Microsoft Word - Naturalia_hunt_aruanne.doc

Väljavõte

1 METSAKAITSE- JA METSAUUENDUSKESKUS MTÜ NATURALIA TÖÖVÕTULEPINGU NR 2-24/TRT-12, 31.MÄRTS 2008 ARUANNE GENEETILISTE MEETODITE KASUTAMINE EESTI HUNDIPOPULATSIOONI DEMOGRAAFILISTES UURINGUTES VASTUTAV TÄITJA: URMAS SAARMA UURING ON FINANTSEERITUD SA KESKKONNAINVESTEERINGUTE KESKUSE POOLT TARTU, 30. MÄRTS 2009

2 Sissejuhatus Hunt on tippkiskjana oluline nii oma saakloomade arvukuse ühe reguleerijana kui ka vektorina erinevate patogeenide, sealhulgas marutaudi, kärntõve ja mitmete parasiitide levitajana (sealhulgas ehinokokk-paeluss Echinococcus sp.). Lisaks on hundid läbi aegade murdnud kariloomi ja rünnanud ka inimesi, mis on teinud neist inimese silmis kõige kardetuma kiskja paljudes regioonides, sh. ka Eestis. Kuna hunt on oluline liik nii inimese kui ka kodu- ja metsloomade seisukohast, siis on äärmiselt oluline teada, kuidas on hundipopulatsioonid struktureeritud ja kui ulatuslikult toimib geenisiire võimalike alampopulatsioonide vahel ning milline on geenisiirde ulatus. Need teadmised võimaldaksid meil hinnata lähitulevikus näiteks erinevate haigustekitajate, eelkõige marutõve potentsiaalset levikut Venemaalt (kus metsloomade marutõvevastast vaktsineerimist ei toimu) Eestisse ja Lätisse (mõlemad riigid on hetkel juba pea marutõvevabad, kuid loomade ränded Venemaalt võivad siiski tekitada uusi puhanguid). Põhja-Euroopa hundipopulatsiooni struktuur on seni teadmata, st. puudub informatsioon võimalike alampopulatsioonide olemasolu kohta ja geenisiirdest Põhja-Euroopas. Hundipopulatsioon on küllalt põhjalikult uuritud Soomes (Aspi jt. 2006), kuid teised Põhja-Euroopa populatsioonid on analüüsimata või vaid osaliselt analüüsitud (sh. ka Eesti hundid). Oletatakse, et Soome ja Venemaa Karjala osa hundid moodustavad ühtse populatsiooni (Pulliainen 1965, 1980; Boitani 2003), kuid seosed Põhja-Euroopa hundipopulatsioonis tervikuna on tuvastamata. Töö eesmärk Selle uurimuse kaugemaks eesmärgiks on välja selgitada hundipopulatsiooni struktuur Põhja-Euroopas, jaotus alampopulatsioonideks ja geneetilisteks gruppideks ning geenisiirde olemasolu, intensiivsus ja ulatus alampopulatsioonide vahel, kasutades selleks mikrosatelliitanalüüsi. Projekt on planeeritud pikaajalisena ja projekti laiemaks eesmärgiks on välja selgitada: 1) alampopulatsioonide e. geneetiliselt eristuvate gruppide olemasolu ja geenisiire Põhja- Euroopas 2) hundipopulatsiooni sees aja jooksul toimuvad muutused e. dünaamika Põhja-Euroopas Käesoleva projekti konkreetne eemärk oli selgitada hundi geneetiliste gruppide esinemine Eestis ja Lätis. 2

3 Materjal ja meetodid Hundiproovid Analüüsisime 135 hundilt saadud koeproovi kahest riigist: Eesti (85) ja Läti (50). Proovid on kogutud ajavahemikus Eesti alalt, mis on suurema proovide hulgaga esindatud, on proove kogutud kõikidest Mandri-Eesti maakondadest, samuti on proovide valimiga kaetud kogu Läti territoorium. Laboratoorsed meetodid Me ananlüüsisime 20 mikrosatelliitlookust: H200, H10, H17, H54, H79, H208, H209, H213, H250, H253, H466, H642, H130, VWF ning CPH2, CPH4, CPH8, C09.173, CPH12 ja CXX22. DNA eraldamine koeproovidest viidi läbi, kasutades Roche i High Pure PCR Template preparation Kit i. Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) segu koosnes järgnevatest komponentidest: 0,25 u Taq polümeraasi (Amplitaq Gold), 1 µl 10 X PCR puhver, 2 mm MgCl 2, 0,2 mm dntp, 3,3 pmol praimereid ning 20 ng DNA-d iga reaktsiooni kohta. PCR i reaktsioonitingimused olid järgnevad: 10 minutit 95 denaturatsiooni, 11 tsüklit 30 s 94 C, 30 s 58 C, 60 s 72 C (ühtlaselt alaneva seondumistemperatuuriga ( 0,5 C tsükli kohta) ning 28 tsüklit 30 s 94 C, 30 s 52 C, 60 s 72 C. Lõplik elongatsioon 10 minutit 72 C. Pärast PCR i segu lahjendati veega (5x lahjendus) ning segati lookused kolme kapillaari (lookused H200, H10, H17, H54, H79, H208, H209, lookused H213, H250, H253, H466, H642, H130, VWF ning lookused CPH2, CPH4, CPH8, C09.173, CPH12 ja CXX22). Kapillaari segati ka lookuste pikkuse identifitseerimiseks 0,25 µl The GeneScan 600 LIZ i. PCR produktid analüüsiti ABI PRISM 3100 sekveneerijal. Alleelipikkused identifitseeriti programmiga Genemapper v4.0. Statistilised meetodid Mikrosatelliitide statistiline analüüs viidi läbi programmiga FSTAT, millega saab välja arvutada, kui mitu alleeli oli iga lookuse kohta esindatud ja kui suur on Eesti ja Läti hundipopulatsiooni geneetiline mitmekesisus e. heterosügootsus. Programmiga BAPS 5.0 arvutati Bayesi statistikal põhinevalt võimalike alampopulatsioonide olemasolu e. hundipopulatsiooni geneetilist differentseerumist. 3

4 Tulemused Eesti ja Läti hundiproovidel (tabel 1) analüüsiti 20 mikrosatelliitlookuse variatsiooni, mille tulemusena saadi iga hundi jaoks alleelisageduste muster e. geneetiline pass. Saadud alleelijaotuste alusel arvutati välja kui mitu alleeli oli iga lookuse kohta esindatud ja iga lookuse kohta rehkendati ka selle geneetiline mitmekesisus e. heterosügootsus (tabel 2). Suurima alleeliarvuga lookused olid H213, H10, H54 ja H200 ning väikseimatega CXX22 ja CPH2. Kõigi lookuste heterosügootsus oli kõrge (kõrgeks loetakse heterosügootsust >0.7), v.a. lookus H17, CPH12 ja CXX22. Seega osutusid valitud lookused äärmiselt sobivateks ja kõrge heterosügootsuse tase ning suur alleelide arv näitavad ka Eesti ja Läti hundipopulatsioonide suurt geneetilist mitmekesisust, mis on eelduseks elujõulise populatsiooni pikaajaliseks püsimiseks. Populatsiooni diferentseerumise statistiline analüüsi tulemusena selgus, et Eestis ja Lätis on esindatud 5 geneetiliselt diferentseerunud populatsiooni, neist üks oli Eesti (grupp 4, Ida-Virumaalt) ja kaks Läti spetsiifilised (grupp 3 ja grupp 5 Kirde-Lätist) (joonis 1). Siin peab märkima, et tegemist on geneetiliselt diferentseerunud gruppidega, millised võivad omavahel vabalt seguneda. Ülejäänud kaks diferentseerunud geneetilist gruppi olid esindatud nii Eestis kui Lätis. See, et kaks populatsiooni olid esindatud nii Eestis kui Lätis pole üllatav, sest hundid on tuntud kui väga hea rändevõimega loomad, kes on vabalt võimelised rändama (ja paarituma) üle terve Eesti ja Läti. Tulemuste põhjal võib järeldada, et geneetiline grupp nr 1 on levinud kõige laialdasemalt: seda leidub nii Eestis kui ka Lätis, kuid teine mõlema riigi territooriumil esindatud grupp, grupp 2 on levinud peamiselt Eestis (vaid ühe isend Lätis, Eesti lõunapiiril on programm BAPS 5.0 paigutanud samasse geneetilisse gruppi). Väga selget huntide geneetiliste gruppide geograafilist jaotust Eestisiseselt ei eksisteeri, kuid huvi pakuvad geneetilised grupid 2 ja 4, mis on levinud ainult Eestis (grupp 4) või peamiselt Eestis (grupp 2) - nende geograafilise paiknemise alusel võib oletada, et Venemaalt toimub Eesti alale huntide sisseränne. Samas on Eesti (grupp 4) ja Läti (grupp 3 ja 5) spetsiifiliste geneetiliste gruppide olemasolu mõnevõrra üllatav, sest Eesti ja Läti vahel pole mingit geograafilist või selgelt eristuvat ökoloogilist barjääri, mis hundipopulatsioone lahus hoiaks. Grupp 5 tundub olevat vaid Läti-spetsiifiline, siiski on võimalik, et viimase geneetilise grupeeringu näol on tegemist Lätisse kaugemalt sisse rännanud huntide ja nende järeltulijatega (näiteks Venemaalt). Edasised analüüsid, kuhu tuleb lisaks Eesti ja Läti proovide jätkuvale 4

5 kogumisele ja analüüsimisele kaasata ka hundiproove Venemaalt, peaksid sellele küsimusele selgema vastuse andma. Eesti ja Venemaa huntide omavaheliste geenisiirete edaspidine uurimine oleks erakordselt oluline, seda eriti huntide abil Venemaalt nii Eestisse kui Lätisse levida võivate inimestele ja loomadele eluohtlike haiguste, sh. marutõve, tõttu. Seega tuleks jätkata proovide kogumist nii Eestist, aga kindlasti ka Lätist ja Venemaalt, et saada täpsemat ülevaadet hundigruppide jaotumisest ja omavahelistest suhetest neis riikides. Joonis 1. Erinevate geneetiliste hundigruppide esinemine Eesti ja Lätis. 5

6 Tabel 1. Analüüsitud huntide päritolu ja geneetiline grupp, kuhu nad kuuluvad (grupid on tähistatud vastavalt Joonis 1 gruppidele ja värvidele); sugu F emane, M isane Hunt nr Riik Kogumiskoht Kogumispaik Kogumisaeg Sugu 1 EST Ida-Virumaa Kuremäe F 2 EST Ida-Virumaa Oonurme F 3 EST Ida-Virumaa Avinurme M 4 EST Jõgevamaa Torma M 5 EST Jõgevamaa Laiuse M 6 EST Jõgevamaa Pikknurme F 7 EST Jõgevamaa Aidu M 8 EST Jõgevamaa Metsis M 9 EST Jõgevamaa Pikknurme M 10 EST Jõgevamaa Torma F 11 EST Jõgevamaa Kullavere M 12 EST Jõgevamaa Kullavere F 13 EST Jõgevamaa Torma M 14 EST Jõgevamaa Kullavere F 15 EST Jõgevamaa Laiuse M 16 EST Jõgevamaa Luua F 17 EST Jõgevamaa Palamuse M 18 EST Järvamaa Anna F 19 EST Järvamaa Imavere M 20 EST Järvamaa Anna F 21 EST Järvamaa Jäneda M 22 EST Järvamaa Kõrvemaa M 23 EST Läänemaa Lihula M 24 EST Läänemaa Lihula EST Läänemaa Linnamäe M 26 EST Läänemaa Piirsalu F 27 EST Läänemaa Linnamäe F 28 EST Lääne-Virumaa Anguse F 29 EST Põlvamaa Rasina F 30 EST Pärnumaa Koonga F 6

7 Hunt nr Riik Kogumiskoht Kogumispaik Kogumisaeg Sugu 31 EST Pärnumaa Nõmme M 32 EST Pärnumaa Nõmme M (juv) 33 EST Pärnumaa Tahkuranna M 34 EST Pärnumaa Kilingi- Nõmme F 35 EST Pärnumaa Halinga F 36 EST Pärnumaa Nõmme M 37 EST Pärnumaa Vändra M 38 EST Pärnumaa Nõmme M 39 EST Pärnumaa Vändra F 40 EST Pärnumaa Seliste F 41 EST Pärnumaa Pööravere M 42 EST Raplamaa Käru F 43 EST Tartumaa Puhja F 44 EST Tartumaa Kärevere M 45 EST Tartumaa Tammistu M 46 EST Tartumaa Alatskivi M 47 EST Tartumaa Tammistu F 48 EST Tartumaa Alatskivi F 49 EST Tartumaa Peipsiääre M 50 EST Tartumaa Saadjärve F 51 EST Viljandimaa Soomaa RP F 52 EST Viljandimaa Nuia M 53 EST Võrumaa jaan LAT Jekabpils mezr F 55 LAT Jekabpils mezr LAT Zagasti F 57 LAT Jekabpils F 58 LAT Gludige Alsunga F 59 LAT Gludige Alsunga F 60 LAT Piltene F 61 LAT Kuldiga VM Alsurga F 62 LAT Talsu VM Dundaga M 63 LAT Ventspils Ancesmežn F 7

8 Hunt nr Riik Kogumiskoht Kogumispaik Kogumisaeg Sugu 64 LAT Talsi F 65 LAT Talsi M 66 LAT Gulbene, Litene M 67 LAT Gen. Parangs. Valmiera Zunaras mrn F 68 LAT Staicele F 69 LAT Gen. Parangs. Anna m F 70 LAT Gen. Parangs. Anna m F 71 EST Ida-Viru Kurtna M 72 EST Läänemaa Piirsalu M 73 EST Läänemaa Piirsalu M 74 EST Läänemaa Kullamaa F 75 EST Läänemaa Taebla M 76 LAT 20km Eesti piirist F 77 EST I-Viru Kurtna F 78 EST I-Viru Avinurme M 79 EST I-Viru Kurtna F 80 EST Järva Alliku M 81 EST Jõgeva Kullavere F 82 EST I-Viru Lohusuu M 83 EST I-Viru Tammiku F 84 EST I-Viru Alajõe F 85 EST I-Viru Avinurme M 86 EST Pärnu K-Nõmme F 87 EST Põlva Rasina M 88 EST Lääne Nõva F 89 EST Pärnu K-Nõmme M 90 EST Pärnu K-Nõmme F 91 EST Pärnu K-Nõmme M 92 EST Lääne Tuudi F 93 EST Rapla Eidapere F 94 EST Pärnu Pööravere M 95 EST Pärnu Lõpe M 8

9 Hunt nr Riik Kogumiskoht Kogumispaik Kogumisaeg Sugu 96 EST L-Viru Simuna EST Pärnu Pärnjõe M 98 EST Tartu Vahelaane M 99 EST Põlva Rasina EST Lääne Linnamäe M 101 EST Pärnu Nõmme M 102 EST Pärnu Nõmme M 103 EST Tartu Luunja M 104 EST Tartu Luunja M 105 EST Tartu Luunja F 106 LAT Vandžene mežn E 107 LAT Tukuma m E 108 LAT Valdemarpils Gen. Parangs E 109 LAT Nereta Gen. Parangs E 110 LAT Stalte Gen. Parangs E 111 LAT Vandžene mežn E 112 LAT Melnaja praisa E 113 LAT Annas m. Gen. Parangs E 114 LAT Sesile E 115 LAT Sesile E 116 LAT Ugales m I 117 LAT Jekabpils Gen. Parangs E 118 LAT Talsi mežn. Gen. Parangs E 119 LAT Selsile E 120 LAT Ugales m. Gen. Parangs E 121 LAT Sesile I 122 LAT Piltenes mežn. Gen. Parangs E 123 LAT Nica I 124 LAT Parganjas m. Gen. Parangs E 125 LAT Jekabpils Gen. Parangs E 126 LAT Gaunjelgava E 127 LAT Nica E 128 LAT Preilu Gen. Parangs E 129 LAT Naukšeni Gen. Parangs E 9

10 Hunt nr Riik Kogumiskoht Kogumispaik Kogumisaeg Sugu 130 LAT Krustpils mežn. Gen. Parangs E 131 LAT Guldiga Gen. Parangs E 132 LAT Ventspils I 133 LAT Vecumniki E 134 LAT Valdemarpils E 135 LAT Jumaras m. Gen. Parangs E Tabel 2 Mikrosatelliitlookuste statistilised parameetrid, mis kirjeldavad: iga lookuse geneetilist mitmekesisust e. heterosügootsust ja alleelide arvu lookuses. Lookuse nimi Heterosügootsus Alleelide arv H H H H H H H H H H H H VWF H CPH CPH CPH C CPH CXX

11 Kirjandusallikate loetelu Aspi J, Roininen E, Ruokonen M, Kojola I, Vilà C (2006) Genetic diversity, population structure, effective population size and demographic history of the Finnish wolf population. Molecular Ecology 15(6), Boitani L (2003) Wolf conservation and recovery. In: Wolves. Behavior, Ecology, and Conservation (eds Mech LD, Boitani L), pp University of Chicago Press, Chicago. Pulliainen E (1965) Studies on the wolves (Canis lupus L.) in Finland. Annales Zoologici Fennici, 2, Pulliainen E (1980) The status, structure and behaviour of the wolf (Canis lupus L.) along the Fenno-Soviet border. Annales Zoologici Fennici, 17,