-2-, CA3- ja CA4-allpiirkonnad. See tulemus näitab, et cg-2-allüülp võib olla soodne krooniliste neuroloogiliste häirete ravis. Näide 11. cg-2-allüülp toimed fragiilse X-i sündroomi puhul I Üldised meetodid 2 30 Katsed teostati kooskõlas Ühendkuningriigi loomade (teaduslike protseduuride) seadusega (1986). Fmr1-KO2 hiired ja metsiktüüpi (wildtype, WT) pesakonnakaaslased genereeriti C7BL/6J taustaga ja ristati korduvalt tagasi C7BL/6J taustaga enam kui kaheksa põlvkonna jooksul ja saadeti ettevõttest Jackson Laboratory Tšiilisse. Hiiri peeti rühmades (4 6 puuri kohta) ja kõikidele loomadele anti ad libitum toitu ja vett, kui ei ole öeldud vastupidi. Hiirtel säilitati 12 h valguse/pimeduse tsükkel (tuled väljalülitatud ) reguleeritud temperatuuriga keskkonnas (21 ± 1 C). Ülesanded teostati kirjeldatud järjekorras, kusjuures teostati mitte enam kui üks ülesanne päevas. Kõik katsed olid pimedad teste teostava uurija ja hiirtele süstiva isiku suhtes. Parameetriandmeid analüüsiti, kasutades kahefaktorilisi ANOVA-sid (genotüüp ja sugu indiviididevaheliste faktoritena). Kui andmed rikkusid dispersiooni normaalsuse või võrdsuse eeldusi, kasutati transformatsioone (log või ruutjuur). Korduvate mõõdikute ANOVA-de puhul testiti dispersiooni homogeensust, kasutades sfäärilisuse Mauchly testi, ning juhul, kui seda rikuti, kasutati Huyni-Feldti parandusi.

72 71 EE - EP B1 Mitteparameetriandmed analüüsiti, kasutades Manni-Whitney U-teste. p- väärtust < 0,0 peeti läbivalt statistiliselt oluliseks. Toksilisuse juhtumeid ei ole täheldatud. Loomi kontrolliti järgneva suhtes: karvastiku ilme erinevused, kas esineb mis tahes piloerektsioon, silmade seisund (vett jooksvad silmad või porfüüria, lau vaje) kõnnaku ilme, treemor, saba toonus, reageerivus käitlemisele jne. Näide 12. cg-2-allüülp toimed hipokampuse neuronitele loomadelt, kellel on fragiilse X-i sündroom Selle määramiseks, kas cg-2-allüülp võib mõjutada neuroneid, teostasime rea uuringuid neuronite kohta in vitro metsiktüüpi hiirtelt või fmr1 väljalülitusega hiirtelt. Meetodid 1 Hipokampuse rakukultuurid valmistati metsiktüüpi ja fmr1 väljalülitusega looteeas hiirtest (14 16 päeva gestatsiooni). Lühidalt, hiired surmati tservikaaldislokatsiooniga kloroformanesteesia all ning dissotsieeritud hipokampuse rakud külvati 1 mm mitme süvendiga nõudesse (Falcon Primaria). Kasutati % veiseloote seerumiga täiendatud MEM-Eagle'i sooladest (tarnitud glutamiinivabalt) külvamiskeskkonda. Kultuure hoiti temperatuuril 37 C niisutatud % CO2 keskkonnas. Pärast 3 d in vitro lisati rohelist fluorestseeruvat valku (green fluorescent protein, GFP) dendriitjätkete morfogeneesi jälgimiseks kultuuri kulu ajal (Ethell ja Yamaguchi, 1999; Ethell et al., 01, Henkemeyer et al., 03). Dendriitjätked moodustusid tavaliselt 7 14 päeval in vitro (DVI). 14 DIV ajaks oli enamik dendriitseid eendeid jätked. Keskmist (±standardhälve (standard deviation, SD)) lülisamba tihedust mõõdeti jätkete arvuna mikromeetri kohta ja katsed teostati kolmekordselt. Tulemused 2 Nende uuringute tulemused on näidatud joonistel fig 16A 16D. Joonis FIG 16A kujutab vaheseinaga kultuurikambrit neuronaalse morfoloogia mõõtmiseks. Joonis FIG 16B näitab mikrofotot hipokampuse neuronitest, mida on töödeldud cg-2- allüülp-ga ( NNZ 291 ) kontsentratsioonis 0, nm. Me ei täheldanud statistiliselt olulist muutust (keskmine ± SD, n = 3 sõltumatul katsel: 0,36 ± 0,02).

73 72 EE - EP B1 Seevastu näitab joonis FIG 16C mikrofotot kultuuris kasvatatud hipokampuse neuronitest, mida on töödeldud cg-2-allüülp-ga kontsentratsioonis nm (0,2 ± 0,03). Täheldasime statistiliselt olulisi toimeid võrreldes kontrollkultuuridega (0,26 ± 0,04). 1 Joonis FIG 16D näitab mikrofotot kultuuris kasvatatud hipokampuse neuronitest, mida on töödeldud cg-2-allüülp-ga. Olulist toimet lülisamba vähenemisele täheldati kultuurides, mida töödeldi cg-2-allüülp-ga kontsentratsioonis 0 nm (0,27 ± 0,). Me ei täheldanud statistiliselt olulist erinevust metsiktüüpi loomadest (0,26 ± 0,0). Järeldame nendest uuringutest, et cg-2-allüülp vähendab dendriitjätkeid in vitro ning see tulemus näitab, et cg-2-allüülp võib parandada neuroloogilist arengut ja funktsiooni in vivo ning võib seega olla kasulik fragiilse X-i sündroomi ravimisel hiirtel. Kuna fragiilse X-i sündroomi hiirmudelil on sama geneetiline mutatsioon, mis leidub inimestel, kellel on fragiilse X-i sündroom, võib cg-2-allüülp olla efektiivne inimeste ravimisel, kellel on fragiilse X-i sündroom. Näide 13. cg-2-allüülp toimed käitumisele loomadel, kellel on fragiilse X-i sündroom I: Ärevus ja mälu Selle määramiseks, kas cg-2-allüülp-l on soodne toime loomadel, kellel on fragiilse X- i sündroom, teostasime rea uuringuid mälu või harjumise kohta in vivo metsiktüüpi ja fmr1 väljalülitusega loomadel. Meetodid 2 Loomad fmr1 väljalülitusega 2 hiiri (C7BL/6 taust) peeti sama genotüüpi reguleeritud temperatuuri ja niiskusega ruumi 12 h valguse ja pimeduse tsükliga (tuled sisselülitatud kella 7-st hommikul kella 7-ni õhtul). Testimine teostati valge faasi ajal. Toit ja vesi olid saadaval ad libitum. Testimine teostati fmr1 väljalülitusega hiirtel ja nende metsiktüüpi pesakonnakaaslastel. Katsed teostati kooskõlas Ühendkuningriigi loomade (teaduslike protseduuride) seaduse (1986) nõuetega. Uuritud rühmad (igaüks n = ) loodi vastavalt järgmisele. 1. fmr-i väljalülitusega (knockout, KO) ravitud vehiikliga 2. Metsiktüüpi (Wt) ravitud vehiikliga fmr1 väljalülitusega (KO) ravitud cg-2-allüülp-ga ( NNZ-291 )

74 4. Metsiktüüpi (Wt) ravitud cg-2-allüülp-ga. Ärevuse avaväljakutest 73 EE - EP B Avaväljaku (OF) test on kombineeritud test, mida kasutatakse ärevuse/hüperaktiivsuse määramiseks ning harjumiseks uudse keskkonna suhtes, mis on üks elementaarseimaid õppimise vorme, milles vähenenud avastamist korduva samale keskkonnale ekspositsiooni funktsioonina peetakse mälu indeksiks. Seda uuritakse tavaliselt kahe avaväljakule ekspositsiooni seansi, min ja 24 h harjumisseansi käigus. Joonis FIG 17 kujutab fotot seadmest, mida kasutatakse nende uuringute jaoks. Avaväljak on eksponeeritud ruum, kus liikumist saab jälgida. Selleks uuringuks kasutatav seade on hall PVC-sse suletud areen 0 30 cm, mis on jagatud cm ruutudeks. Hiired tuuakse katseruumi min enne testimist. Hiir paigutatakse nurga vastas asuvasse nurgaruutu ja vaadeldakse 3 min. Loendatakse ruutude, millesse siseneti (terve keha), ja tagajalgadele tõusude (mõlemad esikäpad maapinnast lahti, kuid mitte puhastamise osana) arvu. Märgitakse latentsus esimese tagajalgadele tõusuni. Hiire liikumist väljal salvestati videojälgimisseadmega 300 s (vnt4.0, Viewpoint). Salvestati latentsuse hiire sisenemisel välja eredaimasse, kesksesse osasse, koguaeg, mis kulub selles keskses piirkonnas, ning koguaktiivsus (raja pikkusena sentimeetrites). Avaväljaku (OF) test on test, mida kasutatakse avastamiskäitumise, ärevuse ning või hüperaktiivsuse iseloomustamiseks loomadel, kes on harjunud igapäevase käitlemisega uudsetes ja tuttavas tingimustes. Avaväljakule ekspositsiooni ajal harjuvad hiired keskkonnaga ja avastavad seega vähem, vähendades liikumise kogust, mida nad aja jooksul ilmutavad. Käesolevas katses salvestasime liikumist ja tagajalgadele tõusmist esialgse ekspositsiooni (T1) ajal, teise ekspositsiooni ajal pärast minutit (T2) ja kolmanda ekspositsiooni ajal pärast 24 tundi (T3). Liikumise või tagajalgadele tõusu mittevähenemine minuti ja 24 tunni pärast näitab vastavalt lühikese ja pikaajalise mälu defitsiite. Tulemused, cg-2-allüülp vähendab ärevust loomadel, kellel on fragiilse X-i sündroom

75 74 EE - EP B1 1 Joonis FIG 18 näitab graafikuid OF-testi tulemustest, milles ruutude arv, millesse on sisenetud (vertikaalne telg), on kantud ravirühmadest igaühe puhul graafikule. Vehiikliga ravitud metsiktüüpi loomad (vasak tulp) läbisid T1-testperioodi ajal kogukauguse umbes 80 ruutu. Sarnaselt sisenesid cg-2-allüülp-ga ( NNZ 291 ) ravitud metsiktüüpi loomad (kolmas tulp vasakult) selle testperioodi ajal umbes samal arvul ruutudesse. Seevastu sisenesid vehiikliga ravitud fmr1 väljalülitusega loomad (teine tulp vasakult) sama ajaperioodi jooksul ruutudesse enam (p < 0,001). Selle toime suurusjärk oli statistiliselt oluline ja oluline, kusjuures need loomade sisenesid testperioodi T1 ajal umbes ruutu. Siiski leidsime ootamatult, et cg-2-allüülp ( NNZ 291 ) vähendas oluliselt fmr1 väljalülitusega loomade avastamiskäitumist (parem tulp), tulemustega, mis olid võrreldavad nendega, mis ilmnesid vehiikliga ravitud ja cg-2-allüülp-ga ravitud metsiktüüpi loomadel (kolmas tulp vasakult). Järeldame sellest tulemusest, et cg-2-allüülp vähendab ärevust fmr1 väljalülitusega loomadel. Kuna selles uuringus kasutatud fmr1 väljalülitusega hiirtel on sama geneetiline mutatsioon mis inimestel, kellel on fragiilse X-i sündroom, järeldame, et cg- 2-allüülP võib vähendada ärevust inimestel, kellel on fragiilse X-i sündroom. cg-2-allüülp parandab lühiajalist mälu loomadel, kellel on fragiilse X-i sündroom 2 30 Joonis FIG 19 näitab graafikuid OF-testi tulemustest perioodi T2 ( minutit) ajal, milles ruutude arv, millesse on sisenetud (vertikaalne telg), on kantud ravirühmadest igaühe puhul graafikule. Nagu tulemuste puhul punktis T1 (joonis FIG 18), demonstreerisid vehiikliga ravitud metsiktüüpi loomad (vasak tulp) ja cg-2-allüülp-ga ( NNZ 291 ) ravitud metsiktüüpi loomad (kolmas tulp vasakult) normaalset avastamiskäitumist, kusjuures iga rühm sisenes T2 ajal umbes 4 ruutu. T2- testperioodil läbitud kaugus oli vähem kui T1 ajal läbitud kaugus, näidates, et loomad olid muutunud selleks ajaks vähemalt osaliselt OF-testiga harjunuks. Vehiikliga ravitud fmr1 väljalülitusega loomadel (teine tulp vasakult) ilmnes oluliselt enam avastamiskäitumist kui kummalgi esimesest kahest loomade rühmast (p < 0,001). Tegelikult oli suurenemise suurusjärk umbes 2-kordne, kuni umbes 0 ruutu.

76 7 EE - EP B1 Seevastu leidsime ootamatult, et cg-2-allüülp vähendas fmr1 väljalülitusega loomade avastamiskäitumist (parem tulp) ning normaliseeris tegelikult nende käitumise suurusjärgu metsiktüüpi loomade omale. 1 2 Järeldame nendest tulemustest, et (1) fragiilse X-i sündroom hiirtel vähendas lühiajalist mälu või harjumist ning (2) cg-2-allüülp parandas lühiajalist mälu või harjumist fmr1 väljalülitusega loomadel. Kuna selles uuringus kasutatud fmr1 väljalülitusega hiirtel on sama geneetiline mutatsioon mis inimestel, kellel on fragiilse X-i sündroom, järeldame, et cg-2-allüülp võib parandada lühiajalist mälu inimestel, kellel on fragiilse X-i sündroom. cg-2allüülp parandab pikaajalist mälu loomadel, kellel on fragiilse X-i sündroom Joonis FIG näitab graafikuid OF-testi tulemustest perioodi T3 ajal, milles ruutude arv, millesse on sisenetud (vertikaalne telg), on kantud ravirühmadest igaühe puhul graafikule. Nagu tulemuste puhul punktis T1 (joonis FIG 18) ja T2 (joonis FIG 19), demonstreerisid vehiikliga ravitud metsiktüüpi loomad (vasak tulp) ja cg-2-allüülp-ga ( NNZ 291 ) ravitud metsiktüüpi loomad (kolmas tulp vasakult) normaalset avastamiskäitumist, kusjuures iga rühm sisenes T3 ajal umbes 2 30 ruutu. T3- testperioodil läbitud kaugus oli vähem kui T2 ajal läbitud kaugus ning vähenes täiendavalt võrreldes T1-s täheldatuga, näidates, et loomad olid muutunud üha harjunumaks ning neil oli parem pikaajaline mälu OF-testini ajaperioodiks T3. Seevastu ilmutasid vehiikliga ravitud fmr1 väljalülitusega loomad (teine tulp vasakult) oluliselt enam avastamiskäitumist (p < 0,001) kui vehiikliga ravitud või cg-2-allüülp-ga ravitud rühmad. Tegelikult oli suurenemise suurusjärk umbes 2-kordne, kuni umbes 0 ruutu. Huvitaval kombel ei suurenenud fmr1 väljalülitusega loomadel harjumine aja ja ekspositsiooniga OF-seadmele. Ruutude arv, millesse siseneti ajaperioodil T3, oli sarnane ajaperioodidel T2 või T1 leitutega. Leidsime ootamatult, et nagu lühiajalise mälu puhul, vähenes fmr1 väljalülitusega loomadel cg-2-allüülp oluliselt (teine tulp vasakult) ning tegelikult normaliseerunud avastamiskäitumise punktis T3 võrreldes vehiikliga ravitud Fmr1 väljalülitusega loomadega, näidates, et pikaajaline mälu või harjumine olid normaliseerunud. 30 Järeldused Järeldame nendest tulemustest, et (1) fmr1 väljalülitusega hiirtel ilmnes vähenenud pikaajaline mälu või harjumine ning (2) cg-2-allüülp parandas pikaajalist mälu või

77 76 EE - EP B1 harjumist fmr1 väljalülitusega loomadel. Kuna selles uuringus kasutatud fmr1 väljalülitusega hiirtel on sama geneetiline mutatsioon mis inimestel, kellel on fragiilse X-i sündroom, järeldame, et cg-2-allüülp võib normaliseerida pikaajalist mälu või harjumist inimestel, kellel on fragiilse X-i sündroom. Näide 14. cg-2-allüülp toimed käitumisele loomadel, kellel on fragiilse X-i sündroom II: Hüperaktiivsus Selle määramiseks, kas cg-2-allüülp-l on soodne toime hüperaktiivsusele loomadel, kellel on fragiilse X-i sündroom, teostasime rea uuringuid in vivo metsiktüüpi ja fmr1 väljalülitusega hiirtel. Meetodid Loomad 1 fmr1 väljalülitusega (KO2) hiiri (C7BL/6 taust) peeti sama genotüüpi reguleeritud temperatuuri ja niiskusega ruumi 12 h valguse ja pimeduse tsükliga (tuled sisselülitatud kella 7 hommikul kella 7 õhtul). Testimine teostati valge faasi ajal. Toit ja vesi olid saadaval ad libitum. Testimine teostati fmr1 väljalülitusega hiirtel ja nende metsiktüüpi pesakonnakaaslaste. Katsed teostati vastavalt Ühendkuningriigi loomade (teaduslike protseduuride) seaduse (1986) nõuetele. Loomad jagati nelja rühma: Vehiikliga ravitud metsiktüüpi Vehiikliga ravitud fmr1 väljalülitusega; cg-2-allüülp-ga ravitud metsiktüüpi ja cg-2-allüülp-ga ravitud fmr1 väljalülitusega. Järjestikuste käiguradade test 2 Ühes uuringus kasutasime järjestikuste käiguradade test seadme. See seade koosneb neljast järjestikusest, lineaarselt ühendatud järjest anksiogeensemast käigurajast. Iga järgnev käigurada värviti heledamat värvi, sellel olid madalamad seinad ja/või see oli kitsam kui eelmine käigurada. Loomad paigutati käiguraja 1 (A1) suletud otsa, näoga otsaseina poole. Latentsus esialgsel sisenemisel igale käigurajale (A2, A3 ja/või A4), aja hulk, mis kulub igal käigurajal, ning igale käigurajale sisenemiste arv salvestati kogutestiaja jooksul 300 sekundit.

78 77 EE - EP B1 Järjestikuste käiguradade testi puhul mõõtsime sisenemiste arvu käigurajal 1 (A1), käigurajal 2 (A2), käigurajal 3 (A3) ning käigurajal 4 (A4) iga ühe puhul 4 eespool kirjeldatud loomade rühmast. Tulemused 1 Joonised fig 21 ja 22 kujutavad järjestikuste käiguradade testi tulemusi. Joonis FIG 21 kujutab graafikut tulemustest, mis on saadud vehiikliga ravitud loomadel. Joonis FIG 22 kujutab graafikut tulemustest, mis on saadud cg-2-allüülp-ga ( NNZ 291 ) ravitud loomadel. Sisenemiste arv on näidatud (vertikaalne telg) igaühe puhul ravirühmadest ja näidatud on sisenemine igale käigurajale (A1 A4). Joonisel FIG 21 ilmnes vehiikliga ravitud loomadel avastamiskäitumine, kusjuures fmr1 väljalülitusega loomadel ilmneb suurem sisenemiste arv kui metsiktüüpi loomadel. Vehiikliga ravitud metsiktüüpi loomad sisenesid harudesse A1 (WT-A1) ja A2 (WT-A2) umbes 3 4 korda testperioodi ajal ning ei sisenenud harudesse A3 (WT-A3) või A4 (WT-A4) oluliselt. Seevastu vehiikliga ravitud fmr1 väljalülitusega hiirtel olid oluliselt lühem latentsusaeg sisenemiseks esimesele avatud käigurajale (p < 0,001) ja kulutasid oluliselt enam aega avatud käiguradadel (p < 0,001). Need loomad sisenesid testperioodi ajal harudesse A1 (KO-A1) ja A2 (KO-A2) umbes korda. Aeg, millal fmr1 väljalülitusega loomad sisenesid harudesse A1 ja A2 enam kui kaks korda enam kui metsiktüüpi loomad, mis näitab hüperaktiivsuse oluliselt kõrgemat taset kui vehiikliga ravitud metsiktüüpi loomadel. Vehiikliga ravitud fmr1 väljalülitusega loomad sooritasid ka enam ületusi käiguradade vahel harudesse A3 (KO-A3) ja A4 (KO-A4) (p < 0,0001). Järeldame nendest tulemustest, et fmr1 väljalülitusega hiirtel ilmneb suurem ärevus kui metsiktüüpi loomadel Joonis FIG 22 näitab järjestikuste käiguradade testi tulemusi cg-2-allüülp-ga ( NNZ 291 ) ravitud loomadel. cg-2-allüülp-ga ravitud metsiktüüpi loomad sisenesid harusse A1 (WT-A1) umbes 2 korda testperioodi ajal ning sisenesid harusse A2 (WT- A2) umbes 4 korda testperioodi ajal. Need tulemused on võrreldavad tulemustega, mis on saadud vehiikliga ravitud metsiktüüpi loomade puhul, kes on näidatud joonisel FIG 21. Seevastu cg-2-allüülp-ga ravitud fmr1 väljalülitusega loomadel, keda raviti cg-2- allüülp-ga, ilmnes avatud harusse sisenemiste (p < 0,001) ning keskmes kulutatud aja (p < 0,00) oluline vähenemine, mis näitab hüperaktiivsuse vähenemist võrreldes

79 78 EE - EP B1 vehiikliga ravitud fmr1 väljalülitusega loomadega. cg-2-allüülp toime suurusjärk oli oluline, cg-2-allüülp-ga ravitud fmr1 väljalülitusega loomad sisenesid harusse A1 (KO- A1) umbes 4 korda võrreldes 8 korraga vehiikliga ravitud fmr1 väljalülitusega loomade puhul, kes on näidatud joonisel FIG 21. Sarnaselt sisenesid cg-2-allüülp-ga ravitud fmr1 väljalülitusega loomad harusse A2 (KO-A2) umbes 4 korda võrreldes korraga vehiikliga ravitud fmr1 väljalülitusega loomade puhul, kes on näidatud joonisel FIG 21. cg-2-allüülp-ga ravitud fmr1 väljalülitusega loomad sisenesid harusse A3 (KO-A3) umbes 4 korda võrreldes 9 korraga vehiikliga ravitud fmr1 väljalülitusega loomade puhul, kes on näidatud joonisel FIG 21. Lõpuks sisenesid cg-2-allüülp-ga ravitud fmr1 väljalülitusega loomad harusse A4 (KO-A4) umbes 3 korda võrreldes 4 korraga vehiikliga ravitud fmr1 väljalülitusega loomade puhul, kes on näidatud joonisel FIG 21. Järeldused 1 Järeldame sellest uuringust, et cg-2-allüülp vähendab ärevust fmr1 väljalülitusega hiirtel nendes tingimustes. Kuna selles uuringus kasutatud fmr1 väljalülitusega hiirtel on sama geneetiline mutatsioon mis inimestel, kellel on fragiilse X-i sündroom, järeldame, et cg-2-allüülp võib olla efektiivne inimeste ravimisel, kellel on fragiilse X-i sündroom. Kõrgendatud pluss-labürint 2 30 Teises uuringus kasutasime kõrgendatud pluss-labürinti. Kõrgendatud plusslabürindi test on üks enimkasutatavatest testidest ärevusesarnase hüperaktiivsuse mõõtmiseks hiirtel. Test põhineb hiirte loomulikul vastumeelsusel avatud ja kõrgenenud piirkondade suhtes ning nende loomulikul spontaansel avastamiskäitumisel uudsetes keskkondades. Joonis FIG 23 kujutab fotot selles uuringus kasutatud seadmest. Seade koosneb kahest avatud harust ja kahest suletud harust, mis on ristatud keskel üksteise suhtes täisnurkselt, ning keskme piirkonnast. Avatud harud on enam eksponeeritud ja tekitavad seega hiirtel enam ärevust. Hiired kulutavad seega enam aega suletud harudes ja külastavad neid sagedamini. Hiirtele anti juurdepääs kõikidele harudele ja neil võimaldati nende vahel vabalt liikuda. Avatud harudesse sisenemiste arvu, aega, mis kulub avatud harudes, ning aega, mis kulub keskmes, kasutati avatud ruumi indutseeritud ärevuse näidikutena: Aeg, mis kulub suletud harus

80 79 EE - EP B1 Joonis FIG 24 näitab tulemusi uuringutest, milles kasutatakse kõrgendatud plusslabürinti, aja hulga kohta, mis kulub seadme suletud harus (vertikaalne telg) igaühe puhul testitud loomade neljast rühmast. 1 Nagu näidatud joonisel FIG 24, kulutasid vehiikliga ravitud metsiktüüpi hiired (vasak tulp) umbes 240 sekundit suletud harus. cg-2-allüülp-ga ( NNZ 291 ) ravitud metsiktüüpi hiired (kolmas tulp vasakult) kulutasid umbes sama aja hulga suletud harus. Seevastu kulutasid vehiikliga ravitud fmr1 väljalülitusega loomad (teine tulp vasakult) oluliselt vähem aega suletud harus (umbes 160 sekundit; p < 0,001), näidates hüperaktiivsuse olekut fmr1 väljalülitusega loomadel. cg-2-allüülp normaliseeris suletud harus kulutatud aja fmr1 väljalülitusega loomadel (parem tulp). See hüperaktiivsus oli oluliselt vähenenud cg-2-allüülp-ga ravitud fmr1 väljalülitusega loomadel võrreldes vehiikliga ravitud metsiktüüpi ja cg-2-allüülp-ga ravitud metsiktüüpi loomadega. Statistiliselt olulist erinevust täheldati vehiikliga ravitud fmr1 väljalülitusega rühm ja cg-2-allüülp-ga ravitud fmr1 väljalülitusega rühm vahel (p < 0,001). Järeldame sellest uuringust, et cg-2-allüülp vähendas fmr1 väljalülitusega hiirte hüperaktiivsust nendes tingimustes. Kuna selles uuringus kasutatud fmr1 väljalülitusega hiirtel on sama geneetiline mutatsioon mis inimestel, kellel on fragiilse X-i sündroom, järeldame, et cg-2-allüülp võib olla efektiivne inimeste ravimisel, kellel on fragiilse X-i sündroom. Kõrgendatud pluss-labürindi aeg, mis kulub avatud harus Joonis FIG 2 kujutab graafikuid selle uuringu tulemustest, milles avatud harus (vertikaalne telg) kulutatud aeg on näidatud igaühe puhul 4 testitud loomade rühmast Vehiikliga ravitud fmr1 väljalülitusega loomad (teine tulp vasakult) kulutasid oluliselt pikemat aega avatud harudes (p < 0,001) võrreldes nende vehiikliga ravitud metsiktüüpi pesakonnakaaslastega (vasak tulp). Seevastu cg-2-allüülp ( NNZ 291 ) normaliseeris aja kulu avatud harudes fmr1 väljalülitusega loomadel. Aeg, mis kulub avatud harus cg-2-allüülp-ga ravitud fmr1 väljalülitusega loomadel hiirtel, ei erinenud oluliselt vehiikliga ravitud metsiktüüpi hiirte (vasak tulp) või cg-2-allüülp-ga ravitud metsiktüüpi loomade (kolmas tulp vasakult) puhul täheldatust.

81 80 EE - EP B1 Järeldame sellest uuringust, järgmist: (1) fmr1 väljalülitusega loomadel ilmnes enam hüperaktiivsuse käitumist kui metsiktüüpi loomadel ning (2) cg-2-allüülp normaliseeris hüperaktiivsuse. Kuna selles uuringus kasutatud fmr1 väljalülitusega hiirtel on sama geneetiline mutatsioon mis inimestel, kellel on fragiilse X-i sündroom, järeldame, et cg- 2-allüülP võib olla efektiivne inimeste ravimisel, kellel on fragiilse X-i sündroom. Kõrgendatud pluss-labürindi aeg keskmes Joonis FIG 26 kujutab graafikuid ajast, mis on kulunud seadme keskmes (vertikaalne telg), igaühe puhul 4 testitud loomade rühmast. Aeg, mis kulub kõrgendatud plusslabürindi keskmes, on tehnika tasemes tunnustatud hüperaktiivsuse mõõdikuna Vehiikliga ravitud metsiktüüpi hiired (vasak tulp) kulutasid umbes 30 sekundit labürindi keskmes. cg-2-allüülp-ga ( NNZ 291 ) ravitud metsiktüüpi hiired (kolmas tulp vasakult) kulutasid veidi vähem aega keskmes kui vehiikliga ravitud metsiktüüpi loomad. Seevastu kulutasid vehiikliga ravitud fmr1 väljalülitusega hiired oluliselt enam aega keskmes (teine tulp vasakult; p < 0,001) võrreldes vehiikliga ravitud metsiktüüpi loomadega. Leidsime ootamatult, et cg-2-allüülp-ga ravitud fmr1 väljalülitusega hiired (parem tulp) kulutasid oluliselt vähem aega kui vehiikliga ravitud fmr1 väljalülitusega loomad (teine tulp vasakult). Täheldasime statistiliselt olulisi erinevusi ajas, mis kulub keskmes vehiikliga ravitud fmr1 väljalülitusega loomadel (teine tulp vasakult) võrreldes vehiikliga ravitud metsiktüüpi loomade (vasak tulp; p < 0,001), cg-2-allüülp-ga ravitud metsiktüüpi loomade (kolmas tulp vasakult; p < 0,001) või cg-2-allüülp-ga ravitud fmr1 väljalülitusega loomadega (parem tulp; p < 0,001). Tegelikult ei täheldanud me statistiliselt olulisi erinevusi aja vahel, mis kulub keskmes kas vehiikliga ravitud metsiktüüpi rühmal (vasak tulp), cg-2-allüülp-ga ravitud metsiktüüpi rühmal (kolmas tulp vasakult) või cg-2-allüülp-ga ravitud fmr1 väljalülitusega rühmal (parem tulp). Järeldame sellest uuringust, et cg-2-allüülp vähendas fmr1 väljalülitusega hiirte hüperaktiivsust nendes tingimustes. Kuna selles uuringus kasutatud fmr1 väljalülitusega hiirtel on sama geneetiline mutatsioon mis inimestel, kellel on fragiilse X-i sündroom, järeldame, et cg-2-allüülp võib olla efektiivne inimeste ravimisel, kellel on fragiilse X-i sündroom. Näide 1. cg-2-allüülp toimed hirmu konditsioneerimisele loomadel, kellel on fragiilse X-i sündroom

82 81 EE - EP B1 1 Hirmu konditsioneerimine kas ravile või kontekstile esindab assotsiatiivse õppimise vormi, mida on kasutatud hästi paljude liikide puhul. Sõltuv mõõdik, mida kasutatakse kontekstuaalses (viivituse) hirmu konditsioneerimises, on tardumisvastus, mis esineb pärast tingimatu stiimuli (jalalöök) sidumist tingitud stiimuli (conditioned stimulus, CS), konkreetse konteksti ja/või sellise märguandega. Kui konditsioneerimise kontekstis antakse jalalöök, mis on seotud tooniga, on õppimine mitte ainult tooni, vaid ka konteksti suhtes. Kontekstuaalne hirmu konditsioneerimine on põhiline konditsioneerimisprotseduur. See hõlmab looma võtmist ja paigutamist uudsesse keskkonda, aversiivse stiimuli esitamist ning seejärel selle eemaldamist. Kui loom viiakse tagasi samasse keskkonda, ilmneb tal üldjuhul tardumisvastus, kui ta mäletab ja seostab seda keskkonda aversiivse stiimuliga. Tardumise on vastus hirmule, mis on määratletud kui liikumise, välja arvatud hingamise, puudumine. See tardumiskäitumine võib kesta sekunditest minutiteni sõltuvalt aversiivse stiimuli tugevusest, ilmnemiste arvust ning indiviidi saavutatud õppimise astmest. Meetodid Loomad Kasutasime selle uuringu jaoks kas metsiktüüpi või fmr1 väljalülitusega loomi, nagu kirjeldatud eespool. Loomad jagati rühmadeks järgmiselt. Vehiikliga ravitud metsiktüüpi; Vehiikliga ravitud fmr1 väljalülitusega; cg-2-allüülp-ga ravitud metsiktüüpi ja cg-2-allüülp-ga ravitud fmr1 väljalülitusega. Seade kontekstuaalse hirmu konditsioneerimise hindamiseks 2 Selles uuringus kasutatud seade on kujutatud joonisel FIG 27. Rakendati tingimatut stiimulit (kerge löök jalgadele) ning tingitud stiimul oli toon, mida rakendati koos löögiga jalgadele. Nendes tingimustes assotsieerivad loomad tingimatu stiimuli mõlemad tingitud stiimuli ja stimuli kontekstiga. Loomi testiti viis () minutit. Tulemused

83 82 EE - EP B Joonis FIG 28 kujutab graafikut ajast, mis on kulunud tardumise käitumise käigus igaühe puhul testitud loomade rühmadest. Selle uuringu ägeda stressi tingimustes kulutasid vehiikliga ravitud metsiktüüpi loomad (vasak tulp) keskmiselt umbes 30% viieminutilisest testperioodist (see tähendab, umbes 0 sekundit). Seevastu kulutasid vehiikliga ravitud fmr1 väljalülitusega loomad (teine tulp vasakult) oluliselt vähem aega tardumiskäitumise käigus (umbes 18% viieminutilisest testperioodist või umbes 4 sekundit). Järeldame, et fmr1 väljalülitusega loomadel ilmneb vähem hirmu kui vehiikliga ravitud metsiktüüpi loomadel. Leidsime ootamatult, et cg-2-allüülp ( NNZ 291 ) tekitas olulise ja statistiliselt olulise suurenemise ajas, mis kulub tardumiskäitumise käigus fmr1 väljalülitusega loomadel (parem tulp). Tegelikult oli aeg, mis kulub tardumiskäitumise peale, mida täheldati cg- 2-allüülP-ga ravitud fmr1 väljalülitusega loomadel, sarnane ajaga, mis kulub vehiikliga ravitud metsiktüüpi loomadel (vasak tulp) ja cg-2-allüülp-ga ravitud metsiktüüpi loomadel (kolmas tulp vasakult). Järeldused Järeldame sellest uuringust, et fmr1 väljalülitusega loomadel ilmneb madalam hirmu konditsioneerimine kui metsiktüüpi loomadel. See näitab, et fmr1 väljalülitusega loomadel võib olla elumuse halvemus võrreldes metsiktüüpi loomadega. Järeldame samuti, et cg-2-allüülp suurendas hirmu konditsioneerimist fmr1 väljalülitusega hiirtel nendes tingimustes. See toime võib leevendada elumuse halvemust, mida täheldatakse vehiiklisravitud fmr1 väljalülitusega loomadel. Kuna selles uuringus kasutatud fmr1 väljalülitusega hiirtel on sama geneetiline mutatsioon mis inimestel, kellel on fragiilse X-i sündroom, järeldame, et cg-2-allüülp võib olla efektiivne inimeste ravimisel, kellel on fragiilse X-i sündroom. Näide 16. cg-2-allüülp toimed on marmorkuulide matmisele ja pesitsemiskäitumisele loomadel, kellel on fragiilse X-i sündroom Hiired on sotsiaalne liik, kellel esinevad hõlpsalt skooriga hinnatavad sotsiaalsed käitumised, sealhulgas lähenemine, järgnemine, nuuskimine, teise puhastamine, aggressiivsed kokkupuuted, seksuaalsed interaktsioonid ning vanemakäitumised, pesitsemine ja magamine rühmas kuhjas, sotsiaalset äratundmist ja sotsiaalset mälu hiirtel hinnatakse aja hulga alusel, mis kulub uudse hiire nuuskimisele korduvatel

84 83 EE - EP B1 ekspositsioonidel, lähedase tutvuse indutseerimiseks, ning nuuskimise kõrgete tasemete taastumiseks, kui tuuakse uudne stiimulloom. Marmorkuulide matmine Hiired kaevavad laboris spontaanselt ükskõik millistesse substraatidesse. See käitumine tuleneb nende põlvnemisest vabas looduses, kus neil on võimalik otsida seemneid, teravilja, putukaid ning muud toitu, mis leidub maetuna pinnasesse või lehekõdusse nende looduslikus elupaigas. See kasutab ära levinud looduslikku näriliste käitumist, esitab kvantitatiivsed andmed reguleeritud laboritingimustes ning on osutunud äärmiselt tundlikuks prioonhaiguse, fragiilse X-i sündroomi ning aju kahjustuste suhtes. Igapäevase tegevuse (activities of daily living, ADL) teostamise võime halvenemine on Alzheimeri tõve (Alzheimer's disease, AD) ning kognitiivse allakäigu varane näht (Deacon, 12). Marmorkuulide matmiskäitumisele avalduvate cg-2-allüülp toimete uurimiseks teostasime rida uuringuid metsiktüüpi hiirte ja fmr1 väljalülitusega hiirte kohta. 1 Meetodid Loomad Kasutasime selle uuringu jaoks kas metsiktüüpi või fmr1 väljalülitusega loomi, nagu kirjeldatud eespool. Loomad jagati rühmadeks järgmiselt. Vehiikliga ravitud metsiktüüpi; Vehiikliga ravitud fmr1 väljalülitusega; cg-2-allüülp-ga ravitud metsiktüüpi ja cg-2-allüülp-ga ravitud fmr1 väljalülitusega. 2 Hiired paigutati puitlaastudest voodiga suletud keskkonda. Kümme () marmorkuuli sisestati keskkonda ning maetud marmorkuulide arv määrati visuaalse jälgimise teel (mediaan + kvartiilhaare (interquartile range, IQR)). Tulemused 30 Täheldasime, et vehiikliga ravitud metsiktüüpi hiired ja cg-2-allüülp-ga ravitud metsiktüüpi hiired matsid marmorkuuli -st esitatust (0%). Seevastu fmr1 väljalülitusega loomad matsid oluliselt vähem marmorkuule (keskmiselt 3 -st või 30%; (p < 0,001) kui vehiikliga ravitud metsiktüüpi loomad.

85 84 EE - EP B1 Leidsime ootamatult, et cg-2-allüülp-ga ( NNZ 291 ) ravitud fmr1 väljalülitusega loomad matsid mediaanselt 8 marmorkuuli -st (80%). Tegelikult normaalseiseeris cg-2-allüülp maetud marmorkuulide arvu tasemeteni, mis olid väga sarnased vehiikliga ravitud metsiktüüpi hiirte või cg-2-allüülp-ga ravitud metsiktüüpi hiirte puhul leitutega. Järeldused Järeldame sellest uuringust, et fmr1 väljalülitusega hiired matavad vähem marmorkuule kui metsiktüüpi loomad ning et cg-2-allüülp päästis selle vähenemise ning tegelikult normaliseeris käitumise. Kuna selles uuringus kasutatud fmr1 väljalülitusega hiirtel on sama geneetiline mutatsioon mis inimestel, kellel on fragiilse X-i sündroom, järeldame, et cg-2-allüülp võib olla efektiivne inimeste ravimisel, kellel on fragiilse X-i sündroom. Pesitsemiskäitumine 1 Isased ja emase hiired teevad pesasid ja sooritavad selle testi võrdselt, kuna otstarbed hõlmavad termoregulatsiooni ning assotsieerumist paljunemisega. Seda testi kasutatakse ka hipokampuse kahjustuse ja düsfunktsiooni näidikuna. Meetodid Loomad Kasutasime selle uuringu jaoks kas metsiktüüpi või fmr1 väljalülitusega loomi, nagu kirjeldatud eespool. Loomad jagati rühmadeks järgmiselt. Vehiikliga ravitud metsiktüüpi; Vehiikliga ravitud fmr1 väljalülitusega; cg-2-allüülp-ga ravitud metsiktüüpi ja cg-2-allüülp-ga ravitud fmr1 väljalülitusega Pesitsemiskäitumise test Hiired kasutavad tavaliselt teatud materjale, millega teha pesa. Selles uuringus sisestasime pesitsemispuuridesse puuvillast pesamaterjale. Hiired võivad seejärel pesamaterjali puuvilla puruks rebida ja kasutada seda pesa tegemiseks pesitsemispuuride sängmaterjali. Pesitsemine on hiirtel tüüpiline käitumine ning esindab tavalise igapäevaelu eripära. See test peegeldab seega igapäevaelu

86 8 EE - EP B1 ülesandeid, mida inimesed täidavad. Pesitsemiskäitumise muutused fmr1 väljalülitusega hiirtel prognoosivad seega inimeste käitumist, kellel on fragiilse X-i sündroom. Lisaks prognoosivad ravimite toimed fmr1 väljalülitusega hiirtele mõistlikult ravimite toimeid inimestele, kellel on fragiilse X-i sündroom. Hiired paigutati individuaalselt pesitsemispuuridesse umbes üks tund enne valguse ja pimeduse tsükli pimedat faasi ning tulemusi hinnati järgmine hommik. Pesamaterjalide ilmet hinnati punkti skaalal, nagu kirjeldatud allpool, ning samuti kaaluti rebimata pesamaterjali kogust. 1. Pesamaterjal oli suuresti puutumata (>90% intaktne). Joonis FIG A kujutab fotot pesamaterjalist, millel on skoor Pesamaterjal oli osaliselt puruks rebitud (0 90% jäi intaktseks). Joonis FIG B kujutab fotot pesamaterjalist, millel on skoor Pesamaterjal oli enamjaolt ribastatud, kuid tihti ei ole tuvastatavat pesakohta: <0% pesamaterjalist on endiselt intaktne, kuid <90% veerandil puuri põrandapindalast, see tähendab, puuvill ei olnud kogutud pesasse, vaid puuris laotatud. Materjal võib olla mõnikord laialt määratletud pesapiirkonnas, kuid kriitiline määratlus on see, et 0 90% on ribastatud. Joonis FIG 29C kujutab fotot pesamaterjalist, millel on skoor Tuvastatav, kuid lame pesa: >90% pesamaterjalist oli puruks rebitud, materjal oli kogutud pesasse ühele neljandikule põrandapindalast, kuid pesa on lame, kusjuures seinad on kõrgemad kui hiire keha kõrgus (külili kerra tõmbunud) vähem kui 0%-l piirjoonest. Joonis FIG 29D kujutab fotot pesamaterjalist, millel on skoor 4, hiire on pesamaterjali peal.. Peaaegu täiuslik pesa: >90% pesamaterjalist oli puruks rebitud, pesa on kraater, kusjuures seinad on kõrgemad kui hiire keha kõrgus vähem kui 0%-l piirjoonest. Joonis FIG 29E kujutab fotot pesamaterjalist, millel on skoor, hiire on pesamaterjali peal. Tulemused ja kokkuvõtted 30 Leidsime, et vehiikliga ravitud metsiktüüpi C7BL/6 hiired said pesa ehitamise eest skooriks umbes 4. Seevastu vehiikliga ravitud fmr1 väljalülitusega hiirtel oli mediaanskoor umbes 1 2.

87 86 EE - EP B1 Leidsime ootamatult, et cg-2-allüülp ( NNZ 291 ) ravi suurendas pesitsemisskoori tasemeni 4 fmr1 väljalülitusega hiirtel. Järeldame, et fmr1 väljalülitusega hiired demonstreerivad defitsiiti pesa ehitamisel ning et cg-2-allüülp pöörase selle defitsiidi vähemalt osaliselt ümber. Kuna selles uuringus kasutatud fmr1 väljalülitusega hiirtel on sama geneetiline mutatsioon mis inimestel, kellel on fragiilse X-i sündroom, järeldame, et cg-2-allüülp võib olla efektiivne inimeste ravimisel, kellel on fragiilse X-i sündroom. Näide 17. Seltsivus: Sotsiaalne äratundmine, sotsiaalse uudsuse eelistus Hiired on sotsiaalne liik, kellel esinevad hõlpsalt skooriga hinnatavad sotsiaalsed käitumised, sealhulgas lähenemine, järgnemine, nuuskimine, teise puhastamine, aggressiivsed kokkupuuted, seksuaalsed interaktsioonid ning vanemakäitumised, pesitsemine ja magamine rühmas kuhjas. Seltsivuse uurimiseks teostasime rea uuringuid metsiktüüpi hiirte ning hiirtega, kellel on fmr1 väljalülitusega mutatsioon. Meetodid 1 Loomad Kasutasime selle uuringu jaoks kas metsiktüüpi või fmr1 väljalülitusega loomi, nagu kirjeldatud eespool. Loomad jagati rühmadeks järgmiselt. Vehiikliga ravitud metsiktüüpi; Vehiikliga ravitud fmr1 väljalülitusega; cg-2-allüülp-ga ravitud metsiktüüpi ja cg-2-allüülp-ga ravitud fmr1 väljalülitusega. Katseprotseduurid 2 Sotsiaalset äratundmist ja sotsiaalset mälu hiirtel hinnati aja hulga alusel, mis kulub uudse hiire nuuskimisele korduvatel ekspositsioonidel, lähedase tutvuse indutseerimiseks, ning nuuskimise kõrgete tasemete taastumiseks, kui tuuakse uudne stiimulloom. Mõõtsime nuuskimise hoogude arvu igaühes loomade rühmadest. Tulemused ja kokkuvõtted 30 Joonis FIG 30 kujutab graafikut nuuskimise hoogude kestusest (vertikaalne telg) erinevate uuritud hiirte rühmade puhul. Leidsime, et vehiikliga ravitud metsiktüüpi loomadel (vasak tulp) ilmnesid testperioodi ajal nuuskimise hooge umbes 23. Seevastu

88 87 EE - EP B1 fmr1 väljalülitusega loomadel (teine tulp vasakult) ilmnes vähem nuuskimiskäitumist (umbes 6). 1 Üllataval moel leidsime siiski, et cg-2-allüülp-ga ( NNZ 291 ) ravitud fmr1 väljalülitusega loomadel (parem tulp), suurenes nuuskimiskäitumise kogus oluliselt tasemeni umbes 21 (p < 0,001). Tegelikult suurendas cg-2-allüülp nuuskimiskäitumist fmr1 väljalülitusega loomadel umbes samade tasemeteni mis vehiiklisravitud metsiktüüpi (vasak tulp) või cg-2-allüülp-ga ravitud loomadel (kolmas tulp vasakult). Järeldame, et fmr1 väljalülitusega loomadel ilmneb seltsivuse defitsiit võrreldes metsiktüüpi loomadega. Selle tulemused on kooskõlas hästi tuntud seltsivuse defitsiitidega, mida täheldatakse inimestel, kellel on fragiilse X-i sündroom. Järeldame samuti, et cg-2-allüülp suurendab seltsivust, mida täheldatakse fmr1 väljalülitusega hiirte puhul, ning normaliseeris käitumise. Kuna selles uuringus kasutatud fmr1 väljalülitusega hiirtel on sama geneetiline mutatsioon mis inimestel, kellel on fragiilse X-i sündroom, järeldame, et cg-2-allüülp võib olla efektiivne sotsiaalsete interaktsioonide parandamisel inimestel, kellel on fragiilse X-i sündroom. Näide 18: cg-2-allüülp normaliseerib perk-i ja pakt-i üleekspressiooni loomadel, kellel on fragiilse X-i sündroom 2 30 Neuroneid mõjutavad kriitiliselt fragiilse X-i vaimse arengu peetuse valk, mis reguleerib kohalikku dendriitset translatsiooni läbi rapamütsiini (mammalian target of rapamycin, mtor) fosfatidüülinositooli 3-kinaas-Akt-imetaja sihtmärgi ja Ras-ERK-i signaalimise kaskaadide ja on kaasatud mglur signaalimise kaskaadi. Rakusisese signaalimise molekulide ERK ja Akt, üleaktivatsioon, mängivad üliolulist rolli sünaptilises plastilisuses. Nende valkude ekspressiooni tasemed on fragiilse X-i sündroomi rakupatoloogia tunnus ja arvatavasti soodustavad nad otse FXS-i neurokäitumuslikku fenotüüpi. ERK on klassikaline MAPK signaalitransduktsiooni valk, millest sõltuvad kasvufaktori transduktsioon, proliferatsioon, tsütokiinide vastus stressile ja apoptoos. Akt on põhikomponent PI3K/Akt/mTOR-signaalimisrajas ja reguleerib rakkude elumust ja metabolism, sidudes ja reguleerides mükskõik milliseid allavoolu efektoreid, nagu tuumafaktorit κb (Nuclear Factor-κB, NfκB) ja Bcl-2-perekonna valke. Nende valkude ülemäärane aktivatsioon (fosforüülumine) on segatud autismispektri häiretesse. Meetodid

89 88 EE - EP B1 Loomad Kasutasime selle uuringu jaoks kas metsiktüüpi või fmr1 väljalülitusega loomi, nagu kirjeldatud eespool. Loomad jagati rühmadeks (n = 4 looma rühma kohta) järgmiselt. Vehiikliga ravitud metsiktüüpi; Vehiikliga ravitud fmr1 väljalülitusega; cg-2-allüülp-ga ravitud metsiktüüpi ja cg-2-allüülp-ga ravitud fmr1 väljalülitusega. Biokeemilised testid Täielike ajulüsaatide ERK1/2 ja Akt-i fosforüülumise tasemeid hinnati, kasutades Western blot-analüüse. Hiired surmati ja ajud eemaldatud 12 päeva pärast viimast süstimist ning kohe pärast viimast käitumistesti. Muudes uuringutes mõõdeti perk-i ja pakt-i vere lümfotsüütides. Western blot-analüüsi tulemused normaliseeriti GAPDHvalgu kogusele, mis ilmnes iga blot-analüüsi puhul. Tulemused, fosforüülitud ERK 1 Joonis FIG 31 kujutab graafikuid hiirtelt pärinevate ajude uuringu tulemustest. Vehiikliga ravitud metsiktüüpi hiirtel oli keskmiselt umbes 0,9 (UA ühikud) (vasak tulp). Seevastu fmr1 väljalülitusega loomadel (teine tulp vasakult) oli fosforüülimise ERK-i suurenenud tase kuni umbes 1,3 (UA ühikud) (p < 0,0). Fmr1 väljalülitusega loomade ravi c-2-allüülp-ga ( NNZ 291 ) (kolmas tulp vasakult) vähendas ERK-i fosforüülumist oluliselt (p < 0,0) võrreldes vehiikliga ravitud fmr1 väljalülitusega loomadega. perk-i tasemed, mida täheldati pärast fmr1 väljalülitusega loomade ravi cg-2-allüülp-ga olid väga sarnased vehiikliga ravitud metsiktüüpi loomade (vasak tulp) või cg-2-allüülp-ga ravitud metsiktüüpi loomade (kolmas tulp vasakult) omadega. Sarnased tulemused leiti perk-i puhul loomade rühmadest isoleeritud lümfotsüütides Fosforüülitud AKT Täheldasime sarnast mustrit fosforüülitud AKT-is, nagu tegime ERK puhul loomade ajudes. Joonis FIG 32 kujutab graafikuid selle uuringu tulemustest. Vehiikliga ravitud metsiktüüpi hiirtel oli keskmiselt umbes 0,9 (UA ühikud) (vasak tulp). Seevastu fmr1 väljalülitusega loomadel (teine tulp vasakult) oli fosforüülimise AKT-i suurenenud tase kuni umbes 1,3 (UA ühikud) (p < 0,0). fmr1 väljalülitusega loomade ravi c-2-allüülp-

90 89 EE - EP B1 ga ( NNZ 291 ) (kolmas tulp vasakult) vähendas ERK-i fosforüülumist oluliselt tasemeni 0,9 (UA ühikud (p < 0,0) võrreldes vehiikliga ravitud fmr1 väljalülitusega loomadega. pakt-i tasemed, mida täheldati pärast fmr1 väljalülitusega loomade ravi cg-2-allüülp-ga olid väga sarnased vehiikliga ravitud metsiktüüpi loomade (vasak tulp) või cg-2-allüülp-ga ravitud metsiktüüpi loomade (kolmas tulp vasakult) omadega. Sarnased tulemused leiti pakt-i puhul loomade rühmadest isoleeritud lümfotsüütides. Näide 19. Retti sündroomi ravi: cg-2-allüülp toimed elueale ja pikaajalisele võimendusele Retti sündroom (RTT) mudelis 1 Selle määramiseks, kas cg-2-allüülp-ravi võib mõjutada Retti sündroomi arengut ja progressiooni häire hiirmudelis, kasutame hemisügootseid isaseid MeCP2(1lox)-hiiri. MeCP2 väljalülitusega (MeCP2-KO) hiire süsteem on tehnika tasemes üldtunnustatud füsioloogiliste ja neuroloogiliste häirete ulatust ning raskusastet matkivana, mis iseloomustavad inimese häiret, Retti sündroomi. Kõik katsed teostatakse University of Texas Southwestern Medical Centeris ning need kiitis heaks University of Texas Southwestern Medical Centeri loomade hooldamise ja kasutamise komisjon või sarnaste heakskiitudega teiste organisatsioonide poolt. cg- 2-allüülP-d sünteesis Albany Molecular Research Inc. (Albany, NY) ja tarnis Neuren Pharmaceuticals Limited. Meetodid 2 Ravi Ravime hemisügootseid isaseid MeCP2(llox)-hiiri mg/kg päevas cg-2-allüülp või soolalahusega, (0,01% BSA, n = 1 rühma kohta elumuseksperimendis ja n = LTPkatses). Raviviise rakendatakse intraperitoneaalselt alates 4 nädalast pärast sündi. Elumuskatsete puhul säilitatakse ravi eksperimendi kogu kulu ulatuses. LTPeksperimendi puhul ravitakse hiiri 9. nädalani, kui neid kasutatakse lõikude valmistamiseks. Elumus 30 MeCP2-puudulikkusega mutantsetel hiirtel tekivad RTT sümptomid umbes elunädalal ja nad surevad. 12. elunädalal (Chen et al., 01. Nat Genet 27: ). Võrdleme metsiktüüpi kontroll-loomade ja MeCP2-puudulikkusega loomade elumust vehiikli ning cg-2-allüülp-ga ravitud rühmades. Elumust mõõdetaks iga nädal

91 90 EE - EP B1 alates ravi algusest (4 nädalat) ja seda kasutati Kaplani-Meieri elumuskõverate koostamiseks, mis näitavad hiirte osakaalu, kes on jäänud ellu (y-telg) iga nädalase vahemiku tagant (x-telg). Pikaajaline võimendamine (elektrofüsioloogia) Varem on teatatud, et MeCP2-puudulikkusega hiirtel esineb funktsionaalne ja ultrastrukturaalne sünaptiline düsfunktsioon, hipokampusest sõltuva mälu ning hipokampuse pikaajalise võimendamise (LTP) oluline häire (Moretti et al. The Journal of Neuroscience (1): ). Selleks et testida cg-2-allüülp-ravi toimet sünaptilisele funktsioonile RTT mudelis, võrdleme hipokampuse LTP-d nii vehiikli kui ka cg-2-allüülp-ga ravitud loomi 9. elunädalal. Selleks mõõdame välja ekstsitatoorsete postsünaptiliste potentsiaalide (field excitatory postsynaptic potential, fepsp) tõusu protsendina (%) baasjoone potentsiaalist neuronites hipokampuse lõikudes MeCP2-puudulikkusega hiirtel, keda ravitakse kas soolalahuse või cg-2-allüülp. Tulemused Tulemused näitavad, et cg-2-allüülp-ravi suurendab MeCP2-puudulikkusega hiirte elumust. Metsiktüüpi hiired (ülemine joon) on kontroll-loomad ja seega oli nende elumus igal ajahetkel 0%. Ainult soolalahusega ravitud MeCP2-puudulikkusega hiired surevad palju kiiremini kui metsiktüüpi hiired, selliselt et umbes 11 nädala möödudes oli jäänud ellu ainult mõned MeCP-puudulikkusega hiirtest. Seevastu leiame siiski, et MeCP2-puudulikkusega hiired, keda on ravitud cg-2-allüülp-ga, jäävad ellu oluliselt kauem kui soolalahusega ravitud hiired. Ohutusprobleeme mecp2- hiirte ravimisel cg-2-allüülp-ga ei teki. Tulemused näitavad, et cg-2-allüülp võib suurendada oluliselt MeCP2- puudulikkusega hiirte elumust. Kuna MeCP2-puudulikkusega hiired võimaldavad prognoosida patoloogiat ja terapeutilist efektiivsust Retti sündroomiga inimestel, järeldame, et cg-2-allüülp võib suurendada eluiga Retti sündroomiga inimestel. Tulemused näitavad ka seda, et cg-2-allüülp-ravi suurendab hipokampuse pikaajalist võimendust (LTP), mida mõõdetakse fepsp-kõvera järgi MeCP2-puudulikkusega loomadel võrreldes soolalahusega ravitavatel mutantsetele hiirtel. Leiame, et cg-2- allüülp suurendab fesps-i tõusu MeCP2-puudulikkusega hiirtel võrreldes loomadega, keda ravitakse ainult soolalahusega.

92 91 EE - EP B1 Tulemused näitavad, et cg-2-allüülp võib olla efektiivne MeCP2-puudulikkusega hiirte ravimisel in vivo. Kuna MeCP2-puudulikkusega hiired võimaldavad prognoosida patoloogiat ja terapeutilist efektiivsust Retti sündroomiga inimestel, järeldame, et cg- 2-allüülP võib olla efektiivne teraapia Retti sündroomiga inimestele. Näide. cg-2-allüülp parandab dendriitide arborisatsiooni ning suurendab dendriitjätkete pikkust Hindame cg-2-allüülp-ravi toimet dendriitidele. Transgeensetele mecp2 väljalülitusega hiirtele (n = 1 ) manustatakse cg-2-allüülp-d intraperitoneaalselt annuses mg/kg kord päevas. Surmamise järel uuritakse dendriitjätkete tihedust, jätkete pikkust ja arborisatsiooni pärast Golgi värvimist üheksa nädala möödumisel vastavalt tabelile allpool. Tabel Valimite suurus kõikide neuronite morfoloogilise ja jätkete analüüsi puhul Analüüs VANUS (nädalad) ISASED, hiirte arv Neuronite või dendriitide arv looma kohta KO-vehiikel allüülp KO-vehiikel KO-cG-2- KO-cG-2- allüülp Morfoloogia Jätkete analüüs Dendriitide pikkust hinnatakse kauguse alusel esinduslike hipokampuse CA1- neuronite rakukehast 9 nädala vanustelt isastelt ilma mecp2-ta mutantsetelt hiirtelt, keda raviti kas soolalahusega (analüüsiti 3 neuronit 3 eraldi hiirelt, n = 9) või cg-2- allüülp-ga ( mg/kg i.p. 1/päev, nädalast 4; 3 neuroneid analüüsitakse 3 eraldi hiirelt, n = 9). Täheldame, et cg-2-allüülp parandab dendriitide arborisatsiooni ning suurendab dendriitjätkete pikkust. Graafik kujutab dendriitide pikkust (μm, vertikaaltelg) ja kaugust (μm, horisontaaltelg) rakkude kehast. Rakkude puhul, millel on dendriidid rakukeha lähedal, on dendriidid lühikesed. Siiski, kui kaugus rakukehadest suureneb, tekitab soolalahusega töötlemine dendriitide pikkusi, mis suurenevad maksimumini umbes 70

93 92 EE - EP B1 μm kaugusel rakukehast ja vähenevad suurematel kaugustel rakukehadest. Seevastu annab ravimine cg-2-allüülp-ga (täidetud ruudud) pikemad dendriidid palju suurema rakukeha kauguste vahemiku ulatuses. Näide 21. Retti sündroomi ravimine hiirtel II. Hiirte paaritamine ja genotüübi määramine Kasutatakse MeCP2 iduliini nullalleeli hiiri (Chen et al., 01). Genotüüp määratakse, nagu on kirjeldanud Chen et al. (Chen et al., 01). cg-2-allüülp-ga ravi 1 Elumuse mõõtmistulemuste, öise aktiivsuse analüüsi ja immuunlaigutusanalüüsi jaoks manustatakse cg-2-allüülp-d tarnijalt Neuren Pharmaceuticals Limited iga päev intraperitoneaalsete süstide kaudu ( mg/kg, vehiikel = soolalahus, 0,01% BSA). Ravi algab P1 juures ja see säilitatakse katsete kogu kulu ulatuses. Rakusisese füsioloogia katsete jaoks süstitakse hiirtele iga päev cg-2-allüülp-d ( mg kehamassi kilogrammi kohta, vehiikel = soolalahus, 0,01% BSA) 2 nädalat alates P1-st kuni P28- P32-ni, kui neid kasutatakse akuutsete lõikude valmistamiseks. Optiliste pildinduskatsete jaoks süstitakse hiirtele cg-2-allüülp-d ( mg kehamassi kilogrammi kohta, vehiikel = soolalahus, 0,01% BSA) iga päev alates lau õmblusest kuni pildinduse päevani. Lõikude füsioloogia ettevalmistus 2 30 Koronaalsed lõiked (paksusega 300 μm) lõigatakse sensomotoorsest korteksist või selle lähedalt <4 C kunstlikus aju-seljaajuvedelikus (artificial cerebral spinal fluid, ACSF) kasutades vibratoomi. Lõike inkubeeritakse temperatuuril 37 C minuti jooksul pärast lõikamist ja toatemperatuuril ülejäänud eksperimendi vältel. Lõigud kantakse üle Warneri kambrisse ja salvestised tehakse visuaalselt tuvastatud püramidaalsetes neuronites asukohaga. kihis. Kunstlik aju-seljaajuvedelik (ACSF), mis sisaldab 126 mm NaCl, 2 mm NaHCO3, 1 mm NaHPO4, 3 mm KCl, 2 mm MgSO4, 2 mm CaCl2 ja 14 mm dekstroosi, kohandatakse tasemeni 31 3 mosm ning 7,4 ph ja sellesse juhitakse 9% O2 / % CO2 mulle. Rakusisene pipetilahus sisaldab 0 mm kaaliumglükonaati, mm KCl-i, mm HEPES-i, 4 mm mgatp-d, 0,3 mm NaGTP-d ja mm Na-kreatiinfosfaati. Rakusisesed tervete rakkude salvestised

94 93 EE - EP B1 1 Boorsilikaatpipette (3 MΩ, WPI) tõmmatakse Sutter P-80 tõmmitsaga (Sutter Instruments). Rakud visualiseeritakse 40 vette sukeldatava objektiiviga Achroplan, millel on infrapuna-diferentsiaalinterferentskontrastoptika (Zeiss) ning tuvastatakse videomonitorile projitseeriva infrapuna-kaameraga (Hamamatsu). Katsetes kasutatakse eritellimusel valmistatud andmekogumise ja reaalajas analüüsi tarkvara, mis on kirjutatud Matlabis (Mathworks, Natick, Mass.) kasutades võimendit Multiclamp 700B (Axon Instruments), mis on ühendatud konnektorirplokiga BNC-21 ja M-seeria kaksikkanali andmekogumiskaardiga (National Instruments). Saavutatakse gigaoomilukk ja rebenemine ning tervete rakkude salvestisi kontrollitakse pidevalt lekke- ja jadatakistuse madala taseme suhtes. Iga salvestise puhul rakendatakse pingenäpitsas mv testimpulssi ligikaudu korda sisend- ja jadatakistuse mõõtmiseks. Seejärel rakendatakse voolunäpitsas ligikaudu impulssi (00 ms, pa sammuga pa) erutussignaalide edastamise kiiruse ja rakulise erutuvuse mõõtmiseks. Kontrollitakse juurdepääsukindluse, lekkimise ja rakkude sisemise erutuvuse rühmadevahelist ühesugusust. Lõpuks kettareeditakse spontaanideid EPSC-sid, mis on pingekinnituse all pingel 60 mv, sagedusel khz ning madalpääsfiltreeritakse sagedusel 1 khz. Analüüs teostatakse, kasutades eritellimusel valmistatud tarkvarapaketti, mis on kirjutatud Matlabis, kusjuures kõik sündmused tuvastatakse vastavalt automaadsetele künnistele ja eksperimendi läbiviija kontrollib neid pimemenetluse teel iga sündmuse puhul individuaalselt. Golgi värvimine 2 30 Proovid (<1 cm) P28-hiirtelt fikseeritakse % formaliinis ja 3% kaaliumdikromaadis 24 tundi jooksul. Seejärel viiakse kude üle 2% hõbenitraadile 2 päevaks pimedas toatemperatuuril. Seejärel lõigatakse nendest proovidest 0 μm paksuses lõikeid destilleeritud vette. Motoorsele korteksile vastavad lõiked kinnitatakse alusklaasidele, kuivatatakse õhu käes minuti jooksul ja dehüdreeritakse seejärel järjestikuste loputuste käigus 9% alkoholi, 0% alkoholi ning ksüleeniga ja kaetakse seejärel tihedalt katteklaasiga. Kujutised kogutakse suurendusel (terve rakk) ja 0 (jätkete pildindus) kasutades konfokaalset mikroskoopi Zeiss Pascal Exciter. Omasignaalide optiline pildindus Eksperimendiks kasutatakse täiskasvanud (>P60) metsiktüüpi (SVEV või BL6) ja MeCP2 (+/ ) mutantseid emasloomi (BL6). Metsiktüüpi kontrollrühm koosneb nii

95 94 EE - EP B MeCP2+/ -emasloomade metsiktüüpi pesakonnakaaslastest kui ka metsiktüüpi SVEV-emasloomadest. Monokulaarse deprivatsiooni puhul tuimastatakse loomad Avertiniga (0,016 ml/g) ja ühe silma laud õmmeldakse kokku 4 päevaks. Enne pildindust eemaldatakse õmblus ja deprivatsioonile allutatud silm avatakse uuesti. Pildindusseansi jaoks kasutatakse ainult loomi, kellel on deprivatsiooniõmblused terved ja deprivatsioonile allutatud silmal on terve ilme. cg-2-allüülp signalisatsiooni aktiveerimiseks süstitakse cg-2-allüülp-d sisaldavat lahust intraperitoneaalselt (IP) iga päev kogu deprivatsiooniperioodi jooksul. Pildindusseanssideks tuimastatakse hiired uretaaniga (1, g/kg; % täielikust annusest manustatakse intraperitoneaalselt iga 30 minuti tagant kuni lõpliku annuseni, samuti süstitakse koos esimese manustamisega 0,02 ml kloorprotikseeni 1%). Kolju on katmata ja liikumise vähendamiseks miinimumini kleebitakse pea peale eritellimusel valmistatud plaat. Kolju õhendati VI kraniaalnärvi kohal Dremeli puuriga ja kaeti agarooslahusega soolalahuses (1,%) ning klaasist katteklaasiga. Pildindusseansi käigus varustatakse looma pidevalt hapnikuga, tema temperatuuri säilitatakse soojendatava tekiga ning silmi ravitakse perioodiliselt silikoonõliga; füsioloogilisi tingimusi jälgitakse pidevalt. Tuimastatud hiir paigutatakse kuvari ette, millel kuvatakse kummalegi silmale esitletavat perioodilist stiimulit monokulaarselt; stiimul koosneb triivivast vertikaalsest või horisontaalsest valgest ribast mõõtmetega 9 72, mis triivib kiirusel 9 sekundit tsükli kohta ühtlaselt hallil taustal. Kolju pinda valgustatakse punase valgustiga (630 nm) ja heleduse muutus salvestatakse CCD-kaameraga (Cascade 12B, Roper Scientific) kiirusel 1 kaadrit sekundis iga 2 minuti pikkuse stiimuliseansi ajal. Ajalist kõrgpääsufiltrit (13 kaadrit) kasutatakse aeglase signaalimüra eemaldamiseks, seejärel töödeldakse signaali arvutis stiimuli sagedusele vastava kiire Fourier' teisenduse (Fast Fourier Transform, FFT) komponendi ekstraheerimiseks iga piksli puhul. FFT amplituudi kasutatakse visuaalse erutusreaktsiooni tugevuse mõõtmiseks igal silmal. Silma domineerimise indeks tuletatakse iga silma reaktsioonist (R) iga piksli puhul kui ODI = (Rcontra Ripsi)/(Rcontra + Ripsi). Binokulaarvööndit määratletakse piirkonnana, mille aktiveerib silma stimuleerimine, mis on ipsilateraalne kuvatava poolkera suhtes. Südamelöögisageduse mõõtmistulemused Reaalajas südamelöögisagedust mõõdetakse, kasutades sabaklambriandurit (Hiire OX Oximeter-Oakmont, PA). Hiiri ei tuimastata, vaid piiratakse füüsiliselt istuga

96 9 EE - EP B1 paigaldatud avatud plasttorus. Enne salvestusseanssi paigutatakse katsuti harjumise võimaldamiseks üle öö puuridesse, kus katseloomi peetakse. Kehatemperatuuri säilitatakse tasemel F kogu salvestusaja jooksul. Salvestame iga hiire puhul 3 katset pikkusega 1 minutit, hiired on 8 nädalat vanad ja neid ravitakse vehiikli või cg-2-allüülp-ga P1-st. Öise aktiivsuse mõõtmistulemused Spontaanset motoorset aktiivsust mõõdetakse, kasutades infrapuna-kiirega aktiveeritavat liikumise jälgimise kambrit (Opto-Varimax-MiniA; Columbus Instruments, Columbus, Ohio). Iga eksperimendi puhul paigutatakse hiir kambrisse vähemalt 3 h enne salvestuste algust. Liikumist jälgitakse normaalse 12 h pimeda tsükli ajal (kl ). Kogutakse üks pime tsükkel looma kohta ajahetke kohta. Tulemused 1 Selle testimiseks, kas cg-2-allüülp-ravi mõjutab RTT haiguse kardinaalsete tunnuste arengut, tehakse 2 nädala vanustele mutantsetele loomadele nende eluea jooksul iga päev intraperitoneaalseid süste. Sünaptilise füsioloogia, sünaptilise molekulaarse koosseisu ja kortikaalse plastilisuse mõõtmistulemused koguti seejärel nagu allpool on täpsemalt kirjeldatud, koos tervisega seotud mõõtmistulemustega nagu südamelöögisagedus, lokomotoorse aktiivsuse tase ning eluiga. cg-2-allüülp toime MeCP2-mutantsete hiirte sünaptilisele füsioloogiale 2 30 Viimastes uuringutes on teatatud, et neuronitel MeCP2 /y-hiirte mitmes ajupiirkonnas ilmneb spontaanse aktiivsuse järsk langus (Chang et al., 06; Chao et al., 07; Dani et al., 0; Nelson et al., 06), tegu on fenotüübiga, mis päästab BDNF-i üleekspressioon (Chang et al., 06). Sarnaselt on näidatud, et IGF1-derivaadi akuutne rakendamine tõstab ekstsitatoorset postsünaptilist erutusvoolu (EPSC) amplituude 40% roti hipokampuse kultuurides (Ramsey et al., 0; Xing et al., 07). cg-2-allüülp efektiivsuse testimiseks MeCP2 /y füsioloogilise fenotüübi päästmisel kogume rakusisesed terviklikud rakusalvestused akuutsetes ajulõikudes, mõõtes ekstsitatoorset sünaptilist ülekannet (spontaanne EPSC-i amplituud ja sagedus). kihi kortikaalsetes neuronites. Siin on /y-loomadelt salvestatud EPSC-del oluliselt vähenenud amplituud võrreldes metsiktüüpi loomadel mõõdetud EPSC-dega. Suundumus taandub osaliselt EPSC-des, mis on salvestatud cg-2-allüülp-ga ravitavatel MeCP2 /y-loomadelt ja mis on amplituudi poolest oluliselt suuremad kui

97 96 EE - EP B1 EPSC-d vehiikliga ravitavatelt MeCP2 /y-hiirtelt. Need erinevused ilmnevad ka rakkudevahelisel keskmistamisel. Mõõtmiste käigus kontrollitakse ka juurdepääsukindluse, lekkimise ja rakkude sisemise erutuvuse rühmadevahelist ühesugusust. EPSC-intervallide mõõtmine näitab ka intervalli kerget suurenemist EPSC-sündmuste vahel (EPSC vähenenud sagedus) metsiktüüpi ja MeCP2 /yloomade vahel (P = 0,04, Kolmogorovi-Smirnovi test). Seega näitavad meie leiud, et ekstsitatoorse sünaptilise ülekande vähenemine McCP2 /y-hiirte kortikaalsetes rakkudes ja selle osaline päästmine pärast cg-2-allüülp-ravi on osaliselt põhjustatud EPSC amplituudi muutusest sünapside tugevuse muutuse tagajärjel, mis vahendavad ekstsitatoorset ülekannet selles piirkonnas. G-2-allüülP-ga ravimine stimuleerib kortikaalsete jätkete küpsemist 1 2 Kasutame Golgi värvimist neuronite märgistamiseks hõredalt ja eristuvalt ning rakendame peeneralduslikku konfokaalset pildindust dendriitjätkete tiheduse ja morfoloogia mõõtmiseks märgistatud rakkudes, piirates analüüsi. kihi püramidaalsete neuronitega motoorse korteksi osades kriitilise perioodi hiirtelt (P28). Ehkki väikese suurendusega pildinduses joonistub selgelt välja püramiidrakkude dendriitide ulatus, kasutame suuremat suurendust sünaptiliste kontaktide loendamiseks ja iga jätke morfoloogilise klassi määramiseks. Liigitame jätke kas suurteks ja pirnjateks ( mushroom, M seen), lühikesteks ning jässakateks ( stubby, S jässakas), lühikeseks ja peenteks ( thin, T peen) või filopoodideks (F). Jätkete tiheduse võrdlemisel haruühiku kohta ilmneb jätkete vähenenud tiheduse suundumus väljalülitusega neuronitel, mis vaeggeensetel loomadel raviga suurel määral paraneb. Leiame väljalülitusega loomadel dendriitsete kontaktide arvu ja küpsemisoleku defitsiitide puhul potentsiaali toetada funktsionaalseid defekte ekstsitatoorsel ülekandel viisil, mis on võimalik pärast cg-2-allüülp manustamist ravida. cg-2-allüülp vähendab täiskasvanud MeCP2+/ -hiirtel silma domineerimise (Ocular Dominance, OD) plastilisust 30 OD plastilisuse arengulisi muutusi juhitakse osaliselt IGF-1-juhtetee aktivatsiooni teel ja (1-3)IGF-1 manustamine võib vähendada OD plastilisust metsiktüüpi noortel hiirtel (Tropea et al., 06). Seega testime, kas cg-2-allüülp-ravi suudab stabiliseerida pikemaajalist OD plastilisust, mis täheldatakse täiskasvanud MeCP2-mutantidel. Emased MeCP2+/- hiired, vanuses P60 või enam, allutatakse monokulaarsele

98 97 EE - EP B1 deprivatsioonile 4 päeva ja neid ravitakse samaaegselt cg-2-allüülp-ga. cg-2-allüülpravi vähendab OD plastilisust täiskasvanud Mecp2+/- hiirtel, näidates, et cg-2-allüülp võib tõepoolest kiiresti indutseerida sünapside stabiliseerimist või küpsemist. Bradükardiat ravitakse MeCP2 /y-hiirtel cg-2-allüülp-ga 1 Lisaks cg-2-allüülp efektiivsuse uurimisele neurofüsioloogiliste sümptomite parandamisel taotleme toime iseloomustamist, mis on sellel organismi üldisele tervisele. Kliinilised ja eksperimentaalsed tõendid näitavad Retti sündroomi patsientidel autonoomse süsteemi düsfunktsioone nagu labiilne hingamisrütm ja südame vähenenud baasjoone vagaalne toon (Julu et al., 01). Tagasisidemehhanismide kehv kontroll, mis reguleerivad vererõhu homeostaasi sümpaatilise süsteemi, näiteks hüperventilatsioonist indutseeritud südamelöögisageduse vähenemise kaudu, on Retti sündroomiga patsientidel sage ja võib põhjustada eluohtlikke südame arütmiaid (Acampa ja Guideri, 06; Julu et al., 01). Südame düsautonoomia patogenees, ehkki seda ei mõisteta hästi, osutab sellele, et põhjuseks võivad olla ebaküpsed neuronaalsed ühendused ajutüves. MeCP2 /y-hiirtel esinevate südamelöögisageduse häirete ja cg-2-allüülp-ravi toime uurimiseks jälgime reaalajas südamelöögisagedust tuimastamata metsiktüüpi ning MeCP2 /y-loomadel, keda ravitakse vehiikli või cg-2-allüülp-ga. Metsiktüüpi hiirtel ilmneb südamelöögisageduse mõõtmistulemuste korrapärane jaotus, keskmiselt 70 lööki minutis. Seevastu MeCP2 /y-hiirtel ilmneb ebakorrapärasem südamelöögisagedus madalama keskmise sagedusega, mille esinemine väheneb oluliselt pärast ravimist cg-2-allüülp-ga. cg-2-allüülp manustamine parandab lokomotoorset aktiivsust ja eluiga 2 30 MeCP2 /y-hiirtel tekivad Retti sündroomiga sarnased sümptomid alates elunädalast, kui nad muutuvad järk-järgult letargiliseks, neil tekib kõnnaku ataksia ja nad surevad. 12. elunädalal (Chen et al., 01). Baasjoone lokomotoorne aktiivsus salvestatakse samuti hiirtel pärast 6 nädalat, loendades öise infrapunakiire läbimise sündmusi puurisisesel alal. MeCP2 väljalülitusega hiirtel (KO) ilmneb võrreldes metsiktüüpi (WT) hiirtega lokomotoorse aktiivsuse märkimisväärselt vähenenud tase, kuid ravi cg-2-allüülp-ga (KO-T) tõstab taset.

99 98 EE - EP B1 Lõpuks ilmneb võrreldes MeCP2 väljalülitusega pesakonnakaaslastega MeCP2-/y hiirtel, keda on ravitud cg-2-allüülp-ga, ka elumuse suurenemine. Mõõdame ka cg-2-allüülp-ravi toimet neuronite rakukeha suurusele hipokampuses. Hiiri ravitakse cg-2-allüülp-ga, nagu eespool, kirjeldatakse, lokomotoorse aktiivsuse suhtes. Rakukeha suurus on neuronites hipokampuse CA3-piirkonnas MeCP2 suhtes vaeggeensetel loomadel võrreldes metsiktüüpi loomadega oluliselt häiritud. cg-2- allüülp-ravi suurendab rakukeha keskmist suurust vaeggeensetel loomadel, kuid selle toime rakukeha suurusele metsiktüüpi loomadel on väike või puudub. Näide 22. Suukaudse cg-2-allüülp toime elumusele Retti sündroomi puhul hiirtel 1 Kuna Retti sündroom on krooniline, invaliidistav häire, mis hõlmab motoorsete oskuste kadu, on soovitav ravida Retti sündroomi, kasutades hõlpsalt manustatavaid preparaate. Selleks võime kasutada ära cg-2-allüülp ning seonduvate ühendite ootamatult kasulikke terapeutilisi ja farmakokineetilisi omadusi (USA patent nr 7,776,876, and 8,067,42). Seega manustame cg-2-allüülp-d oraalselt MeCP2-puudulikkusega hiirtele. Lühidalt, vesilahust või teist kompositsiooni, mis sisaldab cg-2-allüülp farmatseutiliselt efektiivset kogust ( või 80 mg/kg looma kohta) manustatakse iga päev. MeCP2- puudulikkusega kontroll-loomadele manustame ainult soolalahust ja metsiktüüpi loomi kasutatakse baasjoone andmete saamiseks sarnaselt ülesehitusega. Metsiktüüpi loomadel määratletakse igal ajahetkel, et elumus on 0%. MeCP2- puudulikkusega loomadel väheneb elumus oluliselt. Siiski pärast cg-2-allüülp oraalset manustamist McCP2-puudulikkusega hiirtele suureneb elumus oluliselt. Näide 23. cg-2-allüülp toime hoogude aktiivsusele Retti sündroomi puhul hiirtel 2 Kuna hood on Retti sündroomi silmapaistev, ohtlik ja raskesti ravitav eripära, määrame cg-2-allüülp toime hoogude aktiivsusele MeCP2-puudulikkusega loomadel. Elektroentsefalograafilised salvestised metsiktüüpi hiirtelt ja MeCP2-puudulikkusega hiirtelt, keda ravitakse kas soolalahuse või cg-2-allüülp-ga, saadakse meetoditega, mis kirjeldab USA patent nr 7,714,0. 30 Leidsime, et cg-2-allüülp võib olla efektiivne nii motoorsete hoogude kui ka mittekonvulsiivsete hoogude vähendamisel. Järeldused

100 99 EE - EP B1 1 2 cg-2-allüülp võib olla efektiivne teraapia Retti sündroomiga inimeste ravimiseks. Lisaks kuna cg-2-allüülp-l on ootamatult pikem poolväärtusaeg kui looduslikult esineval ühendil ((1-3) IGF-1; glütsüül-prolüül-glutamaat või GPE), leiame, et cg-2- allüülp kasutamisel on selged ja olulised eelised võrreldes farmakoloogiliste ainete, sealhulgas GPE-ga. Näiteks ei ole vaja viia cg-2-allüülp-d kohale intravenoosselt, subkutaanselt, intraventrikulaarselt või parenteraalselt. Tegelikult võib kasutada suukaudseid ravimvorme, mis hõlmavad mikroemulsioone, jämeemulsioone, vedelkristallpreparaate, nanokapsleid ning hüdrogeele, suukaudselt manustatavate preparaatide nagu tabletttide, kapslite ja geelide tootmisel, mis võivad parandada neuroloogilist funktsiooni ning ravida neurodegeneratiivseid seisundeid. Käesoleva leituise kohaseid ühendeid võib kasutada olukordades, kus patsiendi motoorne funktsioneerimine on alla selle, mis on vajalik tabletti või kapsli neelamiseks. On olemas mitut tüüpi lahustuvaid geele ühendite suukaudseks manustamiseks ja neid võib kasutada käesoleva leituise kohase ühendi või kompositsiooni viimiseks patsienti. Kuna cg-2-allüülp-d on hõlpsalt suukaudselt manustatav ja suukaudselt efektiivne neurodegeneratiivsete häirete, sealhulgas Retti sündroomi, ravimisel, järeldame, et cg-2-allüülp võib olla mugav ning kasulik Retti sündroomiga patsientide pikaajalise teraapia jaoks. Lisaks kuna Retti sündroom jagab olulisi tunnuseid teiste autismispektri häiretega, võivad käesoleva leiutise kohased ühendid olla kasulikud ravist saadava kasu pakkumisel loomadel, kellel on muu ASD ning inimestel, kellel on autism, Aspergeri sündroom, lapse desintegratiivne häire ja täpsustamata pervasiivne arenguhäire (PDD-NOS). Näide 24. ASD-de ravi On mitu loomsüsteemi, mida on kasutatud ühendite terapeutilise mõjususe hindamiseks ASD-de puhul. Shank3-puudulikkusega hiirmudel 30 Shank3-puudulikkusega hiiri kasutatakse uuringus ASD-ga seondunud 22q13 kustutuse sündroomi mudelina. 22q13 kustutuse sündroomi on seostatud kustutuste või mutatsioonidega Shank3- geenis (Bonaglia et al., 06). Shank3-geen kodeerib üldist kinnitusvalku, mis

101 0 EE - EP B1 1 moodustab toese glutamaatergilistes sünapsides (Boeckers et al., 06). Shank3 on ülioluline osa postsünaptilise tiheduse (postsynaptic density, PSD) tuumast ja värbab paljusid olulisi funktsionaalseid elemente PSD-sse ning sünapsi, sealhulgas α-amino- 3-hüdroksüül--metüül-4-isoksasool-propioonhappe (AMPA), metabotroopse glutamaadi (mglu) ja N-metüül-D-asparagiinhappe (NMDA) glutamaadiretseptorite ning tsütoskeletoni elementide komponente. Viimastest uuringutest, milles käsitletakse 22q13 kustutusi / Shank3 mutatsioone, ilmneb, et Shank3 võib põhjustada ASD monogeenset vormi sagedusega 0, 1% ASD juhtudest (Durand et al., 07; Moessner et al., 07; Gauthier et al., 08). Täispika Shank3 häiritud ekspressiooniga hiirmudeli tekitamist on tehnika tasemes eelnevalt kirjeldatud (Bozdagi et al., Molecular Autism, 1:1, lk 4). Lühidalt, Bruce4 C7BL/6 embrüonaalseid tüvirakke kasutati hiireliini genereerimiseks, millel olid enne eksonit 4 ja 9 sisestatud loxp-saidid. loxp-saitide vahel asuv alleel lõigati välja ja liin säilitati eksonite 4 9 kustutusega, st Shank3 anküriini kordusdomeenide täieliku kustutusega. Tekitati metsiktüüpi (+/+), heterosügootsed ja (+/ ) ja väljalülitusega ( / ) hiired mendeleeruvate sagedustega heterosügootide ristamisest heterosügootidega. Kinnitati täispika Shank3-mRNA vähenemist 0% heterosügootidel (qpcr) ja Shank3-valgu vähenenud ekspressiooni (Shank3- antikehaga N69/46 immuunlaigutuse teel). Näiteks kasutatakse heterosügootseid hiiri, kes on genereeritud metsiktüüpi hiirte ristamisel heterosügootidega, et modelleerida kõige paremini 22q13 kustutuse sündroomi põhjustava Shank3 haplopuudulikkust. Meetodid Medikamentoosne ravi kuu vanused metsiktüüpi ja heterosügootsed Shank3-puudulikkusega hiired jagatakse 4 ravirühma: platseeboga ravitud metsiktüüpi, platseeboga ravitud Shank3- puudulikkusega rühm ja kaks Shank3-defektset cg-2-allüülp-ga ravitud rühma. Loomadele antakse platseebot (vett) või suukaudselt manustatavas vees formuleeritud cg-2-allüülp-d kaks korda päevas 14 päeva. cg-2-allüülp manustatakse kahes annuses: 1 või 60 mg/kg. Metoodika

102 1 EE - EP B1 Metoodika üksikasjaliku kirjelduse on esitanud Bozdagi et al. (Molecular Autism, 1:1). Käitumise analüüsid Käitumise hindamisi teostatakse mitmel ajahetkel ja need hõlmavad sotsiaalsete interaktsioonide ning sotsiaalse ultrahelikommunikatsiooni analüüsi kooskõlas metoodikaga, mis on kirjeldanud Bozdagi et al. Lühidalt, igas ravirühmas hinnatakse meeste ja naiste sotsiaalseid interaktsioone. Isaseid indiviide peetakse rühmapuurides ja testitakse individuaalselt puhta allapanuga puhastes puurides. Iga testimisseanss kestab min. Igaüks hiirindiviididest pannakse paari erineva tundmatu innas C7BL/6J-emasega. Digitaalne sisetelevisioonikaamera (Panasonic, Secaucus, NJ, USA) paigutatakse horisontaalselt 30 cm kaugusele puurist. Ultrahelimikrofon (Avisoft UltraSoundGate kondensaatormikrofoni kapsli CM1; Avisoft Bioacoustics, Berliin, Saksamaa) kinnitatakse cm kõrgusele puurist. Diskreetimissagedus on mikrofoni puhul khz ja lahutusvõime on 16 bitti. Ehkki kasutatud seadmetega ei ole võimalik eristada hüüde, mis isane indiviid ja emane partner kuuldavale toovad, toob isaslooma ja emaslooma interaktsioonide käigus valdava enamiku hüüde kuuldavale tavaliselt isasloom. Kogu seadmestik sisaldub heli nõrgestavas keskkonnakambris (ENV-018V; Med Associates, St Albans, VT, USA), mida valgustab üks 2 W punane valgusti. Seejärel annab isaste indiviide videotele skoorid uurija, keda ei ole teavitatud indiviidi genotüübist ega ravirühmast, mõõdikute alusel, milleks on nina nuusutamine ninaga, anogenitaalse piirkonna nuusutamine ninaga ja muude kehapiirkondade nuusutamine, kasutades tarkvara Noldus Observer (Noldus Teabe Technology, Leesburg, VA, USA). Ultrahelihäälitsusi tuvastavad kaks väga hea väljaõppega uurijat genotüübi/ravirühma andmete suhtes pimemenetluse teel ja kokkuvõtlik statistika arvutatakse, kasutades paketti Avisoft. Hindajatevaheline reliaablus on 9%. Andmeid analüüsitakse, kasutades mittepaaris Studenti t-testi. Lõhnadega harjumise / lõhnade harjumatuse testimine teostatakse isastel ja emastel hiirtel iga rühma puhul. Metoodika on selline, nagu eelnevalt kirjeldatud (Silverman et al.,, Yang et al., 09 ja Silverman et al., ). Mittesotsiaalsed ja sotsiaalsed lõhnad esitatakse real vatitampoonidel, mis sisestatakse kodupuuri järjestikku, igaüks 2 min jooksul, järgmises järjekorras: vesi, vesi, vesi (destilleeritud vesi); mandel, mandel, mandel (1:0 lahjendusega mandliekstrakt); banaan, banaan, banaan (1:0 lahjendusega kunstlik banaani lõhna- ja maitseaine); sotsiaalne 1, sotsiaalne 1,

103 2 EE - EP B1 sotsiaalne 1 (pühitud puuri põhjast, kus asuvad mittetuttavad sobiva sooga B6-hiired) ning sotsiaalne 2, sotsiaalne 2, sotsiaalne 2 (pühitud puuri põhjast, kus asuvad mittetuttavad sobiva sooga 129/SvImJ-hiired). Korduvate mõõdikute ühefaktoriline ANOVA teostati iga ravirühma piires iga harjutamissündmuste kogumi ja iga harjutamissündmuse puhul, millele järgneb Tukey post hoc-test. Hipokampuse lõikude elektrofüsioloogia Pärast surma valmistatakse hiirtest akuutsed hipokampuse lõigud (30 μm) kasutades koelõikurit. Lõike säilitatakse ja katsed teostatakse temperatuuril 32 C. Lõike voolutatakse Ringeri lahusega, mis sisaldab järgmist (mm): NaCl, 12,0; KCl, 2,; MgSO4, 1,3; NaH2PO4, 1,0; NaHCO3, 26,2; CaCl2, 2,; glükoos, 11,0. Ringeri lahusesse juhitakse 9% O2 / % CO2 mulle temperatuuril 32 C rakuväliste salvestuste ajal (elektroodlahus: 3 M NaCl). Lõike säilitatakse 1 tunni jooksul enne välja ekstsitatoorsete postsünaptiliste potentsiaalide (fepsp) baasjoone väljaselgitamist, mis salvestatakse stratum radiatum'is piirkonnas CA1, mis on erutatud Schafferi kollateraal-kommissuraalsete aferentide stimuleerimisega (0 µs impulssi iga 30 s tagant) piirkonda CA3 paigutatud bipolaarsete tungstenelektroodide abil. Teststiimuli intensiivsust kohandati fepsp-de saamiseks amplituudidega, mis on pool maksimaalsest reaktsioonist. EPSP esialgne tõus (mv/ms) määratakse nelja järjestikuse reaktsiooni keskmise lainekuju alusel. Sisend-väljund-kõverad (I/O) genereeritakse graafikuna, mille telgedeks on fepsp tõus ja presünaptilise kogupaugu amplituud madala mg 2 +-sisaldusega (0,1 mm) lahuses. AMPA-retseptori vahendatud ja NMDA-retseptori vahendatud sisend-väljund-suhteid mõõdetakse ionotroopsete glutamaadiretseptorite antagonistide manulusel: 2-amino-2-fosfonopentaanhape (2- amino-2-phosphonopentanoic acid, APV) (0 µm) ja 6-cyano-7-nitrokinoksaliiN-2,3- dioon (6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione, CNQX) (0 µm). Paarisimpulssreaktsioone mõõdetakse stiimulitevaheliste intervallidega 0 ms ja neid väljendatakse suhtena teisele stimuleerimisimpulsile antud keskmiste reaktsioonide ja esimese stimuleerimisimpulsi vahel. LTP-d indutseerib kas kõrgsagedusstiimul (neli 0 Hz jada, 1 s stimulatsioon, mis eraldab min) või teeta-pakettstimulatsioon (theta-burst stimulation, TBS) ( neljast impulsist paketti sagedusel 0 Hz, mis eraldab 0 ms) või ühekordne 0 Hz stimulatsioon kontroll- ja geneetiliselt modifitseeritud hiirte puhul. Pikaajalise depressiooni (LTD) indutseerimiseks stimuleeritakse Schafferi kollateraale

104 3 EE - EP B1 madalsagedusliku või paarisimpulsside madalsagedusliku stiimuliga (900 impulssi sagedusel 1 Hz 1 min jooksul) mglu retseptoritest sõltuva LTD indutseerimiseks. Andmed väljendatakse ± SD keskmistena ja statistilised analüüsid teostatakse, kasutades ANOVA-t või Studenti t-testi statistilise olulisuse juures, mis on seatud α- tasemele 0,0. Tulemused Käitumuslik 1 Isaste katseloomade poolse summaarse sotsiaalse nuusutamise kumulatiivne kestus on väiksem platseeboga ravitavas Shank3-puudulikkusega rühmas kui platseeboga ravitavas metsiktüüpi rühmas. Lisaks emiteerib platseeboga ravitav Shank3- puudulikkusega rühm isas- ja emasloomade vaheliste sotsiaalsete interaktsioonide ajal vähem ultrahelihäälitsusi kui metsiktüüpi kontroll-loomad. cg-2-allüülp-ga ravimine kahes Shank3-puudulikkusega rühmas põhjustab summaarse sotsiaalse nuusutamise kestuse kumulatiivse kestuse olulist suurenemist võrreldes platseeboga ravitava Shank3-puudulikkusega rühmaga. Pealegi ilmneb cg- 2-allüülP-ga ravitavatel rühmadel suurem ultrahelihäälitsuste arv kui platseeboga ravitaval mutantsel rühmal. Lõhnadega harjumise / lõhnade harjumatuse uuringus, millega sooviti kinnitada, et hiired suudavad tuvastada sotsiaalseid feromoone, ilmnes kõigil 4 rühmal harjumise normaalne tase (seda näitab vähenenud aeg, mis kulub kolme sama lõhna järjestuse nuusutamisele) ja oodatud harjumatus (seda näitab suurenenud aeg, mis kulub teistsuguse lõhna nuusutamisele). Elektrofüsioloogia 2 30 Välja ekstsitatoorse postsünaptilise potentsiaali (fepsp) tõusu ja stiimuli intensiivsuse teljega graafikust ilmneb sisend-väljund-kõverate vähenemine platseeboga ravitavas Shank3-puudulikkusega rühmas võrreldes kontrollrühmaga. Heterosügootses platseeboga ravitavas rühmas täheldame ka AMPA-retseptori vahendatud väljapotentsiaale, mis kajastub sisend-väljund-funktsiooni keskmise tõusu 0% vähenemises võrreldes metsiktüüpi kontroll-rühmaga. Seevastu, kui analüüsitakse sisend-väljund-suhet konkureeriva AMPA-/kainaadiretseptori antagonisti CNQX manulusel, et mõõta sünaptilise NMDA-retseptori funktsiooni, ei ole erinevust metsiktüüpi ja platseeboga ravitavate heterosügootsete rühmade vahel. Tulemused

105 4 EE - EP B1 näitavad, et heterosügootsetel Shank3-hiirtel toimub retseptori vahendatud baasülekandes AMPA spetsiifiline vähenemine. 1 Mõlemas rühmas normaliseerib cg-2-allüülp-ga ravimine AMPA-retseptori vahendatud väljapotentsiaale ning põhjustab sisend-väljund-funktsiooni keskmise tõusu suurenemist võrreldes platseeboga ravitava Shank3-puudulikkusega rühmaga. LTP säilitamine platseeboga ravitavas Shank3-puudulikkusega rühmas on selgesti häiritud võrreldes metsiktüüpi kontrollrühmaga. TBS LTP testid ( neljast impulsist paketti sagedusel 0 Hz vahedega 0 ms) näitavad samuti võimendamise olulist vähenemist 60 min pärast TBS-i platseeboga ravitavas Shank3-puudulikkusega rühmas. Erinevalt LTP puhul täheldatavast muutunud sünaptilisest plastilisusest ei muutunud pikaajaline depressioon (LTD) mutantses rühmas oluliselt. cg-2-allüülp-ravi suurendab hipokampuse pikaajalist võimendust (LTP) ja selle säilitamist mõlemas Shank3-puudulikkusega rühmas võrreldes platseeboga ravitud Shank3-defektse rühmaga. Arutelu ja järeldused Kehvad sotsiaalsed pädevused ja korduvad käitumised on ASD kõikide vormide tavalised tunnused ja põhilised diagnostilised mõõdikud. Aeglustunud intellektuaalne areng ja alaarenenud keeleoskused on samuti üldine tunnus, mis esineb kõikides ASD-des peale Aspergeri sündroomi Eespool kirjeldatud loommudelid on tehnika tasemes üldtunnustatud kliiniliste inimseisunditega sarnaseid sümptomeid ilmutavatena. Kõikidel eespool käsitletud mutantsetel mudelitel (NLGN3, NLGN4, CADM1, NRXN1, FMR1, Shank3) ilmneb sotsiaalsete oskuste häire või suurenenud sotsiaalne ärevus. Vähenenud ekstsitatoorne transmissioon hipokampusesse on tuvastatud NRXN1, Shank3, MeCP2 ja FMR1 suhtes mutantsetes loommudelites. Hetkel ei ole kirjeldatud ASD polügeneetilisi või hulgitegurilisi mudeleid. Eespool kirjeldatud loommudelid pakuvad geneetiliste defektide alusel, mis teadaolevalt tekitavad inimpopulatsioonis ASD-d, parimat võimalust ASD-teraapiate efektiivsuse testimiseks. Seega võimaldab cg-2-allüülp efektiivsus ASD loommudelites mõistlikult prognoosida efektiivsust inimindiviidil, kellel on ASD. Näide 2. Signaalimisvalkude fosfo-erk1/2 ja fosfo-akt mõõtmine FXS-hiirte lümfotsüütide fosfo-voolutsütomeetria analüüsi teel

106 EE - EP B1 Signaalitransduktsiooni rajad ühendavad väliseid stiimuleid rakkude vastustega, mis tavaliselt reguleerivad rakkude proliferatsiooni, surma ning diferentseerumist. Kasutame ERK1/2 ja Akt-i fosfospetsiifilisi antikehi, mis tunnevad need valgud ära ainult siis, kui nad on fosforüülitud. Üks voolutsütomeetria ainulaadsetest tunnustest on võime teostada fosforüülumisolekute mõõtmisi, mida ei saada standardsete biokeemiliste tehnikatega, sellel on selgesti lai potentsiaal ravimi ravitoime uurimiseks. Meetodid Lümfotsüüdid isoleeritakse viiest fmr1 väljalülitusega ja viiest metsiktüüpi pesakonnakaaslasest kontrollhiirest, vastavalt uuringuajale pärast cg-2-allüülp süstimist. Lümfotsüüte uuritakse kahe signaalimisefektori, p-erk1/2 ja p-akt, aktivatsiooni suhtes, kasutades fosforüülumise olekut aktivatsiooni mõõdikuna voolutsütomeetria teel (fosfovool). Võetavad mõõdikud on järgmised: 1. Voolutsütomeetria, üldine ja fosforüülitud ERK lümfotsüütides 1 2. Voolutsütomeetria, üldine ja fosforüülitud AKT lümfotsüütides Tulemused 2 30 Leiame, et fmr1 väljalülitusega hiirtest isoleeritud lümfotsüütidel ilmneb ERK1/2 ja Akt fosfo-epitoopide aktivatsioon. Keskmised fluorestseeruva intensiivsuse (mean fluorescent intensity, MFI) tasemed p-akt ja p-erk1/2 fmr1 väljalülitusega hiirtel, keda on ravitud cg-2-allüülp-ga, vähenevad kõikides ajapunktides: 1, 30, 60 ja 240 minutit pärast üksikut ravi. Leiame sarnaseid vähenemisi MFI fmr1 väljalülitusega hiirtel pärast cg-2-allüülp-ravi ja järjestikust päeva. Kokkuvõttes tekitab cg-2-allüülp ERK1/2 ja Akt-i fosfo-aktivatsiooni olulist vähenemist fmr1 väljalülitusega hiirtel. See tulemuse näitab, et p-erk ja p-akt on kasulikud bioloogilised markerid terapeutilise mõjususe hindamiseks inimeste ravimisel ASD või NDD-ga. Kuna perk-i ja pakt-i ekspressioon lümfotsüütides on sarnane nende fosforüülitud valkude ekspressioonile fmr1 väljalülitusega hiirte ajudes, prognoosib ravitoimete jälgimine lümfotsüütides mõistlikult cg-2-allüülp toimeid mõjutatud loomade, sealhulgas inimeste ajudes. Näide 26. Inimeste ravi, kellel on fragiilse X-i sündroom, kasutades G-2-allüülP-d

107 6 EE - EP B1 Selle määramiseks, kas cg-2-allüülp on efektiivne patsientide ravimisel, kellel on fragiilse X-i sündroom, teostame topeltpimeda, platseebokontrollitud uuringu. Meetodid Patsiendid Meessoost patsiendid, kellel on fragiilse X-i sündroom, diagnoositakse geneetilise analüüsi teel, mis demonstreerib täielikku fmr1-mutatsioon. Sümptomeid hinnatakse, kasutades üht või enam siin eespool käsitletud kliinilistest hindamistööriistadest. Iga patsient saab skoori vastavalt ühele või enam kliinilisele hindamistööriistale ühe või enama suhtes korduva käitumise (Repetitive Behavior, RBB), ärevuse ning seltsivuse hulgast. Kliiniline üldmulje raskusastme (CGI-S) skoor 4 või suurem või ABC koguskoor 30 või suurem kaasatakse. Ravimi kohaleviimine 1 Kaasatud patsiendid jagatakse rühmadesse. Kõik kaasatud alustavad uuringut platseebo 2-nädalase üksikpimeda manustamisega b.i.d. Seejärel manustatakse cg- 2-allüülP-d oraalselt annuses 3 mg/kg b.i.d. (n = ) või 70 mg/kg b.i.d (n = ) 28 päeva, millele järgneb 28 päeva platseebot või platseebo suhtes juhuslikustamise korral manustatakse cg-2-allüülp-d annuses 70 mg/kg b.i.d. alates päeval 42 ja lõpetades päeval 70. Enne uuringuravimi annustamist muudetakse cg-2-allüülp kasutuskõlblikuks maasikamaitselise lahjendiga, et anda vedelik oraalseks manustamiseks. Platseebo (n = ) on maasikalahjendi ja vesi. Hindamised, farmakokineetika 2 Vereproovid kõikidelt indiviididelt igas rühmas võetakse päeval 42 ja päev 70. Neli (4) proovi kogutakse alates päeval 42 (enne annust ja 2 4 tundi pärast annust) ja päeval 70 (enne annust ja 2 4 tundi pärast annust). Samuti kogutakse iga ajapunkti varuproov. Mõjusus 30 Mõjusus määratakse, kasutades haiguse raskusastme kliinilist üldmuljet (CGI-S), kliinilise üldmulje paranemist (CGI-I), fragiilse X-i sündroomi hindamisskaalat, klinitsisti täidetud fragiilse X-i domeeni spetsiifilisi probleeme (visuaalse analoogi skaala), hooldaja kolme suurimat muret (visuaalse analoogi skaala), käitumishälvete nimekirja, Vinelandi kohaneva käitumise skaalat, CASI-16, CYBOCS-PDD, hoogude päevikut,

108 7 EE - EP B1 arvutipõhist silmade jälgimist, kognitsiooni arvutipõhist mõõtmist, kasutades kitap-i, ning ekspressiivse keele valimi moodustamise ülesanne. Mõjususe tulemuste mõõdikud Järgmist nelja mõjususe tulemuse mõõdikute rühma hinnatakse, võrreldes cg-2- allüülp kaht annuse taset, eraldi ja kombineeritult, platseeboga. Üldise funktsionaalsete tulemuste mõõdikud Järgmisi mõõdikuid hinnatakse nulljoonel ning ravi ajal ja muutusi võrreldakse toimeaine ja platseeborühmade vahel. Fragiilse X-i sündroomi hindamisskaala muutused arvutatakse iga indiviidi puhul nulljoone (enne ravi) päeva 14 ning ravi lõpu (päev 42 ja 70) vahel. Üldist tulemust mõõdetakse kliinilise üldmulje raskusastme ja paranemise skaaladega (CGI-S ja CGI-I) igal kliinikuvisiidil, nulljoonest edasi(nt päevad 14, 28, 42, 6, 70 ning 84). 1 klinitsisti täidetud fragiilse X-i domeeni spetsiifiliste probleemide muutused, mis hõivati visuaalse analoogi skaala (VAS) abil, arvutatakse iga indiviidi puhul nulljoone (enne ravi), päeva 14 ning ravi lõpu (päev 42 ja 70) vahel. Hooldaja kolme suurima mure (seoses indiviidi fragiilse X-i sündroomiga) muutused, mis hõivatakse visuaalse analoogi skaala (VAS) abil, arvutatakse indiviididel nulljoone (enne ravi), päeva 14 ning ravi lõpu (päev 42 ja 70) vahel. CASI-16, CYBOCS-PDD, käitumishälvete nimekirja (ABC), ekspressiivse keele valimi moodustamise ülesande ja Vinelandi kohaneva käitumise e(vabs) muutused arvutatakse iga indiviidi puhul nulljoone, päev 14 ning päeva 42 ning 70 vahel. Füsioloogiliste tulemuste mõõdikud 2 30 Seerumi tasemed ja standardsete hematoloogia ja keemia parameetrite muutused (sealhulgas kilpnäärme funktsioon) arvutatakse nulljoonest päevani 70. Fundoskoopia ja mandlite suurus dokumenteeritakse nulljoonel ning päeval 14, 28, 42, 6, 70 ja 84. Voolutsütomeetriat kasutatakse ensüümide Akt ja ERK fosforüülumise oleku hindamiseks perifeersetes lümfotsüütides, vereproovidel, mis on saadud päevadel 14, 28, 42, 6 ning 70. EKG-d hinnatakse sõelumisel, nulljoonel, päeval 28, 42, 6 ja 70. Kognitiivsed / automatiseeritud tulemuste mõõdikud

109 8 EE - EP B1 Järgmisi mõõdikuid hinnatakse nulljoonel, uuringuravimi manustamise ajal ja järel. Kognitsiooni arvutipõhist mõõtmist, kasutades kitap-i, hinnatakse nulljoonel, päeval 14, päeval 42, päeval 70 ja päeval 84. Arvutipõhist silmade jälgimise hindamist mõõdetakse nulljoonel, päeval 14, 28, 42, 6 ja päeval 70. Farmakokineetilised-farmakodünaamilised suhted Sobitatud farmakokineetilised (pharmacokinetic, PK) ja mõjususe (PD) mõõdikud kogutakse kõikidelt patsientidelt, kes on juhuslikustatud saama kas 3 mg/kg või 70 mg/kg oraalset cg-2-allüülp-d kaks korda päevas. Farmakodünaamilised markerid hõlmavad üldisi funktsionaalseid, füsioloogilisi ja kognitiivseid/automatiseeritud tulemusi. Lähenemisviis on hinnata mõjususe mõõdikute muutuseid uuringu jooksul ja korreleerida need mõõdetud või arvutuslike farmakokineetiliste tulemusnäitajatega. Lisaks kasutatakse PK-/PD-mudeleid suhte väljaselgitamiseks cg-2-allüülp kontsentratsiooni veres ja toime vahel, kui see on asjakohane. Statistiliste meetodite mõjusus 1 2 ANOVA, ANCOVA ja Chi-ruut-teste kasutatakse mõjususe mõõdiku tasemete ja ravirühmade vaheliste muutuste võrdlemiseks. Iga annuserühma võrreldakse samaaegse platseeborühmaga ja kombineeritud annuserühma võrreldakse kombineeritud platseeborühmaga. Ollakse seisukohal, et kahe jaotussabaga p- väärtus < 0,0 näitab statistilist olulisust. Üldine proovi suurus 60 (40:) võimaldab toime suurusi >0,80 aktiivse ja platseebo vahel tuvastatakse statistiliselt olulisena (2 jaotussabaga α = 0,0) 80% võimsusega põhitulemusmõõdikute alusel, nagu fragiilse X-i sündroomi hindamisskaala. Võrdlusteks igas annuserühmas (see tähendab, hindamisaegade võrdlemiseks) tuvastatakse toime suurused >0,7 toimeaines ja platseebos statistiliselt olulisena (2 jaotussabaga α = 0,0) 80% võimsusega. Farmakokineetika 30 Maksimaalne kontsentratsioon (Cmax; piik), minimaalne kontsentratsioon (Cmin; org), C0-4 ja kõvera aluse pindala (area under the curve, AUC) parameeter püsiseisundis arvutatakse otse cg-2-allüülp kontsentratsiooni andmetest ja võetakse kokku igas ajapunktis, kasutades standardset kirjeldavat statistikat, sealhulgas keskmisi, mediaane, geomeetrilisi keskmisi, standardhälbeid, vahemikke ning 9% usaldusvahemikke.

110 9 EE - EP B1 Selle määramiseks, kas on assotsiatsioone PK-parameetri ja mõjususe mõõdikute vahel, korreleeritakse mõjususe mõõdikute muutused uuringu jooksul PKparameetriga, mida hinnatakse erinevates ajapunktides. Neid assotsiatsioone testitakse statistiliselt, kasutades korrelatsioonikoefitsente ja üldisi lineaarseid mudeleid. Tulemused ja kokkuvõte Leiame, et cg-2-allüülp-d taluvad patsiendid hästi. Leiame täiendavalt, et cg-2- allüülp-l kliiniliselt olulised ja olulised toimed kliinilise tulemuste parandamiseks, mõõdetuna, kasutades üht või enam siin kirjeldatud hindamistööriistadest. Leiame samuti, et cg-2-allüülp normaliseerib perk-i ja pakt-i tasemed. See uuring demonstreerib, et cg-2-allüülp on efektiivne fragiilse X-i sündroomi kahjulike sümptomite ravimisel inimestel. Näide 26. cg-2-allüülp toimed sünaptilisele plastilisusele pärast läbistavat ballistilisesarnast ajuvigastust rottidel I: 1 Selles näites uurisime seda, kas cg-2-allüülp-l on põletikuvastane ja antiapoptootiline aktiivsus pärast läbistavat ballistilisesarnast ajuvigastust (PBBI). On näidatud, et molekulidel, mis on struktuuriga, mis on sarnane cg-2-allüülp-ga, on mälu võimendamise toimed või need parandavad passiivse vältimise õppimist in vivo ja soodustavad neuriitide väljakasvu in vitro. See osutab sellele, et ravi c(gp) analoogidega võimendab neuroplastilisust ja sünapside moodustumist. Uurisime seega, kas cg-2-allüülp reguleerib geene ja kodeeritud valke, mis valitsevad sünaptilist plastilisust pärast PBBI-d. Läbistava ballistilisesarnase ajuvigastuse (PBBI) meetodid 2 30 Unilateraalne frontaalne PBBI mudel, mis jäljendab pea kuuli- või fragmendihaava ballistilist dünaamikat (Williams, 0; Williams, 06), indutseeriti kohandatud sondi stereotaktilise sisestusega läbi parema frontaalse korteksi. Ajutine õõnsus moodustati sondi otsale kinnitatud elastse ballooni kiire täitmise/tühjendamisega (see tähendab, <40 ms). PBBI-seade koosnes arvuti abil juhitavast hüdraulilise rõhu generaatorist (Mitre Corp McLean, VA), PBBI-sondist ja stereotaksilise raamist, mis on varustatud spetsiaalselt projekteeritud sondihoidikuga, nagu eelnevalt kirjeldatud (Lu, 09; Williams, 0). Vigastuse raskusaste määrati ballooni suuruse järgi arvutipõhise hüdraulilise rõhu juhtimisel. 0,63 cm laienemisele kalibreeritud balloonii läbimõõt

111 1 EE - EP B1 esindas % roti koguajumahust, väljendades seega % PBBI-d. Kõige operatsioonid tehti anesteesia all. Testitud rühmad: Simuleeritud + vehiikel, PBBI + vehiikel, PBBI + cg-2-allüülp (30 mg/kg oraalse sundsöötmise teel, 30 min pärast vigastust ning uuesti üks kord iga päev kuni tulemusnäitaja). Kõik protseduurid kiitis heaks WRAIR-i institutsionaalne loomakaitse ja loomade kasutamise komitee. Loomi peeti AALAC-i akrediteeritud rajatises. cg-2-allüülp oraalne manustamine cg-2-allüülp (või vehiikel) manustati loomadele oraalse sundsöötmise teel annuses 30 mg/kg. ELISA Sihtvalgud kvantifitseeriti interleukiin-1 beeta ( IL-1beeta ) (GenWay Biotech GWB- SKR 1 07) ja interleukiin-6 ( IL-6 ) (GenWay Biotech GWB-ZZD0) ELISA-tega vastavalt tootja juhistele. Tasemed arvutati ja normaliseeriti valgu üldkontsentratsioonile, mis määrati BCA-analüüsi teel (n = 9 rühma kohta). 1 Western blot-analüüs Proove analüüsiti 24 h pärast ja 3 ja 7 päeva pärast vigastust kõikide rühmade puhul (simuleeritud + vehiikel, PBBI + vehiikel, PBBI + cg-2-allüülp). Kude homogeeniti RIPA-puhvris, mis sisaldas HALT-proteaasi inhibiitoreid. Üldvalgu põhines BCAanalüüsil. Blot-analüüsid blokeeriti % piimaga, sondeeriti anti-atf3, anti-bax või anti-bcl2-ga. Blot-analüüsid taassondeeriti anti-beeta-aktiini antikehaga valgu laadimise suhtes kontrollimiseks. Riba intensiivsuse analüüs tehti, kasutades tarkvara LAS4000 ja ImageQuantTL (GE Healthcare) (n = 9 rühma kohta). Neuroplastilisuse mrna-massiivid 2 Genereeriti cdna. Kogu RNA-st üksikutelt loomadelt, kasutades juhuslikke praimereid. cdna külvati sihitud PCR-massiivile, mille valmistas SA Biosciences, ja saadus tuvastati, kasutades SyBr-i rohelist fluorestsentsi. Ct tasemed normaliseeriti beetaaktiinile. Vigastuse tulemusi võrreldi simuleerituga suhteliste koguste (relative quantity, RQ) hindamiseks (n = 6 rühma kohta). Tulemused 30 PBBI-vigastus eraldi viis uuritud põletikuliste ja apoptootiliste mõõdikute ägeda (24 h pärast PBBI-d) suurenemiseni. Joonis FIG 33A 33F näitab neid tulemusi. PBBI

112 111 EE - EP B1 1 suurendas IL-1beeta (joonis FIG 33A) ja IL-6 (joonis FIG 33D) kogust. cg-2-allüülp vähendas proinflammatoorseid tsütokiine IL1-beeta (joonis FIG 33C) ja IL-6 (joonised fig 33 D ja 33F). ANOVA: * p < 0,0, ** p < 0,01; vea tulp: SEM. cg-2-allüülp suurendas IL1-beeta tasemeid 3 päeva pärast PBBI-d, mis võib olla kompenseeriv allavoolu sihtmärgi IL-6 suhtes. Ravi cg-2-allüülp-ga vähendas IL1-beeta tasemeid 7 päeva pärast PBBI-d (joonis FIG 33C). cg-2-allüülp-ravi vähendas IL-6 tasemeid mõlemal 24 h. (joonis FIG 33D) ja 7 päeva (joonis FIG 33E) pärast PBBI-d, kuid avaldas vähe toime 3 päeva pärast (joonis FIG 33B). Need tulemused näitavad, et cg- 2-allüülP vähendas neid põletikulisi tsütokiine. Joonis FIG 34 näitab, et PBBI suurendas oluliselt ja oluliselt BAX-i ekspressioon (joonised fig 34 A, 34B ning 34C) ja BCL2 (joonised fig 34D, 34E, 34F, 34G ning 34H). cg-2-allüülp ei muutunud oluliselt BAX-i (joonised fig 34A 34C) või BCL2 (joonised fig 34D 34H) tasemeid. Joonis FIG 3 näitab, et PBBI suurendas ATF3 ekspressiooni kõikides ajapunktides (joonised fig 3A 3C). Üllataval moel leidsime, et cg-2-allüülp vähendas ATF3 24 h pärast PBBI-d, mõõdetuna üldiselt Western blot-analüüsi teel (joonis FIG 3A). Joonis FIG 36 näitab, et pärast PBBI-d suurendas cg-2-allüülp-ravi oluliselt Gria 4 (AMPA-retseptor; joonis FIG 36F) 24 h ajapunktis. Lisaks täheldasime suundumusi, sealhulgas: vähenenud Crem (CREB-inhibiitor; joonis FIG 36D), vähenenud NTF3 (joonis FIG 36J), vähenenud NTF4 (joonis FIG 36K), vähenenud Pcdh8 (tuumori supressorgeen; joonis FIG 36L), vähenenud BDNF (joonis FIG 36A), vähenenud Pim1; joonis FIG 36M) ja suurenenud Ppp3ca (joonis FIG 36N). Järeldused 2 30 Need suundumused RNA ekspressioonis, eriti suurenenud Gria 4, vähenenud Crem ning vähenenud Pcdh8 ekspressioon soodustavad neuroplastilisust. Vähenenud NTF3 ja NTF4 võimaldab sünaptilist moodustumist. Koos näitavad need tulemused, et cg-2-allüülp-l on põletikuvastased toimed pärast rasket PBBI-d ja võimendatud neuroplastilisus. Kuna selles katsesüsteemis saadud tulemused prognoosib mõistlikult inimestel ilmnevaid toimeid, võivad cg-2-allüülp ja sarnased tsüklilised GP-ühendid olla efektiivsed kerge, mõõduka või raske traumaatilise ajukahjustuse sümptomite ravimisel.

113 112 EE - EP B1 Näide 27. cg-2-allüülp toimed sünaptilisele plastilisusele pärast läbistavat ballistilisesarnast ajuvigastust rottidel II: Kasvuga seotud valk 43 ja sünaptofüsiin Selles näites uurisime cg-2-allüülp rolli geenide ja seonduvate valkude ekspressioonis, mis on kaasatud neuroplastilisusse, pärast läbistavat ballistilisesarnast ajuvigastust (PBBI; % vigastuse raskusaste) rottidel. Meetodid 1 Meetodid PBBI valmistamiseks selles näites on samad, mida on kirjeldatud eespool näiteks 26. Täiskasvanud Sprague-Dawley rotid määrati juhuslikult kolme rühma: simuleeritud (ainult kraniotoomia), PBBI + vehiikel (vaadake tähendab, H2O) ning PBBI + cg-2-allüülp. cg-2-allüülp (või vehiikel) manustati oraalse sundsöötmise teel tasemel 30 mg/kg 30 min möödumisel pärast vigastust ja jätkati üks kord iga päev pärast seda 7, 14 või 28 päeva. Iga ravi tulemusnäitaja puhul rotte voolutati ja ajusid töödeldi histoloogilise analüüsi jaoks (n = 6/rühm/ajapunkt). Aksonite tärkamise tuvastamiseks rakendati kasvuga seotud valgu 43 (GAP-43) immunohistokeemilist tuvastamist. Sünaptogenees määrati sünaptofüsiini (SYN) immunohistokeemia alusel. Histoloogiliseks kvantifitseerimiseks määrati integreeritud tihedus hipokampuse piirkonnas, kasutades tarkvara NIH ImageJ. Tulemused 2 Vehiikliga ravi rühmas vähendas PBBI oluliselt GAP-43 ekspressiooni ipsilateraalses hipokampuses 7 d, 14 d ja 28 d pärast vigastust ning kontralateraalses hipokampuses 7 d ja 14 d pärast vigastust (p < 0,0 vs. simuleeritud). SYN-i värvimise olulisi vähenemisi tuvastati 14 d ja 28 d pärast vigastust ipsilateraalses hipokampuses ja 14 d pärast vigastust kontralateraalses hipokampuses PBBI + vehiikli rühmas (p < 0,0 vs. simuleeritud). Pidev ravi cg-2-allüülp-ga ei ilmutanud toimet vigastusega indutseeritud GAP-43 või SYN-i ekspressiooni vähenemistele 7 d või 14 d pärast PBBI-d. Siiski 28 päeva pärast vigastust nõrgendas cg-2-allüülp-ravi nii GAP-43 kui ka SYN-i ekspressiooni PBBI-indutseeritud vähenemist tasemeteni, mis ei erinenud oluliselt simuleeritud kontrollidest, näidates vahepealset ravitoimet. Järeldused 30 Histoloogiline analüüs näitab, et PBBI indutseeris aksonite tärkamise ja sünaptogeneesi olulist vähenemist alaägeda kuni kroonilise faasi ajal pärast vigastust. Need tulemused näitavad cg-2-allüülp suundumust neuroplastilisuse soodustamisel.

114 113 EE - EP B1 Kuna kasutatav loomsüsteem prognoosib neuroplastilisust inimestel, näitavad need tulemused, et cg-2-allüülp võib olla efektiivne ajuvigastuse kahjulike toimete parandamisel. Siin esitatud kirjeldused ja näited on ainult illustreerimise otstarbel. Käesoleva leiutise ulatus ei ole mõeldud olema piiratud kirjeldatud teostustega. Muid teostusi, mis sisaldavad leiutisekohaseid elemente, võivad praktiseerida tarbetu eksperimenteerimiseta vastava ala asjatundjad. Kõiki selliseid teostusi peetakse seega käesoleva leiutise osaks. VIIDATUD ALLIKAD 1 Alarcon, M., Abrahams, B.S., Stone, J.L., Duvall, J.A., Perederiy, J.V., Bomar, J.M., Sebat, J., Wigler, M., Martin, C.L., Ledbetter, D.H., Nelson, S.F., Cantor, R.M., ja Geschwind, D.H. (08). Linkage, association, and gene-expression analyses identify CNTNAP2 as an autism-susceptibility gene. Am. J. Hum. Genet. 82, 19. Amir RE, Van den Veyver IB, Wan M, Tran CQ, Francke U, Zoghbi HY. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-cpgbinding protein 2. Nat Genet : Andari E, Duhamel JR, Zalla T, Herbrecht E, Leboyer M, Sirigu A. () Promoting social behavior with oxytocin in high-functioning autism spectrum disorders. PNAS 7: Arking, D.E., Cutler, D.J., Brune, C.W., Teslovich, T.M., West, K., Ikeda, M., Rea, A., Guy, M., Lin, S., Cook, E.H., ja Chakravarti, A. (08). A common genetic variant in the neurexin superfamily member CNTNAP2 increases familial risk of autism. Am. J. Hum. Genet. 82, Bakkaloglu, B., O'Roak, B.J., Louvi, A., Gupta, A.R., Abelson, J.F., Morgan, T.M., Chawarska, K., Klin, A., ErcaN-Sencicek, A.G., Stillman, A.A., Tanriover, G., Abrahams, B.S., Duvall, J.A., Robbins, E.M., Geschwind, D.H., Biederer, T., Gunel, M., Lifton, R.P., ja State MW (08). Molecular cytogenetic analysis and resequencing of contactin associated protein-like 2 in autism spectrum disorders.

115 114 EE - EP B1 Bakkaloglu, B., O'Roak, B.J., Louvi, A., Gupta, A.R., Abelson.J.F., Morgan, T.M., Chawarska, K., Klin, A., ErcaN-Sencicek, A.G., Stillman, A.A., Tanriover, G., Abrahams, B.S., Duvall, J.A., Robbins, E.M., Geschwind, D.H., Biederer, T., Gunel, M., Lifton, R.P., ja State MW (08). Molecular cytogenetic analysis and resequencing of contactin associated protein-like 2 in autism spectrum disorders. Am. J. Hum. Genet. 82, BaroN-Cohen S, Wheelwright S, Hill J, Raste Y, Plumb I (01) The "Reading the Mind in the Eyes" test, revised version: A study with normal adults, and adults with Asperger's syndrome or high-functioning autism. J Child Psychol Psychiatry 42: Belichenko PV, Oldfors A, Hagberg B, Dahlström A. Rett syndrome: 3-D confocal microscopy of cortical pyramidal dendrites and afferents. Neuroreport : Biederer T, Sara Y, Mozhayeva M, Atasoy D, Liu X, Kavalali ET, Südhof TC. (02) SynCAM, a synaptic adhesion molecule that drives synapse assembly. Science 297(86): Chapleau CA, Larimore JL, Theibert A, Pozzo-Miller L. (09) Modulation of dendritic spine development and plasticity by BDNF and vesicular trafficking: fundamental roles in neurodevelopmental disorders associated with mental retardation and autism. J. Neurodev. Disord. 1: Cheng CM, Mervis RF, Niu SL, Salem N Jr, Witters LA, Tseng V, Reinhardt R, Bondy CA. InsuliN-like growth factor 1 is essential for normal dendritic growth. J Neurosci Res : Comery TA, Harris JB, Willems PJ, Oostra BA, Irwin SA, Weiler IJ, Greenough WT. (1997) Ebanormaalal dendritic spines in fragile X knockout mice: maturation and pruning deficits. Proc. Natl Acad. Sci. USA 94: Durand CM, Betancur C, Boeckers TM, Bockmann J, Chaste P, Fauchereau F, Nygren G, Rastam M, Gillberg IC, Anckarsäter H, Sponheim E, GoubraN-Botros H, Delorme R, Chabane N, MoureN-Simeoni MC, de Mas P, Bieth E, Rogé B, Heron D, Burglen L, Gillberg C, Leboyer M, Bourgeron T. (07) Mutations in the gene encoding the synaptic scaffolding protein SHANK3 are associated with autism spectrum disorders. Nat Genet. 39: 2 27.

116 11 EE - EP B1 Etherton MR, Blaiss CA, Powell CM, Südhof TC. (09) Mouse neurexin-1α deletion causes correlated electrophysiological and behavioural changes consistent with cognitive impairments. Proc. Nat. Acad. Sci. 6: Garbern, J.Y., Neumann, M., Trojanowski, J.Q., Lee, V.M., Feldman, G., Norris, J.W., Friez, M.J., Schwartz, C.E., Stevenson, R., ja Sima, A.A. (). A mutation affecting the sodium/proton exchanger, SLC9A6, causes mental retardation with tau deposition. Brain 133, Gauthier J, Bonnel A, St-Onge J, Karemera L, Laurent S, Mottron L, Fombonne E, Joober R, Rouleau GA. (0) NLGN3/NLGN4 gene mutations are not responsible for autism in the Quebec population. Am. J. Med. Genet. B. Neuropsychiatr. Genet. 132B(1): Gilfillan, G.D., Selmer, K.K., Roxrud, I., Smith, R., Kyllerman, M., Eiklid, K., Kroken, M., Mattingsdal, M., Egeland, T., Stenmark, H., Sjoholm, H., Server, A., Samuelsson, L., Christianson, A., Tarpey, P., Whibley, A., Stratton, M.R., Futreal, P.A., Teague, J., Edkins, S., Gecz, J., Turner, G., Raymond, F.L., Schwartz, C., Stevenson, R.E., Undlien, D.E., ja Stromme, P. (08). SLC9A6 mutations cause X-linked mental retardation, microcephaly, epilepsy, and ataxia, a phenotype mimicking Angelman syndrome. Am. J. Hum. Genet. 82, 03. Gilman SR, Iossifov I, Levy D, Ronemus M, Wigler M, Vitkup D. Rare de novo variants associated with autism implicate a large functional network of genes involved in formation and function of synapses. Neuron : Giza J, Urbanski MJ, Prestori F, Bandyopadhyay B, Yam A, Friedrich V, Kelley K, D'Angelo E, Goldfarb M. () Behavioural and cerebellar transmission deficits in mice lacking autism-linked gene Islet BraiN-2. J. Neurosci. 30: Guastella AJ, Einfeld SL, Gray KM, Rinehart NJ, Tonge BJ, Lambert TJ, Hickie IB. () Intranasal oxytocin improves emotion recognition for youth with autism spectrum disorders. Biol Psychiatry. 67: Hagerman R, Hoem G, Hagerman P. () Fragile X and autism: Intertwined at the molecular level leading to targeted treatments. Mol. Autism 1:

117 116 EE - EP B1 Harris SW, Hessl D, GoodliN-Jones B, Ferranti J, Bacalman S, Barbato I, Tassone F, Hagerman PJ, Herman H, Hagerman RJ. (08) Autism profiles of males with fragile X syndrome. Am J Ment Retard. 113: Hiramoto T, Kang G, Suzuki G, Satoh Y, Kucherlapati R, Watanabe Y, Hiroi N. (11) Tbxl: identification of a 22q11.2 gene as a risk factor for autism spectrum disorder in a mouse model. Hum Mol Genet. 11 : Hutsler JJ, Zhang H. Increased dendritic spine densities on cortical projection neurons in autism spectrum disorders. Brain Res. 1309: Irwin SA, Galvez R, Greenough WT. Dendritic spine structural anomalies in fragile-x mental retardation syndrome. Cereb Cortex. 00 : Jamain S, Quach H, Betancur C, Råstam M, Colineaux C, Gillberg IC, Soderstrom H, Giros B, Leboyer M, Gillberg C, Bourgeron T; Paris Autism Research International Sibpair Study. (03) Mutations of the X-linked genes encoding neuroligins NLGN3 and NLGN4 are associated with autism. Nat. Genet. 34: Jamain S, Radyushkin K, Hammerschmidt K, Granon S, Boretius S, Varoqueaux F, Ramanantsoa N, Gallego J, Ronnenberg A, Winter D, Frahm J, Fischer J, Bourgeron T, Ehrenreich H, Brose N. (08) Reduced social interaction and ultrasonic communication in a mouse model of monogenic heritable autism. Proc. Nat. Acad. Sci. : Kim HG, Kishikawa S, Higgins AW, Seong IS, Donovan DJ, Shen Y, Lally E, Weiss LA, Najm J, Kutsche K, Descartes M, Holt L, Braddock S, Troxell R, Kaplan L, Volkmar F, Klin A, Tsatsanis K, Harris DJ, Noens I, Pauls DL, Daly MJ, MacDonald ME, Morton CC, Quade BJ, Gusella JF. (08) Disruption of neurexin 1 associated with autism spectrum disorder. Am. J. Hum. Genet. 82: Klemmer P, Meredith RM, Holmgren CD, Klychnikov OI, Stahl-Zeng J, Loos M, van der Schors RC, Wortel J, de Wit H, Spijker S, Rotaru DC, Mansvelder HD, Smit AB, Li KW. Proteomics, ultrastructure, and physiology of hippocampal synapses in a fragile X syndrome mouse model reveal presynaptic phenotype. J Biol Chem :249 4.

118 117 EE - EP B1 Krueger DD, Osterweil EK, Chen SP, Tye LD, Bear MF. (11) Cognitive dysfunction and prefrontal synaptic ebanormaalalities in a mouse model of fragile X syndrome. Proc. Natl Acad. Sci. USA 8: Lauterborn JC, Rex CS, Kramár E, Chen LY, Pandyarajan V, Lynch G, Gall CM. (07) BraiN-derived neurotrophic factor rescues synaptic plasticity in a mouse model of fragile X syndrome. J. Neurosci. 27: Lintas C, Persico AM. (09) Autistic phenotypes and genetic testing: state-ofthe-art for the clinical geneticist. J. Med. Genet. 46: Makkonen I, Kokki H, Kuikka J, Turpeinen U, Riikonen R. Effects of fluoxetine treatment on striatal dopamine transporter binding and cerebrospinal fluid insulin-like growth factor-1 in children with autism. Neuropediatrics :7 9. Marchetto et al., () A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell 143:27 39 (sh lisateave). Marshall CR, Noor A, Vincent JB, Lionel AC, Feuk L, Skaug J, Shago M, Moessner R, Pinto D, Ren Y, Thiruvahindrapduram B, Fiebig A, Schreiber S, Friedman J, Ketelaars CE, Vos YJ, Ficicioglu C, Kirkpatrick S, Nicolson R, Sloman L, Summers A, Gibbons CA, Teebi A, Chitayat D, Weksberg R, Thompson A, Vardy C, Crosbie V, Luscombe S, Baatjes R, Zwaigenbaum L, Roberts W, Fernandez B, Szatmari P, Scherer SW. (08) Structural variation of chromosomes in autism spectrum disorder. Am J Hum Genet. 82: Minshew NJ, Williams DL. The new neurobiology of autism: cortex, connectivity, and neuronal organization. Arch Neurol : Moessner R, Marshall CR, Sutcliffe JS, Skaug J, Pinto D, Vincent J, Zwaigenbaum L, Fenandez B, Roberts W, Szatmari P, Scherer SW. (07) Contribution of SHANK3 mutations to autism spectrum disorder. Am. J. Hum. Genetics 81: Moretti P, Levenson JM, Battaglia F, Atkinson R, Teague R, Antalffy B, Armstrong D, Arancio O, Sweatt JD, Zoghbi HY. (06) Learning and memory and synaptic plasticity are impaired in a mouse model of Rett syndrome. J. Neurosci. 26:

119 118 EE - EP B1 Paylor, R., Glaser, B., Mupo, A., Ataliotis, P., Spencer, C., Sobotka, A., Sparks, C., Choi, C.H., Oghalai, J., Curran, S., Murphy, K.C., Monks, S., Williams, N., O'Donovan, M.C., Owen, M.J., Scambler, P.J., ja Lindsay, E. (06). PNAS 3, Penagarikano, O., Abrahams, B.S., Herman, E.I., Winden, K.D., Gdalyahu, A., Dong, H., Sonnenblick, L.L, Gruver, R., Almajano, J., Bragin, A., Golshani, P., Trachtenberg, J.T., Peles, E., ja Geschwind, D.H. (11). Absence of CNTNAP2 Leads to Epilepsy, Neuronal Migration Ebanormaalalities, and Core Autism- Related Deficits. Cell 147, Riikonen R, Makkonen I, Vanhala R, Turpeinen U, Kuikka J, Kokki H. (06) Cerebrospinal fluid insulin-like growth factors IGF-1 and IGF-2 in infantile autism. Dev. Med. Child Neurol. 48: Sebat J, Lakshmi B, Malhotra D, Troge J, Lese-Martin C, Walsh T, Yamrom B, Yoon S, Krasnitz A, Kendall J, Leotta A, Pai D, Zhang R, Lee YH, Hicks J, Spence SJ, Lee AT, Puura K, Lehtimäki T, Ledbetter D, Gregersen PK, Bregman J, Sutcliffe JS, Jobanputra V, Chung W, Warburton D, King MC, Skuse D, Geschwind DH, Gilliam TC, Ye K, Wigler M. (07) Strong association of de novo copy number variation mutations with autism. Science 316(823): Schaevitz LR, Moriuchi JM, Nag N, Mellot TJ, Berger-Sweeney J. () Cognitive and social functions and growth factors in a mouse model of Rett syndrome. Physiol. Behav. 0: Schütt J, Falley K, Richter D, Kreienkamp HJ, Kindler S. (09) Fragile X mental retardation protein regulates the levels of scaffold proteins and glutamate receptors in postsynaptic densities. J. Biol. Chem. 284: Silverman JL, Turner SM, Barkan CL, Tolu SS, Saxena R, Hung AY, Sheng M, Crawley JN: Sociability and motor functions in Shank1 mutant mice. Brain Res. 30 Silverman JL, Yang M, Lord C, Crawley JN: Behavioural phenotyping assays for mouse models of autism. Nat Rev Neurosci, 11:

120 119 EE - EP B1 Spence SJ, Schneider MT. The role of epilepsy and epileptiform EEGs in autism spectrum disorders. Pediatr Res. 09 6: Spencer CM, Alekseyenko O, Serysheva E, Yuva-Paylor LA, Paylor R. (0) Altered anxiety-related and social behaviors in the Fmr1 knockout mouse model of fragile X syndrome. Genes Brain Behav. 4: Strauss, K.A., Puffenberger, E.G., Huentelman, M.J., Gottlieb, S., Dobrin, S.E., Parod, J.M., Stephan, D.A., ja Morton, D.H. (06). Recessive symptomatic focal epilepsy and mutant contactin-associated protein-like 2. N. Engl. J. Med. 34, Stromme, P., Dobrenis, K., Sillitoe, R.V., Gulinello, M., Ali, N.F., Davidson, C., Micsenyi, M.C., Stephney, G., Ellevog, L., Klungland, A., ja Walkley, S.U. (11). X-linked AngelmaN-like syndrome caused by Slc9a6 knockout in mice exhibits evidence of endosomal-lysosomal dysfunction. Brain. 134: Sykes NH, Toma C, Wilson N, Volpi EV, Sousa I, Pagnamenta AT, Tancredi R, Battaglia A, Maestrini E, Bailey AJ, Monaco AP; International Molecular Genetic Study of Autism Consortium (IMGSAC). (09) Copy number variation and association analysis of SHANK3 as a candidate gene for autism in the IMGSAC collection. Eur. J. Hum. Genet. 17: Tabuchi K, Blundell J, Etherton MR, Hammer RE, Liu X, Powell CM, Südhof TC. (07) A neuroligin-3 mutation implicated in autism increases inhibitory synaptic transmission in mice. Science 318(847): Takayanagi Y, Fujita E, Yu Z, Yamagata T, Momoi MY, Momoi T, Onaka T. () Impairment of social and emotional behaviors in Cadm1-knockout mice. Biochem. Biophys. Res. Commun. 396: Tropea D, Giacometti E, Wilson NR, Beard C, McCurry C, Fu DD, Flannery R, Jaenisch R, Sur M. (09) Partial reversal of Rett Syndrome-like symptoms in MeCP2 mutant mice. Proc. Natl Acad. Sci. USA 6: Vernes, S.C., Newbury, D.F., Abrahams, B.S., Winchester, L., Nicod, J., Groszer, M., Alarcon, M., Oliver, P.L., Davies, K.E., Geschwind, D.H., Monaco, A.P., ja Fisher, S.E. (08). A functional genetic link between distinct developmental language disorders. N. Engl. J. Med. 39,

121 1 EE - EP B1 Yan J, Noltner K, Feng J, Li W, Schroer R, Skinner C, Zeng W, Schwartz CE, Sommer SS. (08) Neurexin 1 alpha structural variants associated with autism. Neurosci Lett. 438: Yan QJ, Asafo-Adjei PK, Arnold HM, Brown RE, Bauchwitz RP. (04) A phenotypic and molecular characterization of the fmr1-tm1cgr fragile X mouse. Genes Brain Behav. 3: Yang M, Crawley JN: Simple behavioural assessment of mouse olfaction. Curr Protoc Neurosci 09, ptk 8 (üksus 8):24. 1 Zhiling Y, Fujita E, Tanabe Y, Yamagata T, Momoi T, Momoi MY. (08) Mutations in the gene encoding CADM1 are associated with autism spectrum disorder. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377: Zhao MG, Toyoda H, Ko SW, Ding HK, Wu LJ, Zhuo M. (0) Deficits in trace fear memory and long-term potentiation in a mouse model for fragile X syndrome. J. Neurosci. 2: (Parandus väljaandes: J Neurosci. 0, 2: 8112). Zoghbi HY. (0) MeCP2 dysfunction in humans and mice. J Child Neurol. :

122 121 EE - EP B1 Patendinõudlus 1 1. Ühend kasutamiseks meetodis autismispektri häire (ASD) või neuroloogilise arenguhäire (NDD) sümptomi ravimiseks loomal, kellel on selline häire, mis hõlmab nimetatud ühendi farmatseutiliselt efektiivse koguse manustamist, kusjuures nimetatud ühend on tsükliline glütsüül-2-allüülproliin (cg-2-allüülp), tsükliline tsükloheksüül-g-2mep või tsükliline tsüklopentüül-g-2mep, kus nimetatud sümptom on üks või enam täidesaatva funktsiooni defitsiidi, ärevuse, ebanormaalse hirmu konditsioneerimise, ebanormaalne sotsiaalse käitumise ning korduva käitumise hulgast. 2. Ühend kasutamiseks vastavalt nõudluspunktile 1, kusjuures nimetatud cg-2-allüülp või tsükliline tsükloheksüül-g-2mep või tsükliline tsüklopentüül-g-2mep sisaldab kas vesilahust ja üht või enamat farmatseutiliselt aktsepteeritavat abiainet, lisandit, kandeainet või adjuvanti või üht või enamat abiainet, kandeainet, lisandit, adjuvanti või sideainet tabletis või kapslis. 3. Ühend kasutamiseks vastavalt ükskõik millisele nõudluspunktile 1 kuni 2, kus häire on valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: autistlik häire, Aspergeri sündroom, lapse desintegratiivne häire ja täpsustamata pervasiivne arenguhäire (PDD-NOS), nõudmiste patoloogiline vältimine (PDA), fragiilse X-i sündroom (FXS), Angelmani sündroom, tuberoosne skleroosne kompleks, Phelani-McDermidi sündroom, Retti sündroom, CDKL-mutatsioonid ning X-seoseliste varajases eas avalduvate krampide häire. 4. Ühend kasutamiseks vastavalt ükskõik millisele nõudluspunktile 1 kuni 2, kus ühend manustatakse kas otse või kaudselt vereringe kaudu Ühend kasutamiseks vastavalt ükskõik millisele nõudluspunktile 1 kuni 2, kus nimetatud ühendi nimetatud efektiivsel kogusel on madalam piirväärtus umbes 0,001 milligrammi looma massi kilogrammi kohta (mg/kg) ja ülemine piirväärtus umbes 0 mg/kg. 6. Ühend kasutamiseks vastavalt ükskõik millisele nõudluspunktile 1 kuni 2, kusjuures nimetatud ravi annab ASD või NDD sümptomi paranemise, mida hinnatakse, kasutades üht või enamat kliinilist testi, mis on valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: Retti sündroomi loomulik kulg / kliinilise raskusastme skoor, käitumishälvete nimekirja (ABC) väljaanne kogukondadele, Vinelandi kohaneva

123 122 EE - EP B1 1 käitumise skaalad, haiguse raskusastme kliiniline üldmulje (CGI-S), kliinilise üldmulje paranemine (CGI-I), hooldaja kurnatuse küsimustik (CSQ) või üks või enam füsioloogilist testi, mis on valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: elektroentsefalogrammi (EEG) teravike sagedus, EEG sagedusribade üldine võimsus, EEG sageduste poolkera sidusus, stereotüüpne käeliigutus, QTc ja südame löögisageduse varieeruvus (HRV), hingamisteede ebakorrapärasused ja südame-ja hingamisfunktsiooni sidestus võrreldes kontroll-loomadega, kellel on nimetatud häire. 7. Ühend kasutamiseks vastavalt ükskõik millisele nõudluspunktile 1 kuni 2, kus nimetatud ravi vähendab täiendavalt sümptomit, mis on valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: ruumilise orientatsiooni kaotus, vähenenud õppimisvõime, vähenenud ruumiline mälu, kognitiivse kaardistamise ja stseenimälu defitsiidid, konfiguraalsete või konjunktiivsete assotsiatsioonide vähenenud kiire omandamine, ebanormaalne liikumine ning bradükardia. 8. Ühend kasutamiseks meetodis autismispektri häire (ASD) või neuroloogilise arenguhäire (NDD) ravimiseks imetajal, kellel on selline häire, mis hõlmab nimetatud ühendi manustamist imetajale, kusjuures nimetatud ühendil on järgmine valem: või selle farmatseutiliselt aktsepteeritav sool või hüdraat, milles X 1 on valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: NR', O ja S; 2 X 2 on valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: CH2, NR', O ja S; R 1, R 2, R 3, R 4 ja R 3 on sõltumatult valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: -H, -OR', -SR', -NR'R', -NO 2, -CN, -C(O)R', -C(O)OR', -C(O) NR'R', -C(NR') NR'R', trihalometüül, halogeen, alküül, asendatud alküül, heteroalküül, asendatud heteroalküül, alkenüül, asendatud alkenüül, alkünüül, asendatud alkünüül, arüül, asendatud arüül, heteroarüül, asendatud heteroarüül, arüülalküül, asendatud arüülalküül, heteroarüülalküül ja asendatud heteroarüülalküül; iga R' on sõltumatult valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: -H, alküül, heteroalküül, alkenüül, alkünüül, arüül, arüülalküül, heteroarüül ja heteroarüülalküül;

124 123 EE - EP B1 või R 4 ja R 3 koos võetuna on -CH2-(CH2)N-CH2-, kus n on täisarv 0 6; või R 2 ja R 3 koos võetuna on -CH2-(CH2)N-CH2-, kus n on täisarv 0 6; tingimusel, et kui R 1 = metüül ja R 2 = R 3 = R 4 = H, siis R bensüül, ja kui R 1 = H, vähemalt üks R 2 ja R 3 hulgast H Ühend kasutamiseks vastavalt nõudluspunktile 8, kusjuures R 1 = metüül või R 1 = allüül või R 2 = R 3 = metüül ja X 2 = S või, kus R 1 = allüül, R 2 = R 3 = R 4 = R = H, X 1 = NH, X 2 = CH2 või, kus R 1 = metüül, R 2 = R 3 = H, R 4 ja R koos võetuna on -CH2-(CH2)3-CH2-, X 1 = NH, X 2 = CH2 või, kus R 1 = metüül, R 2 = R 3 = H, R 4 ja R koos võetuna on -CH2-(CH2)2-CH2-, X 1 = NH, X 2 = CH2.. Ühend kasutamiseks vastavalt nõudluspunktile 8, kusjuures nimetatud meetod hõlmab täiendavalt farmatseutiliselt aktsepteeritava abiaine või farmatseutilise aktsepteeritava abiaine ja sideaine või farmatseutiliselt aktsepteeritava abiaine ja kapsli manustamist. 11. Ühend kasutamiseks vastavalt nõudluspunktile 8, kusjuures nimetatud meetod hõlmab täiendavalt vähemalt ühe teise toimeaine manustamist, mis on valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: insuliinisarnane kasvufaktor 1 [IGF-I], insuliinisarnane kasvufaktor 2 [IGF-II], transformeeriv kasvufaktor β1, aktiviin, kasvuhormoon, närvikasvufaktor, kasvuhormooni siduv valk, IGFBP-3, aluseline fibroblastide kasvufaktor, happeline fibroblastide kasvufaktor, hst/kfgk-geeniprodukt, FGF-3, FGF- 4, FGF-6, keratinotsüütide kasvufaktor, androgeenindutseeritud kasvufaktor, int-2, fibroblastide kasvufaktori homoloogiline faktor 1 (FHF-1), FHF-2, FHF-3 ja FHF-4, keratinotsüütide kasvufaktor 2, gliiat aktiveeriv faktor, FGF-, FGF-16, tsiliaarne neurotroofne faktor, ajust pärinev kasvufaktor, neurotrofiin 3, neurotrofiin 4, luu morfogeneetiline proteiin 2 [BMP-2], gliiarakkude liinist pärinev neurotroofne faktor, aktiivsusest sõltuv neurotroofne faktor, tsütokiinide leukeemiat inhibeeriv faktor, onkostatiin M, interleukiin, α-interferoon, β-interferoon, γ-interferoon, konsensusinterferoon, TNF-α, klometiasool; kinureniinhape, Semax, takroliimus, L- treo-1-fenüül-2-dekanoüülamino-3-morfolino-1-propanool, adrenokortikotropiin-(4-9) analoog [ORG 2766], disotsilpiin [MK-801], selegiliin, glutamaadi antagonist, mis on valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: NPS6, GV260, MK-801 ning GV26, AMPA-antagonist, mis on valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: 2,3-

125 124 EE - EP B1 dihüdroksü-6-nitro-7-sulfamoüülbenso(f)kinoksaliin (NBQX), LY ja LY ning MAdCAM-1-vastane antikeha MECA Ühend kasutamiseks vastavalt nõudluspunktile 8, kusjuures nimetatud ühend on tsükliline G-2-allüülP. 13. Ühend kasutamiseks vastavalt nõudluspunktile 8, kusjuures nimetatud ühend on tsükliline tsükloheksüül-g-2mep. 14. Ühend kasutamiseks vastavalt nõudluspunktile 8, kusjuures nimetatud ühend on tsükliline tsüklopentüül-g-2mep Ühend kasutamiseks vastavalt ükskõik millisele nõudluspunktile 1 kuni 2, kus häire on valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: autistlik häire, Aspergeri sündroom, lapse desintegratiivne häire ja täpsustamata pervasiivne arenguhäire (PDD-NOS) ning nõudmiste patoloogiline vältimine (PDA). 16. Ühend kasutamiseks vastavalt ükskõik millisele nõudluspunktile 1 kuni 2, kus häire on valitud rühmast, mis koosneb järgmistest: fragiilse X-i sündroom (FXS), Angelmani sündroom, tuberoosne skleroosne kompleks, Phelani-McDermidi sündroom, Retti sündroom, CDKL-mutatsioonid ning X-seoseliste varajases eas avalduvate krampide häire. 17. Ühend kasutamiseks vastavalt nõudluspunktile 3, kusjuures nimetatud häire on Retti sündroom. 18. Ühend kasutamiseks vastavalt nõudluspunktile 3, kusjuures nimetatud häire on fragiilse X-i sündroom. 19. Ühend kasutamiseks vastavalt nõudluspunktile 3, kusjuures nimetatud häire on Phelani-McDermidi sündroom. 2. Ühend kasutamiseks vastavalt nõudluspunktile 3, kusjuures häire on Angelmani sündroom.

126 1/6 EE EP B1

127 2/6 EE EP B1 FIG 2

128 3/6 EE EP B1 FIG 3

129 4/6 EE EP B1 FIG 4

130 /6 EE EP B1 FIG

131 6/6 EE EP B1 FIG 6

132 7/6 EE EP B1 FIG 7

133 8/6 EE EP B1 FIG 8

134 9/6 EE EP B1 FIG 9A FIG 9B

135 /6 EE EP B1 FIG 9C

136 11/6 EE EP B1 FIG

137 12/6 EE EP B1 FIG 11

138 13/6 EE EP B1

139 14/6 EE EP B1

140 1/6 EE EP B1

141 16/6 EE EP B1

142 17/6 EE EP B1

143 18/6 EE EP B1

144 19/6 EE EP B1

145 /6 EE EP B1

146 21/6 EE EP B1

147 22/6 EE EP B1

148 23/6 EE EP B1

149 24/6 EE EP B1

150 2/6 EE EP B1

151 26/6 EE EP B1

152 27/6 EE EP B1

153 28/6 EE EP B1

154 29/6 EE EP B1

155 30/6 EE EP B1

PowerPoint Presentation

PowerPoint Presentation Pitt-Hopkinsi sündroomi modelleerimine Drosophila melanogaster is Laura Tamberg Juhendajad: Mari Palgi, PhD ja Tõnis Timmusk, PhD 27.10.2014 Drosophila melanogaster Üks esimesi mudelorganisme Thomas Hunt

Rohkem

Lasteendokrinoloogia aktuaalsed küsimused

Lasteendokrinoloogia aktuaalsed küsimused Haigusjuht nooruki androloogiast lasteendokrinoloogi pilgu läbi Aleksandr Peet SA TÜK Lastekliinik aleksandr.peet@kliinikum.ee Neuroloogi jälgimisel vanuseni 13 a. Esmakordselt visiidil vanuses 7a Elu

Rohkem

Tõenduspõhine hindamine kellele ja milleks? KIRSTI AKKERMANN TÜ PSÜHHOLOOGIA INSTITUUT KOGNITIIVSE JA KÄITUMISTERAAPIA KESKUS

Tõenduspõhine hindamine kellele ja milleks? KIRSTI AKKERMANN TÜ PSÜHHOLOOGIA INSTITUUT KOGNITIIVSE JA KÄITUMISTERAAPIA KESKUS Tõenduspõhine hindamine kellele ja milleks? KIRSTI AKKERMANN TÜ PSÜHHOLOOGIA INSTITUUT KOGNITIIVSE JA KÄITUMISTERAAPIA KESKUS Tõenduspõhine praktika 2 Teadlik, läbimõeldud ja mõistlik olemasolevate teaduslikult

Rohkem

Söömishäired lastel ja noortel

Söömishäired lastel ja noortel Söömishäired lastel ja noortel Ere Vasli Lastepsühhiaater SA Tallinna Lastehaigla/ Laste Vaimse Tervise Keskus 24.aprill 2014.a. Söömishäired laste ja noortel Terve ja patoloogiline söömiskäitumine Söömishäired

Rohkem

Microsoft Word - alkohol_K2_SoKo.doc

Microsoft Word - alkohol_K2_SoKo.doc Soovituste koostamise kokkuvõte - SoKo Kliiniline küsimus nr 2 Kas kõigil alkoholi kuritarvitamise ja alkoholisõltuvuse kahtlusega patsientidel tuleb lisaks anamneesile kasutada diagnoosi täpsustamiseks

Rohkem

propofol: CMDh scientific conclusions and grounds for the variation, amendments to the product information and timetable for the implementation - PSUS

propofol: CMDh scientific conclusions and grounds for the variation, amendments to the product information and timetable for the implementation - PSUS I lisa Teaduslikud järeldused ja müügilubade tingimuste muutmise alused 1 Teaduslikud järeldused Võttes arvesse ravimiohutuse riskihindamise komitee hindamisaruannet propofooli perioodiliste ohutusaruannete

Rohkem

TAI programm „Tervem ja kainem Eesti“ SA PERH Psühhiaatriakliinikus

TAI programm „Tervem ja kainem Eesti“ SA PERH Psühhiaatriakliinikus Kainem ja tervem Eesti (KTE) programm SA PERH psühhiaatriakliinikus Eerik Kesküla Teenusele pöördumine Saatekirjata Registreerumine tel 6172545 ja e-mail KTE@regionaalhaigla.ee Esmane hindamine 3 tööpäeva

Rohkem

II lisa Ravimi omaduste kokkuvõtte ja pakendi infolehe muudatused, esitatud Euroopa Ravimiameti poolt Käesolev ravimi omaduste kokkuvõte ja pakendi in

II lisa Ravimi omaduste kokkuvõtte ja pakendi infolehe muudatused, esitatud Euroopa Ravimiameti poolt Käesolev ravimi omaduste kokkuvõte ja pakendi in II lisa Ravimi omaduste kokkuvõtte ja pakendi infolehe muudatused, esitatud Euroopa Ravimiameti poolt Käesolev ravimi omaduste kokkuvõte ja pakendi infoleht on esildismenetluse tulemus. Vastavalt vajadusele

Rohkem

(Microsoft Word - lisa 7_Ps\374\374hika_2008m.doc)

(Microsoft Word - lisa 7_Ps\374\374hika_2008m.doc) Sotsiaalministri 20. detsembri 2007.a määruse nr 92 Tervishoiustatistika ja tervishoiualase majandustegevuse aruannete koostamise nõuded, andmete koosseis ning esitamise kord lisa 7 PSÜÜHIKA- JA KÄITUMISHÄIRED

Rohkem

Non-pharmacological treatment

Non-pharmacological treatment Siinusrütmi säilitava ravimi valik Kliiniline küsimus Kas siinusrütmi säilitavaks raviks tuleks eelistada mõnd konkreetset ravimirühma/ravimit: BBL vs Ic vs III? Olulised tulemusnäitajad Surm, ajuinfarkt,

Rohkem

Lisa 2 Kinnitatud Kambja Vallavalitsuse määrusega nr 11 PUUDEGA LAPSE HOOLDUS- JA SOTSIAALTEENUSTE VAJADUSE HINDAMISVAHEND Lapsevaema/hoold

Lisa 2 Kinnitatud Kambja Vallavalitsuse määrusega nr 11 PUUDEGA LAPSE HOOLDUS- JA SOTSIAALTEENUSTE VAJADUSE HINDAMISVAHEND Lapsevaema/hoold Lisa 2 Kinnitatud Kambja Vallavalitsuse 08.03.2018 määrusega nr 11 PUUDEGA LAPSE HOOLDUS- JA SOTSIAALTEENUSTE VAJADUSE HINDAMISVAHEND Lapsevaema/hooldaja/kontaktisiku üldandmed Ees ja perekonnanimi Isikukood

Rohkem

TAI_meta_99x148_EST.indd

TAI_meta_99x148_EST.indd METADOONASENDUSRAVI Narkootikumide süstimine seab Sind ohtu nakatuda HI- või hepatiidiviirusega, haigestuda südamehaigustesse (nt endokardiit) või põdeda muid haigusi. Kuna narkootikumide süstimine on

Rohkem

Microsoft Word - Document in Unnamed

Microsoft Word - Document in Unnamed RAVIMI OMADUSTE KOKKUVÕTE 1. RAVIMPREPARAADI NIMETUS Nizoral, 2% kreem 2. KVALITATIIVNE JA KVANTITATIIVNE KOOSTIS Üks gramm kreemi sisaldab 20 mg ketokonasooli. INN. Ketoconazolum Abiainete täielik loetelu

Rohkem

4. KIRURGIA Üliõpilase andmed. Need väljad täidab üliõpilane Praktikatsükli sooritamise aeg Kirurgia praktikatsükkel Ees- ja perekonnanimi Matriklinum

4. KIRURGIA Üliõpilase andmed. Need väljad täidab üliõpilane Praktikatsükli sooritamise aeg Kirurgia praktikatsükkel Ees- ja perekonnanimi Matriklinum 4. KIRURGIA Üliõpilase andmed. Need väljad täidab üliõpilane Praktikatsükli sooritamise aeg Kirurgia praktikatsükkel Ees- ja perekonnanimi Matriklinumber E-posti aadress Telefoninumber Praktikatsükli läbimine.

Rohkem

Versioon 2.0 TEAVE ARSTIDELE BOSENTAN NORAMEDA 62,5 MG JA 125 MG ÕHUKESE POLÜMEERIKATTEGA TABLETTIDE KOHTA Enne Bosentan Norameda väljakirjutamist pat

Versioon 2.0 TEAVE ARSTIDELE BOSENTAN NORAMEDA 62,5 MG JA 125 MG ÕHUKESE POLÜMEERIKATTEGA TABLETTIDE KOHTA Enne Bosentan Norameda väljakirjutamist pat TEAVE ARSTIDELE BOSENTAN NORAMEDA 62,5 MG JA 125 MG ÕHUKESE POLÜMEERIKATTEGA TABLETTIDE KOHTA Enne Bosentan Norameda väljakirjutamist patsiendile, lugege palun hoolikalt ravimi omaduste kokkuvõtet. Kui

Rohkem

KUI PATSIENT VAJAB KODUÕDE

KUI PATSIENT VAJAB KODUÕDE KUI PATSIENT VAJAB KODUÕDE ILVE-TEISI REMMEL JUHATAJA OÜ KODUÕDE KODUÕENDUS (HOME NURSING CARE) - KVALIFITSEERITUD ÕENDUSTEENUS, MIDA OSUTATAKSE ÄGEDA HAIGUSE PARANEMISPERIOODIS OLEVA, KROONILIST HAIGUST

Rohkem

Tartu Ülikool

Tartu Ülikool Tartu Ülikool Psühholoogia instituut Kristi Soogenbits Sotsiaalse Käitumise küsimustiku sobivus Aspergeri sündroomiga teismeliste isiksuseomaduste mõõtmiseks ja antud küsimustiku normide uuendamine. Magistritöö

Rohkem

No Slide Title

No Slide Title Eutanaasia. Arsti pilk Katrin Elmet katrin.elmet@kliinikum.ee 24. november 2010 Eutanaasia surma saabumise Aktiivne eutanaasia Passiivne eutanaasia kiirendamine Soovitud (voluntary) Soovimatu (non-voluntary)

Rohkem

Microsoft PowerPoint - Roosimaa.ppt

Microsoft PowerPoint - Roosimaa.ppt ENERGEETILISES METABOLISMIS OSALEVATE GEENIDE EKSPRESSIOON MÜOKARDIS JA HL-1 RAKULIINIS Mart Roosimaa TÜ arstiteaduskond EESTI TEADUSTE AKADEEMIA ÜLIÕPILASTÖÖDE KONKURSI VÕITJATE KONVERENTS 2008 Südamelihas

Rohkem

Akadeemilise personali tööstressi ja läbipõlemise ohjamise meetmed (AcadOSI) Tallinna Tehnikaülikool psühholoogia õppetool professor Mare Teichmann 12

Akadeemilise personali tööstressi ja läbipõlemise ohjamise meetmed (AcadOSI) Tallinna Tehnikaülikool psühholoogia õppetool professor Mare Teichmann 12 Akadeemilise personali tööstressi ja läbipõlemise ohjamise meetmed (AcadOSI) Tallinna Tehnikaülikool psühholoogia õppetool professor Mare Teichmann 12. veebruar 2009 TÖÖSTRESS on pingeseisund, mille on

Rohkem

Untitled-2

Untitled-2 Tervise Alkeemia Hiina meditsiin on aastatuhandete vanune tarkus sellest, mis on tervis ning kuidas seda luua ja hoida. Tervise Alkeemia keskuse eesmärgiks on aidata taastada harmoonia ja tasakaal inimese

Rohkem

Keemia koolieksami näidistöö

Keemia koolieksami näidistöö PÕLVA ÜHISGÜMNAASIUMI KEEMIA KOOLIEKSAM Keemia koolieksami läbiviimise eesmärgiks on kontrollida gümnaasiumilõpetaja keemiaalaste teadmiste ja oskuste taset kehtiva ainekava ulatuses järgmistes valdkondades:

Rohkem

Vähi läbilöögivalu Teave tervishoiutöötajale

Vähi läbilöögivalu Teave tervishoiutöötajale Vähi läbilöögivalu Teave tervishoiutöötajale Vähi läbilöögivalu (vllv) on mitmekesine 1 Valu on kõige sagedasem sümptom, mida seostatakse vähkkasvajaga või selle raviga. 2 Enamikul vähipatsientidest esineb

Rohkem

EMA_2011_ _ET_TRA

EMA_2011_ _ET_TRA II LISA Euroopa Ravimiameti esitatud teaduslikud järeldused ning positiivse arvamuse alused 1 Teaduslikud järeldused Docetaxel Teva Genrics ja sarnaste nimetuste (vt I lisa) teadusliku hindamise üldkokkuvõte

Rohkem

Microsoft Word - Document in Unnamed

Microsoft Word - Document in Unnamed Pakendi infoleht: teave kasutajale Betaserc 8 mg tabletid Betaserc 16 mg tabletid Betaserc 24 mg tabletid Beetahistiindivesinikkloriid Enne ravimi kasutamist lugege hoolikalt infolehte, sest siin on teile

Rohkem

Microsoft Word - Document in Unnamed

Microsoft Word - Document in Unnamed Pakendi infoleht: teave kasutajale Memantine Grindeks, 10 mg õhukese polümeerikattega tabletid Memantiinvesinikkloriid Enne ravimi kasutamist lugege hoolikalt infolehte, sest siin on teile vajalikku teavet.

Rohkem

ANOVA Ühefaktoriline dispersioonanalüüs Treeningu sagedus nädalas Kaal FAKTOR UURITAV TUNNUS Mitmemõõtmeline statistika Kairi Osula 2017/kevad

ANOVA Ühefaktoriline dispersioonanalüüs Treeningu sagedus nädalas Kaal FAKTOR UURITAV TUNNUS Mitmemõõtmeline statistika Kairi Osula 2017/kevad ANOVA Ühefaktoriline dispersioonanalüüs Treeningu sagedus nädalas Kaal FAKTOR UURITAV TUNNUS Factorial ANOVA Mitmefaktoriline dispersioonanalüüs FAKTOR FAKTOR Treeningu sagedus nädalas Kalorite kogus Kaal

Rohkem

EE - EP B1 Pürimidiini uurea derivaadid kinaasi inhibiitoritena 5 Leiutis käsitleb uusi ühendeid, koostisi, meetodeid ja kasutust. Täpsemalt kä

EE - EP B1 Pürimidiini uurea derivaadid kinaasi inhibiitoritena 5 Leiutis käsitleb uusi ühendeid, koostisi, meetodeid ja kasutust. Täpsemalt kä Pürimidiini uurea derivaadid kinaasi inhibiitoritena Leiutis käsitleb uusi ühendeid, koostisi, meetodeid ja kasutust. Täpsemalt käsitleb see ühendeid, mida võib kirjeldada kui heteroaromaatseid karbamiide

Rohkem

Microsoft PowerPoint - ainevahetus.ppt [Compatibility Mode]

Microsoft PowerPoint - ainevahetus.ppt [Compatibility Mode] Triin Marandi Tartu Forseliuse Gümnaasium EHK METABOLISM organismis toimuvad omavahel ja keskkonnaga seotud keemiliste reaktsioonide kogum erinevad orgaanilised ained väliskeskkonnast sünteesivad ise kehaomased

Rohkem

Mida räägivad logid programmeerimisülesande lahendamise kohta? Heidi Meier

Mida räägivad logid programmeerimisülesande lahendamise kohta? Heidi Meier Mida räägivad logid programmeerimisülesande lahendamise kohta? Heidi Meier 09.02.2019 Miks on ülesannete lahendamise käigu kohta info kogumine oluline? Üha rohkem erinevas eas inimesi õpib programmeerimist.

Rohkem

Microsoft Word - Document in Unnamed

Microsoft Word - Document in Unnamed PAKENDI INFOLEHT: INFORMATSIOON KASUTAJALE (käsimüügiravim*) IMODIUM, 2 mg kõvakapslid Loperamiidvesinikkloriid Lugege infolehte hoolikalt, sest siin on teile vajalikku teavet. Ehkki seda ravimit on võimalik

Rohkem

EE - EP B1 Kinaasi inhibiitorid TEHNIKA TASE p38 kinaas on mitogeen-aktiveeritud valgu (MAP) kinaas, mis kuulub seriin- /treon

EE - EP B1 Kinaasi inhibiitorid TEHNIKA TASE p38 kinaas on mitogeen-aktiveeritud valgu (MAP) kinaas, mis kuulub seriin- /treon Kinaasi inhibiitorid TEHNIKA TASE 1 2 30 p38 kinaas on mitogeen-aktiveeritud valgu (MAP) kinaas, mis kuulub seriin- /treoniin-kinaasi ülemperekonda. See kinaas aktiveeritakse ekstratsellulaarsete stressitekitajate,

Rohkem

HÜPER IGM SÜNDROOM Publikatsioon oli võimalik tänu CSL Behring üldisele koolitusgrantile

HÜPER IGM SÜNDROOM Publikatsioon oli võimalik tänu CSL Behring üldisele koolitusgrantile HÜPER IGM SÜNDROOM Publikatsioon oli võimalik tänu CSL Behring üldisele koolitusgrantile HÜPER IGM SÜNDROOM See brosüür on ette nähtud patsientidele ja nende perekondadele ja ei asenda kliinilise immunoloogi

Rohkem

Traneksaam_ortopeedias

Traneksaam_ortopeedias Traneksaamhape kasutamine Juri Karjagin Tartu Ülikool Tartu Ülikooli Kliinikum Plaan Fibrinolüüsist Traneksaamhape farmakoloogiast Traneksaamhape uuringud Plaaniline kirurgia Erakorraline trauma Toopiline

Rohkem

Suunised Euroopa turu infrastruktuuri määruse (EMIR) kohaste kesksetele vastaspooltele suunatud protsüklilisusvastaste tagatismeetmete kohta 15/04/201

Suunised Euroopa turu infrastruktuuri määruse (EMIR) kohaste kesksetele vastaspooltele suunatud protsüklilisusvastaste tagatismeetmete kohta 15/04/201 Suunised Euroopa turu infrastruktuuri määruse (EMIR) kohaste kesksetele vastaspooltele suunatud protsüklilisusvastaste tagatismeetmete kohta 15/04/2019 ESMA70-151-1496 ET Sisukord I. Reguleerimisala...

Rohkem

Microsoft PowerPoint - Inhalatsioonanesteetikud lasteanesteesias2 [Compatibility Mode]

Microsoft PowerPoint - Inhalatsioonanesteetikud lasteanesteesias2 [Compatibility Mode] Inhalatsioonanesteetikud lasteanesteesias Reet Kitus 28 mai 2010 2 osapoolt: Patsient (lapsevanem) Anestesioloog Ohutu Kiire toimega Võimalikult vähe kõrvaltoimeid 1 Lapsevanemate eelistused mida vältida?

Rohkem

Microsoft Word - Document in Unnamed

Microsoft Word - Document in Unnamed RAVIMI OMADUSTE KOKKUVÕTE 1. RAVIMPREPARAADI NIMETUS Duphalac Fruit 667 mg/ml, suukaudne lahus 2. KVALITATIIVNE JA KVANTITATIIVNE KOOSTIS Duphalac Fruit suukaudne lahus sisaldab 667 mg laktuloosi 1 ml

Rohkem

lvk04lah.dvi

lvk04lah.dvi Lahtine matemaatikaülesannete lahendamise võistlus. veebruaril 004. a. Lahendused ja vastused Noorem rühm 1. Vastus: a) jah; b) ei. Lahendus 1. a) Kuna (3m+k) 3 7m 3 +7m k+9mk +k 3 3M +k 3 ning 0 3 0,

Rohkem

(Estonian) DM-RBCS Edasimüüja juhend MAANTEE MTB Rändamine City Touring/ Comfort Bike URBAN SPORT E-BIKE Kasseti ketiratas CS-HG400-9 CS-HG50-8

(Estonian) DM-RBCS Edasimüüja juhend MAANTEE MTB Rändamine City Touring/ Comfort Bike URBAN SPORT E-BIKE Kasseti ketiratas CS-HG400-9 CS-HG50-8 (Estonian) DM-RBCS001-02 Edasimüüja juhend MAANTEE MTB Rändamine City Touring/ Comfort Bike URBAN SPORT E-BIKE Kasseti ketiratas CS-HG400-9 CS-HG50-8 SISUKORD OLULINE MÄRKUS... 3 OHUTUSE TAGAMINE... 4

Rohkem

TÄISKASVANUTE UNEHÄIRETE ESMANE DIAGNOSTIKA JA RAVI TÖÖRÜHMA JA SEKRETARIAADI TÖÖKOOSOLEKU PROTOKOLL nr. 6 Kuupäev 8. november 2017 Koht Eesti Haigeka

TÄISKASVANUTE UNEHÄIRETE ESMANE DIAGNOSTIKA JA RAVI TÖÖRÜHMA JA SEKRETARIAADI TÖÖKOOSOLEKU PROTOKOLL nr. 6 Kuupäev 8. november 2017 Koht Eesti Haigeka TÄISKASVANUTE UNEHÄIRETE ESMANE DIAGNOSTIKA JA RAVI TÖÖRÜHMA JA SEKRETARIAADI TÖÖKOOSOLEKU PROTOKOLL nr. 6 Kuupäev 8. november 2017 Koht Eesti Haigekassa, Lastekodu 48, Tallinn Algus Lõpp kl 12.00 kl 16.00

Rohkem

IX klass

IX klass Keemia IX klassile Näidistöökava Õpik (Õ): Lembi Tamm, Heiki Timotheus Keemia õpik IX klassile, Avita, 2013 Töövihik (TV): Kontrolltööd (KT): Lembi Tamm, Eevi Viirsalu Keemia töövihik IX klassile I osa,

Rohkem

Sotsiaalministri 17. septembri a määrus nr 53 Tervise infosüsteemi edastatavate dokumentide andmekoosseisud ning nende säilitamise tingimused ja

Sotsiaalministri 17. septembri a määrus nr 53 Tervise infosüsteemi edastatavate dokumentide andmekoosseisud ning nende säilitamise tingimused ja Sotsiaalministri 17. septembri 2008. a määrus nr 53 Tervise infosüsteemi edastatavate dokumentide andmekoosseisud ning nende säilitamise tingimused ja kord Lisa 2 Statsionaarse epikriisi andmekoosseis

Rohkem

Markina

Markina EUROOPA NOORTE ALKOHOLITARBIMISE PREVENTSIOONI PRAKTIKAD JA SEKKUMISED Anna Markina Tartu Ülikool Meie ülesanne on: Tuvastada ja välja valida erinevaid programme ja sekkumist, mida on hinnatud ja mille

Rohkem

EE-EP B LEIUTISE EELDUS Käesolev leiutis käsitleb 5H-benso[4,5]tsüklohepta[1,2-b]püridiinühendeid, mis on türosiinkinaasid

EE-EP B LEIUTISE EELDUS Käesolev leiutis käsitleb 5H-benso[4,5]tsüklohepta[1,2-b]püridiinühendeid, mis on türosiinkinaasid 1 2 LEIUTISE EELDUS Käesolev leiutis käsitleb H-benso[4,]tsüklohepta[1,2-b]püridiinühendeid, mis on türosiinkinaaside inhibiitoriteks, konkreetselt retseptortürosiinkinaasi MET inhibiitoriteks ja on kasulikud

Rohkem

KAASAV ELU RÜHM “TAKTIILNE“

KAASAV ELU RÜHM “TAKTIILNE“ KAASAV ELU RÜHM HEV ÕPPEVAHEND 17.05.2018 Grupp: Terje Isok Gerli Mikk Veronika Vahi, Merit Roosna, Tallinna Tervishoiu Kõrgkool Juhendajad: Jana Kadastik ja Tiia Artla PROJEKTI EESMÄRK Luua õppetööd

Rohkem

Microsoft Word - Document in Unnamed

Microsoft Word - Document in Unnamed Pakendi infoleht: informatsioon kasutajale Duphalac 667 mg/ml suukaudne lahus Lactulosum Enne ravimi võtmist lugege hoolikalt infolehte, sest siin on teile vajalikku teavet. Võtke seda ravimit alati täpselt

Rohkem

_JAN_EMEA_PATIENT CLL GUIDE_AW0_17 EST A5.indd

_JAN_EMEA_PATIENT CLL GUIDE_AW0_17 EST A5.indd KLL Juhend patsiendile Krooniline lümfotsüütleukeemia Janssen Pharmaceutica NV. 2017 PHEE/IBR/0917/0002 Sissejuhatus Mis on KLL? Tõenäoliselt on ehmatav kuulda esmakordselt oma diagnoosi krooniline lümfotsüütleukeemia

Rohkem

HIV-nakkuse levik Eestis ETTEKANNE KOOLITUSEL INIMKAUBANDUSE ENNETAMINE- KOOLITUS ÕPETAJATELE NOORSOOTÖÖTAJATELE JA KUTSENÕUSTAJATELE Sirle Blumberg A

HIV-nakkuse levik Eestis ETTEKANNE KOOLITUSEL INIMKAUBANDUSE ENNETAMINE- KOOLITUS ÕPETAJATELE NOORSOOTÖÖTAJATELE JA KUTSENÕUSTAJATELE Sirle Blumberg A HIV-nakkuse levik Eestis ETTEKANNE KOOLITUSEL INIMKAUBANDUSE ENNETAMINE- KOOLITUS ÕPETAJATELE NOORSOOTÖÖTAJATELE JA KUTSENÕUSTAJATELE Sirle Blumberg AIDS-i Ennetuskeskus HIV-nakkuse olukorra analüüs. Ohustatud

Rohkem

A Peet Üldiseid fakte diabeedi tekkemehhanismide kohta \(sealhulgas lühiülevaade

A Peet Üldiseid fakte diabeedi tekkemehhanismide kohta \(sealhulgas lühiülevaade Suhkurtõve esinemissagedus lastel Diabeedi tekkepõhjused Aleksandr Peet SA TÜK Lastekliinik Suhkruhaiguse tüübid 1. tüüpi suhkruhaigus (T1D) Eestis 99,9% juhtudest kõhunääre ei tooda insuliini 2. tüüpi

Rohkem

Õnn ja haridus

Õnn ja haridus Prof. Margit Sutrop Tartu Ülikooli eetikakeskuse juhataja Õpetajate Liidu konverents Viimsis, 24. oktoobril 2012 Õnn tähendab elada head elu. Hea elu teooria seab 2 tingimust: Inimene on subjektiivselt

Rohkem

TARTU ÜLIKOOL LOODUS- JA TEHNOLOOGIATEADUSKOND MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT ARENGUBIOLOOGIA ÕPPETOOL Laura Truu Wfs1 ja Grp94 ekspressiooni

TARTU ÜLIKOOL LOODUS- JA TEHNOLOOGIATEADUSKOND MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT ARENGUBIOLOOGIA ÕPPETOOL Laura Truu Wfs1 ja Grp94 ekspressiooni TARTU ÜLIKOOL LOODUS- JA TEHNOLOOGIATEADUSKOND MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT ARENGUBIOLOOGIA ÕPPETOOL Laura Truu Wfs1 ja Grp94 ekspressiooni sõltuvus glükoosi tasemest ja NMDA retseptori inhibeerimisest

Rohkem

Dr Maire Kuddu - Keda ohustab pea ja kaelapiirkonna vähk

Dr Maire Kuddu - Keda ohustab pea ja kaelapiirkonna vähk Keda ohustab pea ja kaela piirkonna vähk? Maire Kuddu Põhja-Eesti Regionaalhaigla Onkoloogia-hematoloogia kliinik kiiritusravi keskus 12.10.2015 Pea ja kaela pahaloomulised kasvajad (PKK) Maailmas > 650,000

Rohkem

Microsoft PowerPoint - loeng2.pptx

Microsoft PowerPoint - loeng2.pptx Kirjeldavad statistikud ja graafikud pidevatele tunnustele Krista Fischer Pidevad tunnused ja nende kirjeldamine Pidevaid (tihti ka diskreetseid) tunnuseid iseloomustatakse tavaliselt kirjeldavate statistikute

Rohkem

Väljaandja: Vabariigi Valitsus Akti liik: määrus Teksti liik: algtekst-terviktekst Redaktsiooni jõustumise kp: Redaktsiooni kehtivuse lõpp:

Väljaandja: Vabariigi Valitsus Akti liik: määrus Teksti liik: algtekst-terviktekst Redaktsiooni jõustumise kp: Redaktsiooni kehtivuse lõpp: Väljaandja: Vabariigi Valitsus Akti liik: määrus Teksti liik: algtekst-terviktekst Redaktsiooni jõustumise kp: 01.06.2002 Redaktsiooni kehtivuse lõpp: 22.06.2002 Avaldamismärge: RT I 2000, 49, 314 Meditsiinilisel

Rohkem

Microsoft PowerPoint - TallinnLV ppt4.ppt

Microsoft PowerPoint - TallinnLV ppt4.ppt Pneumokokknakkuse esinemine ja immuunprofülaktika Eestis Tervisekaitseinspektsioon Streptococcus pneumoniae avastatud 1881. aastal (dr.george Miller Sternberg ning keemik ja mikrobioloog Louis Pasteur)

Rohkem

PowerPoint Presentation

PowerPoint Presentation Loote kasvupeetuse diagnostika Tiina Angerjas AS ITK Naistekliinik Mis on kasvupeetus (KP)? Loode ei saa saavutada oma geneetiliselt determineeritud potentsiaalset kaalu KP esineb kuni 10% populatsioonist

Rohkem

TÄISKASVANUTE UNEHÄIRETE ESMANE DIAGNOSTIKA JA RAVI TÖÖRÜHMA JA SEKRETARIAADI TÖÖKOOSOLEKU PROTOKOLL nr. 10 Kuupäev 2. mai 2018 Koht Dorpati konverent

TÄISKASVANUTE UNEHÄIRETE ESMANE DIAGNOSTIKA JA RAVI TÖÖRÜHMA JA SEKRETARIAADI TÖÖKOOSOLEKU PROTOKOLL nr. 10 Kuupäev 2. mai 2018 Koht Dorpati konverent TÄISKASVANUTE UNEHÄIRETE ESMANE DIAGNOSTIKA JA RAVI TÖÖRÜHMA JA SEKRETARIAADI TÖÖKOOSOLEKU PROTOKOLL nr. 10 Kuupäev 2. mai 2018 Koht Dorpati konverentsikeskuse Parrot saal, Tartu Algus Lõpp kl 14.15 kl

Rohkem

1

1 IDA-TALLINNA KESKHAIGLA Statsionaarsete patsientide rahulolu uuring 13 13 Sisukord 1. Uuringu läbiviimise metoodika... 2 2. Andmete analüüs... 2 3. Uuringu valim... 3 3.1. Vastanute iseloomustus: sugu,

Rohkem

PowerPoint Presentation

PowerPoint Presentation Ära löö last- ka sõnadega Anne Kleinberg MD, PhD TLH Psühhiaatriakliiniku juhataja 20.11.2015 Sissejuhatus Vanemlikkus Vägivalla liigid Verbaalse vägivalla mõiste ja variandid Verbaalse vägivalla mõju

Rohkem

Microsoft Word - Document in Unnamed

Microsoft Word - Document in Unnamed Pakendi infoleht: teave kasutajale Octenisept 1 mg/ 20 mg/ml, nahalahus Oktenidiindivesinikkloriid Fenoksüetanool Enne ravimi kasutamist lugege hoolikalt infolehte, sest siin on teile vajalikku teavet.

Rohkem

PowerPointi esitlus

PowerPointi esitlus Konverents Terve iga hinna eest, 07.03.2013 Tervis ja haigus muutuvas maailmas Andres Soosaar Mis on meditsiin? Meditsiin on pikka aega olnud ruum, mille koordinaattelgedeks on tervise-haiguse eristus

Rohkem

liigtarvitamine_A5.indd

liigtarvitamine_A5.indd ALKOHOLI LIIGTARVITAMINE MIS SEE ON JA KUST SAAB ABI Hoiad käes vihikut, mis räägib alkoholi liigtarvitamisest. Seda lugedes saad ülevaate sellest, mis on alkoholi liigtarvitamine, mida tähendab alkoholitarvitamise

Rohkem

EUROOPA KOMISJON Brüssel, COM(2018) 284 final ANNEXES 1 to 2 LISAD järgmise dokumendi juurde: Ettepanek: Euroopa Parlamendi ja nõukogu määru

EUROOPA KOMISJON Brüssel, COM(2018) 284 final ANNEXES 1 to 2 LISAD järgmise dokumendi juurde: Ettepanek: Euroopa Parlamendi ja nõukogu määru EUROOPA KOMISJON Brüssel, 17.5.2018 COM(2018) 284 final ANNEXES 1 to 2 LISAD järgmise dokumendi juurde: Ettepanek: Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrus, millega kehtestatakse uute raskeveokite CO2-heite

Rohkem

Kliinilise keemia uuringud, südamemarkerite uuringud lapsed Kompleksanalüüsi nimetus Analüüsi nimetus Lühend Referentsväärtused Vanus Sugu

Kliinilise keemia uuringud, südamemarkerite uuringud lapsed Kompleksanalüüsi nimetus Analüüsi nimetus Lühend Referentsväärtused Vanus Sugu Kliinilise keemia uuringud, südamemarkerite uuringud lapsed Analüüsi Alaniini aminotransferaas plasmas P-ALAT 7 17 a M/N < 37 U/L 1 6 a M/N < 29 U/L < 1 a M/N < 56 U/L Albumiin plasmas P-Alb 15 18 a M/N

Rohkem

Praks 1

Praks 1 Biomeetria praks 6 Illustreeritud (mittetäielik) tööjuhend Eeltöö 1. Avage MS Excel is ankeedivastuseid sisaldav andmestik, 2. lisage uus tööleht, nimetage see ümber leheküljeks Praks6 ja 3. kopeerige

Rohkem

Pealkiri

Pealkiri Keelelist arengut toetavad FREPY mängud Reili Argus Luksemburgi keelepäev 2015 Taustaks Grammatika omandamisest On rikka ja vaese vormimoodustusega keeli. Mida rikkam vormimoodustus, seda varem hakkab

Rohkem

Microsoft Word - Document in Unnamed

Microsoft Word - Document in Unnamed RAVIMI OMADUSTE KOKKUVÕTE 1. VETERINAARRAVIMI NIMETUS Parofor, 140 mg/ml lahus joogivees, piimas või piimaasendajas manustamiseks sigadele ja vatsaseede eelsel perioodil vasikatele 2. KVALITATIIVNE JA

Rohkem

KEYTRUDA (pembrolizumab) teatmik Teave patsiendile Teave patsiendile Käesoleva ravimi suhtes kohaldatakse täiendavat järelevalvet, mis võimaldab kiire

KEYTRUDA (pembrolizumab) teatmik Teave patsiendile Teave patsiendile Käesoleva ravimi suhtes kohaldatakse täiendavat järelevalvet, mis võimaldab kiire KEYTRUDA (pembrolizumab) teatmik Teave patsiendile Teave patsiendile Käesoleva ravimi suhtes kohaldatakse täiendavat järelevalvet, mis võimaldab kiiresti tuvastada uut ohutusteavet. Te saate sellele kaasa

Rohkem

raamat5_2013.pdf

raamat5_2013.pdf Peatükk 5 Prognoosiintervall ja Usaldusintervall 5.1 Prognoosiintervall Unustame hetkeks populatsiooni parameetrite hindamise ja pöördume tagasi üksikvaatluste juurde. On raske ennustada, milline on huvipakkuva

Rohkem

Solaariumisalongides UVseadmete kiiritustiheduse mõõtmine. Tallinn 2017

Solaariumisalongides UVseadmete kiiritustiheduse mõõtmine. Tallinn 2017 Solaariumisalongides UVseadmete kiiritustiheduse mõõtmine. Tallinn 2017 1. Sissejuhatus Solaariumides antakse päevitusseansse kunstliku ultraviolettkiirgusseadme (UV-seadme) abil. Ultraviolettkiirgus on

Rohkem

Microsoft Word - Errata_Andmebaaside_projekteerimine_2013_06

Microsoft Word - Errata_Andmebaaside_projekteerimine_2013_06 Andmebaaside projekteerimine Erki Eessaar Esimene trükk Teadaolevate vigade nimekiri seisuga 24. juuni 2013 Lehekülg 37 (viimane lõik, teine lause). Korrektne lause on järgnev. Üheks tänapäeva infosüsteemide

Rohkem

R4BP 3 Print out

R4BP 3 Print out Biotsiidi omaduste kokkuvõte Biotsiidi nimi: Dismate PE Biotsiidi liik (liigid): Tooteliik 9 - Repellendid ja atraktandid (kahjuritõrje) Loa number: UK-06-08 Biotsiidiregistri (R4BP 3) kande viitenumber:

Rohkem

VL1_praks6_2010k

VL1_praks6_2010k Biomeetria praks 6 Illustreeritud (mittetäielik) tööjuhend Eeltöö 1. Avage MS Excel is oma kursuse ankeedivastuseid sisaldav andmestik, 2. lisage uus tööleht (Insert / Lisa -> Worksheet / Tööleht), nimetage

Rohkem

Antennide vastastikune takistus

Antennide vastastikune takistus Antennide vastastikune takistus Eelmises peatükis leidsime antenni kiirgustakistuse arvestamata antenni lähedal teisi objekte. Teised objektid, näiteks teised antennielemendid, võivad aga mõjutada antenni

Rohkem

CML and Fertility Leaflet EE

CML and Fertility Leaflet EE VILJAKUS, PERE- PLANEERIMINE JA NOOR TÄISKASVANU MILLEGA TULEB ARVESTADA ENNE PEREKONNA LOOMIST? 2 KUI MA OLEN KMLi DIAGNOOSIGA MEES, SIIS KAS PEAKSIN SEOSES LAPSE EOSTAMISEGA MILLEGI PÄRAST MURET TUNDMA?

Rohkem

EE - EP B1 IL-17A ja IL-17F antagonistid ja meetodid nende kasutamiseks TEHNIKA TASE Tsütokiinid on väikesed lahustuvad proteiini

EE - EP B1 IL-17A ja IL-17F antagonistid ja meetodid nende kasutamiseks TEHNIKA TASE Tsütokiinid on väikesed lahustuvad proteiini EE - EP1931697 B1 IL-17A ja IL-17F antagonistid ja meetodid nende kasutamiseks TEHNIKA TASE 5 10 15 20 25 Tsütokiinid on väikesed lahustuvad proteiinid, mis vahendavad erinevaid bioloogilisi toimeid, muu

Rohkem

INIMESEÕPETUSE AINEKAVA ABJA GÜMNAASIUMIS Klass: 10. klass (35. tundi) Kursus: Perekonnaõpetus Perekond Õpitulemused: Kursuse lõpus õpilane: 1) mõista

INIMESEÕPETUSE AINEKAVA ABJA GÜMNAASIUMIS Klass: 10. klass (35. tundi) Kursus: Perekonnaõpetus Perekond Õpitulemused: Kursuse lõpus õpilane: 1) mõista INIMESEÕPETUSE AINEKAVA ABJA GÜMNAASIUMIS Klass: 10. klass (35. tundi) Kursus: Perekonnaõpetus Perekond : 1) mõistab, kuidas ühiskonnas toimuvad muutused avaldavad mõju perekonna ja peresuhetega seotud

Rohkem

Sissejuhatus GRADE metoodikasse

Sissejuhatus GRADE metoodikasse Sissejuhatus GRADE metoodikasse Eriline tänu: Holger Schünemann ja GRADE working group www.gradeworkinggroup.org Kaja-Triin Laisaar TÜ peremeditsiini ja rahvatervishoiu instituut kaja-triin.laisaar@ut.ee

Rohkem

Microsoft Word - SANCO ET-TRA-00.DOC

Microsoft Word - SANCO ET-TRA-00.DOC EUROOPA KOMISJON TERVISHOIU JA TARBIJAKAITSE PEADIREKTORAAT Direktoraat C Rahvatervis ja riskianalüüs C2 Tervishoiualane teave AVALIK ARUTELU HARULDASED HAIGUSED: EUROOPA EES SEISVAD VÄLJAKUTSED Käesolev

Rohkem

Microsoft PowerPoint - Kliiniliste auditite kogemused [Read-Only] [Compatibility Mode]

Microsoft PowerPoint - Kliiniliste auditite kogemused [Read-Only] [Compatibility Mode] Anneli Rätsep TÜ Peremeditsiini õppetool vanemteadur 25.04.2013 Alates 2002. aastast "Haigete ravi pikkuse põhjendatus sisehaiguste profiiliga osakondades 3-5 auditit aastas Müokardiinfarkti haige käsitlus

Rohkem

Pintsli otsade juurde tegemine Esiteks Looge pilt suurusega 64x64 ja tema taustaks olgu läbipaistev kiht (Transparent). Teiseks Minge kihtide (Layers)

Pintsli otsade juurde tegemine Esiteks Looge pilt suurusega 64x64 ja tema taustaks olgu läbipaistev kiht (Transparent). Teiseks Minge kihtide (Layers) Pintsli otsade juurde tegemine Esiteks Looge pilt suurusega 64x64 ja tema taustaks olgu läbipaistev kiht (Transparent). Teiseks Minge kihtide (Layers) aknasse ja looge kaks läbipaistvat kihti juurde. Pange

Rohkem

Kuidas hoida tervist töökohal?

Kuidas hoida tervist töökohal? Kuidas hoida tervist töökohal? Kristjan Port, TLU 25.04.2017 Tööinspektsiooni konverents Kas aeg tapab?. Mis on tervis? Teadmatus võib olla ratsionaalne. On olukordi milles teadmiste hankimise kulud ületavad

Rohkem

SUUNISED, MIS KÄSITLEVAD SELLISEID TESTE, LÄBIVAATAMISI VÕI TEGEVUSI, MIS VÕIVAD VIIA TOETUSMEETMETE RAKENDAMISENI EBA/GL/2014/ september 2014 S

SUUNISED, MIS KÄSITLEVAD SELLISEID TESTE, LÄBIVAATAMISI VÕI TEGEVUSI, MIS VÕIVAD VIIA TOETUSMEETMETE RAKENDAMISENI EBA/GL/2014/ september 2014 S EBA/GL/2014/09 22. september 2014 Suunised, mis käsitlevad selliseid teste, läbivaatamisi või tegevusi, mis võivad viia pankade finantsseisundi taastamise ja kriisilahenduse direktiivi artikli 32 lõike

Rohkem

MergedFile

MergedFile Hill s kampaaniad, kevad 2019 METABOLIC+URINARY (kaal+kuseteedele) HILLS PD KOERA TÄISSÖÖT METAB.URINARY 2KG -50% hind = 8,29 (aegumine 31.05.19) HILLS PD KOERA TÄISSÖÖT METAB.URINARY 12KG -50% hind =

Rohkem

Microsoft Word - Document in Unnamed

Microsoft Word - Document in Unnamed RAVIMI OMADUSTE KOKKUVÕTE 1. RAVIMPREPARAADI NIMETUS Lamisil Uno, 1% nahalahus 2. KVALITATIIVNE JA KVANTITATIIVNE KOOSTIS 1 gramm nahalahust sisaldab 10 mg terbinafiini (vesinikkloriidina). INN. Terbinafinum

Rohkem

DVD_8_Klasteranalüüs

DVD_8_Klasteranalüüs Kursus: Mitmemõõtmeline statistika Seminar IX: Objektide grupeerimine hierarhiline klasteranalüüs Õppejõud: Katrin Niglas PhD, dotsent informaatika instituut Objektide grupeerimine Eesmärk (ehk miks objekte

Rohkem

Microsoft Word - Document in Unnamed

Microsoft Word - Document in Unnamed RAVIMI OMADUSTE KOKKUVÕTE 1. RAVIMPREPARAADI NIMETUS Betaserc 8 mg tabletid Betaserc 16 mg tabletid Betaserc 24 mg tabletid 2. KVALITATIIVNE JA KVANTITATIIVNE KOOSTIS Tablett sisaldab 8, 16 või 24 mg beetahistiindivesinikkloriidi.

Rohkem

M16 Final Decision_Recalculation of MTR for EMT

M16 Final Decision_Recalculation of MTR for EMT 1 OTSUS Tallinn 22.juuni 2007 J.1-45/07/7 Mobiiltelefonivõrgus häälkõne lõpetamise hinnakohustuse kehtestamine AS EMT- le Sideameti 21. märtsi 2006. a otsusega nr J.1-50/06/2 tunnistati AS EMT (edaspidi

Rohkem

Microsoft Word - Document in Unnamed

Microsoft Word - Document in Unnamed Pakendi infoleht: teave kasutajale Pregnyl, 5000 RÜ/ml süstelahuse pulber ja lahusti Inimese kooriongonadotropiin Enne ravimi kasutamist lugege hoolikalt infolehte, sest siin on teile vajalikku teavet.

Rohkem

Sepsise ravijuhend

Sepsise ravijuhend Ravijuhendi Sepsise ja septilise šoki esmane diagnostika ja ravi koosoleku protokoll nr 3 Kuupäev Koht Osalesid Puudusid Juhataja 12.mai 2017, 12.00-15.00 Tartu, Ravila 19, ruum 1038 Joel Starkopf (juht),

Rohkem

Monitooring

Monitooring IT infrastruktuuri teenused Monitooring Margus Ernits margus.ernits@itcollege.ee 1 Miks? Arvutisüsteemid töötavad tõrgetega Pole olemas 100% veakindlaid ja keerulisi arvutisüsteeme Tõrgetest võib teada

Rohkem

Tobramycin Art 29(4)

Tobramycin Art 29(4) II lisa Teaduslikud järeldused ja positiivse arvamuse alused 3 Teaduslikud järeldused Tobramycin VVB ja sarnaste nimetuste (vt I lisa) teadusliku hindamise üldkokkuvõte Sissejuhatus UAB VVB esitas 2. mail

Rohkem

Kuidas, kus ja milleks me kujundame poliitikaid Kuidas mõjutavad meid poliitikad ja instrumendid Euroopa Liidu ja riigi tasandil Heli Laarmann Sotsiaa

Kuidas, kus ja milleks me kujundame poliitikaid Kuidas mõjutavad meid poliitikad ja instrumendid Euroopa Liidu ja riigi tasandil Heli Laarmann Sotsiaa Kuidas, kus ja milleks me kujundame poliitikaid Kuidas mõjutavad meid poliitikad ja instrumendid Euroopa Liidu ja riigi tasandil Heli Laarmann Sotsiaalministeerium Rahvatervise osakond 15.06.2018 Mis on

Rohkem

ISIKSUSEHÄIRED DRAAMA- KUNINGANNA EHK ELU NAGU TEATRIS MILLINE ON HISTRIOONILINE ISIKSUS? 42 Psühholoogia Sinule

ISIKSUSEHÄIRED DRAAMA- KUNINGANNA EHK ELU NAGU TEATRIS MILLINE ON HISTRIOONILINE ISIKSUS? 42 Psühholoogia Sinule ISIKSUSEHÄIRED DRAAMA- KUNINGANNA EHK ELU NAGU TEATRIS MILLINE ON HISTRIOONILINE ISIKSUS? 42 Psühholoogia Sinule 1 2017 Ivi Niinep on psühholoog Idüllilise Muhu kaluritalu õuele veereb ühel heal suvepäeval

Rohkem

Millest mõtleb depressioon (ja kuidas temast aru saada?) Maarja-Liisa Oitsalu kliiniline psühholoog

Millest mõtleb depressioon (ja kuidas temast aru saada?) Maarja-Liisa Oitsalu kliiniline psühholoog Millest mõtleb depressioon (ja kuidas temast aru saada?) Maarja-Liisa Oitsalu kliiniline psühholoog Ma olen mõttetu Jälle ma ebaõnnestusin! See ülesanne ei tulnud mul hästi välja Küll ma olen vahest saamatu!

Rohkem

IDA-TALLINNA KESKHAIGLA Statsionaarsete patsientide rahulolu uuring

IDA-TALLINNA KESKHAIGLA Statsionaarsete patsientide rahulolu uuring IDA-TALLINNA KESKHAIGLA Statsionaarsete patsientide rahulolu uuring 2015 2015 Sisukord: Statsionaarsete patsientide rahulolu uuring 2015... 1 1. Uuringu läbiviimise metoodika... 3 2. Andmete analüüs...

Rohkem

Praks 1

Praks 1 Biomeetria praks 6 Illustreeritud (mittetäielik) tööjuhend Eeltöö 1. Avage MS Excel is oma kursuse ankeedivastuseid sisaldav andmestik, 2. lisage uus tööleht, nimetage see ümber leheküljeks Praks6 ja 3.

Rohkem

Myofunctional Disorders in Clinical Speech Therapy and Voice Care Setting

Myofunctional Disorders in Clinical Speech Therapy and Voice Care Setting Näo- ja lõualuude piirkonna funktsioonianomaaliad - meeskonnatöö Lagle Lehes SA TÜK Kõrvakliinik OÜ Ortodontiakeskus Tallinn 2016 Mis on müofunktsionaalsed puuded? Suu-näopiirkonna välimiste (miimilised

Rohkem

ITK ettekande põhi

ITK ettekande põhi Kodade virvendusarütmia antitrombootiline ravi Heli Kaljusaar 2009 NB! Loeng on autori omand ja kaitstud autoriõiguse seadusega. Loengut võite kasutada isiklikukeks vajadusteks. Loengu reprodutseerimisel

Rohkem