(Microsoft Word - Punav\366\366taudi tekitaja sporulatsioonist ja levikust Eestis.\205)

Väljavõte

1 EESTI MAAÜLIKOOL Metsandus- ja maaehitusinstituut Metsakasvatuse osakond Priit Kaare PUNAVÖÖTAUDI TEKITAJA (DOTHISTROMA SEPTOSPORUM) SPORULATSIOONIST JA LEVIKUST EESTIS Magistritöö loodusvarade kasutamise ja kaitse erialal Juhendaja PhD Rein Drenkhan Tartu 2013

2 Magistritöö lühikokkuvõte Eesti Maaülikool Kreutzwaldi 1, Tartu Autor: Priit Kaare Õppekava: Loodusvarade kasutamine ja kaitse Pealkiri: Punavöötaudi tekitaja (Dothistroma septosporum) sporulatsioonist ja levikust Eestis Lk: 57 Jooniseid: 11 Tabeleid: 8 Lisasid: 0 Osakond: Metsakasvatus Uurimisvaldkond: Metsapatoloogia Juhendaja: PhD Rein Drenkhan Kaitsmiskoht ja aasta: Tartu, 2013 Punavöötaud on üks olulisemaid mändide (Pinus spp.) okkahaigusi terves maailmas, mis on viimastel aastatel ka Eestis levinud ja palju kahju tekitanud. Tegemist on ohtliku ning taimlates karantiinse seenhaigusega, mille tekitajateks on Dothistroma septosporum (teleomorf Mycosphaerella pini) ja tema sõsarliik Dothistroma pini. Käesoleva uurimistöö eesmärkideks oli (1) uurida punavöötaudi tekitaja D. septosporum i sporulatsiooni kaheksa kalendrikuu vältel proovikohast süstemaatiliselt kogutud okkaproovide põhjal, (2) testida DNA-põhist punavöötaudi liigispetsiifilist praimerit D. septosporum i määramisel PCR-meetodiga ning teha seejärel kindlaks punavöötaudi esinemine Eestis, (3) testida teist DNA-põhist liigispetsiifilist praimerit D. pini olemasolu kontrollimiseks. D. septosporum i sporulatsiooni seire jaoks koguti hariliku männi (P. ) okkaproove nii Lääne-Virumaalt Lasilast kui ka Tartumaalt Külitselt. Okkaproovid prepareeriti ning registreeriti mikroskoobi all eoste keskmine arvukus. DNA-põhiste liigispetsiifiliste praimerite testimiseks kasutati ja aastal üle Eesti korjatud okkaproove. Selleks eraldati okkaproovidest DNA, valmistati PCR-segu, käivitati PCR ning viidi läbi elektroforees. Sporulatsiooni seire käigus saadud tulemused näitasid, et sporulatsiooni tipphetked jäid mõlemas proovikohas septembri algusesse ning veebruari lõppu ja märtsi algusesse. Liigispetsiifiliste praimerite testimisel saadud tulemused näitasid, et D. septosporum on valdavalt levinud Põhja- ja Lääne-Eestis, samas kui haigustekitaja koniidide prepareerimine näitas, et patogeen on levinud ka Lõuna- ja Kagu-Eestis. D. pini t ei leitud seevastu mitte ühestki proovikohast. Selleks, et osata planeerida profülaktilist tõrjet, tuleb teada, kuidas haigustekitaja käitub ning millal toimub sporulatsioon. Puude pritsimine fungitsiididega on efektiivne just vegetatsiooniperioodi alguses ja augustikuus. Samuti on punavöötaudi leviku tõkestamise seisukohalt oluline uurida võimalusi haigustekitaja kiireks ja usaldusväärseks tuvastamiseks kaubavahetusel välisriikidega. Märksõnad: punavöötaud, Dothistroma septosporum, Dothistroma pini, sporulatsioon, DNA-põhine liigispetsiifiline PCR-praimer 2

3 Abstract of Master s Thesis Estonian University of Life Sciences Kreutzwaldi 1, Tartu Author: Priit Kaare Speciality: Loodusvarade kasutamine ja kaitse Title: The sporulation and distribution of Dothistroma septosporum in Estonia 57 pages 11 figures 8 tables 0 appendix Department: Silviculture Field of research: Forest pathology Supervisor: PhD Rein Drenkhan Place and date: Tartu, 2013 Red band needle blight is one of the most important foliar diseases of pines (Pinus spp.) in the world. In recent years, it has caused serious damage in Estonia and is therefore listed as a quarantine organism in nurseries. The causal agents of the disease are D. septosporum (teleomorph Mycosphaerella pini) and D. pini. The aim of the thesis was to (1) monitor the sporulation of D. septosporum on the basis of needle samples collected systematically from two locations during a period of 8 months, (2) test a DNA-based species-speficic PCR primer to identify the presence of D. septosporum in the needle samples, thereupon determine the distribution of the pathogen in Estonia, (3) test another DNA-based species-speficic PCR primer to identify the presence of D. pini in Estonia. For the monitoring of the sporulation, needle samples of Scots pine (Pinus ) were collected. The collecting sites were in Lasila (Lääne-Virumaa) and Külitse (Tartumaa). The samples were prepared and the conidia were counted under the microscope. For the testing of DNA-based species-specific PCR primers, needle samples collected from all over Estonia in 2011 and 2012 were used. Prior to that, the extraction of DNA was made, as well as the preparation of PCR mix, the process of PCR and electrophoresis. The results showed that the high spots of sporulation were in the beginning of September and at the end of February or in the beginning of March. The results regarding to the test of the species-specific primers showed that D. septosporum is mainly dominant in the north and west of Estonia, whilst preparing the conidia indicated that the disease is also present in south and southwest of Estonia. On the contrary, D. pini was not found from any of the collected samples. It is important to know how the pathogen behaves and when are the high spots of the sporulation. This information is essential for planning the fungicide treatment. The treatment for Dothistroma in conditions of Estonia is most effective in the beginning of vegatation period or in August. It is also important to seek for the possibilities to detect the disease quickly and reliably while trading forest goods with foreign countries. Keywords: red band needle blight, Dothistroma septosporum, Dothistroma pini, sporulation, DNA-based species-specific PCR primer 3

4 SISUKORD Sissejuhatus Kirjanduse ülevaade Punavöötaudi tekitaja Peremeestaimed Ohtlikkus Sümptomid Defoliatsioon Sümptomite ilmnemine Viljakehad Dothistromiin Sarnasus pruunvöötaudiga Levik Levikust Euroopas Levikust Eestis Levikust mujal maailmas Suguline arengujärk Sporulatsioon Sporulatsiooni aeg Eoste levimine Nakatumine Eoste areng Eoste arengut soodustavad faktorid Materjal ja metoodika Sporulatsiooni seire Asukoht Metoodika Okaste prepareerimine Eoste loendamine Eoste mõõtmine Liigispetsiifilise praimeri testimine Materjal Metoodika Okkaproovide prepareerimine DNA eraldamine PCR-segu valmistamine DNA amplifikatsioon Geelelektroforees Tulemuste pildistamine UV-transilluminaatoriga Tulemused Punavöötaudi tekitaja sporulatsioon Eoste mikromorfoloogilised tunnused Männiokastel ja -käbidel esinevad teised seeneliigid Liigispetsiifilise praimeri testimine Diskussioon Punavöötaudi tekitaja sporulatsioon ja tõrje

5 4.2. Punavöötaudi levikut soodustavad faktorid DNA-põhiste liigispetsiifiliste praimerite sobivus patogeeni tuvastamisel bioloogilisest proovist Koniidide mõõdud Tulevik Kokkuvõte Viidatud allikad

6 SISSEJUHATUS Käesoleva uurimistöö läbivaks teemaks on punavöötaud (tekitaja Dothistroma septosporum, teleomorf Mycosphaerella pini) ning selle sporulatsioon ja levik Eestis. Antud teema sai valitud põhjusel, et punavöötaud on üks olulisemaid mändide (Pinus spp.) okkahaigusi terves maailmas (Watt et al., 2011) ning on viimastel aastatel ka Eestis palju kahju tekitanud. Tegemist on ohtliku ning taimlates karantiinse haigusega, mille uurimiseks on ellu kutsutud COST (European Cooperation in Science and Technology) töörühm DIAROD (Determining Invasiveness and Risk of Dothistroma), kus osalevad ka Eesti metsapatoloogid (Anonymous, 2011). Punavöötaud ründab eelkõige mände (Pinus spp.), kuid seda haigust on leitud ka kuuskedelt (Picea spp.), ebatsuugalt (Pseudotsuga sp.) ning lehiselt (Larix sp.) (Brown, 2012). Haigus kahjustab puuvõra alumiste okste teise ja kolmanda aasta okkaid, mis on juurdekasvu jaoks kõige olulisemad (Drenkhan et al., 2006; Kurkela et al., 2009). Sellest tingituna jääb puu kiratsema, kuni võib lõpuks hukkuda (Hanso, Drenkhan, 2008). Eestist leiti invasiivne punavöötaud esmaskordselt aasta hilissügisel Järvseljalt (Hanso, Drenkhan, 2007), ent Lõuna- ja Lääne-Euroopas on see haigus kahju tekitanud juba aastakümneid (Jankovský et al., 2009). Samas on punavöötaud levinud terves maailmas ning seda on leitud nii troopilise kui ka subarktilise kliimaga aladelt (Drenkhan et al., 2012). Punavöötaudi plahvatuslikule levikule on ilmselt kaasa aidanud nii kliimamuutused kui ka suurenenud istutusmaterjali transport (Boonekamp, 2012; Drenkhan et al., 2012). Kuid selleks, et kontrollida haiguse levikut ning planeerida efektiivset profülaktilist tõrjet, on vajalik teada, kuidas on seotud haiguse tekitaja areng ilmastiku andmetega ning pikemaajaliselt kliimaga (või kliima muutustega) (Watt et al., 2011). 6

7 Lähtudes teema olulisusest püstitati uurimistöös järgmised eesmärgid: 1) Uurida punavöötaudi tekitaja D. septosporum i sporulatsiooni teatud ajavahemikul kahest erinevast proovikohast süstemaatiliselt korjatud okkaproovide alusel. 2) Esmakordselt Eestis testida DNA-põhist punavöötaudi liigispetsiifilist praimerit D. septosporum i seirel ja määramisel PCR (polymerase chain reaction) meetodiga ning teha seejärel kindlaks punavöötaudi esinemine ja aastal üle Eesti korjatud okastelt. 3) Testida ka teist liigispetsiifilist praimerit D. septosporum i sõsarliigi D. pini olemasolu kontrollimiseks ja aasta proovidest. D. septosporum i sporulatsiooni seire käigus saadud tulemused näitavad eoste arvukuse muutuse põhjal, milline on patogeeni sporulatsioon ja millal on sporulatsiooni tipphetked. DNA analüüsi käigus saadud tulemused annavad ülevaate mõlema punavöötaudi tekitaja levikust Eestis. Punavöötaudi sporulatsiooni ja leviku uurimine on vajalik selleks, et saada aimu punavöötaudi iseloomust Eestis ning seeläbi osata paremini planeerida profülaktilist tõrjet ja takistada haiguse kahjustusi taimlates. Uurimistöö koosneb kahest osast: 1) Referatiivne osa, mis annab ülevaate punavöötaudi iseloomust, peremeestaimedest, ohtlikkusest, sümptomitest nii puu kui ka okka tasandil, leviku ajaloost Eestis ja mujal maailmas, sporulatsioonist ning tehtud uuringutest; 2) Praktiline osa, mis kirjeldab kasutatud metoodikat, materjale, uurimistöö käigus saadud tulemusi ja arutelu saadud tulemuste põhjal. Praktiline osa koosneb omakorda kahest alapeatükist, millest esimeses hinnati D. septosporum i sporulatsiooni kõige põhjapoolsemas Euroopas kogutud proovide järgi ning teises punavöötaudi tekitajate D. septosporum i ja tema sõsarliigi Dothistroma pini olemasolu DNA-põhiste liigispetsiifiliste praimerite põhjal. Omalt poolt soovib töö autor tänada Katrin Jürimaad instruktaaži ja toetuse eest metsapatoloogia laboris ning loomulikult Rein Drenkhani juhendamise ja abi eest töö koostamisel, andmete kogumisel ning materjalide hankimisel. 7

8 1. KIRJANDUSE ÜLEVAADE 1.1. Punavöötaudi tekitaja Punavöötaud on kiirestileviv kroonilise iseloomuga okkahaigus, mis võib järjepanu kesta mitmeid aastaid (Drenkhan, Hanso, 2009). Haigus ründab eelkõige nooremaid, kuid vahel ka vanemaid mände (Pinus spp.) ning on seetõttu eriti ohtlik (Hanso, Drenkhan, 2007). Punavöötaudi (inglise keeles Dothistroma needle blight või red band needle blight, soome keeles punavyökariste) põhjustajaks on kottseente hõimkonda (Ascomycota) kuuluv mikroskoopiline seen nimega D. septosporum, sün. Cytosporina septospora, Actinothyrium marginatum, Septoriella septosporum (teleomorf Mycosphaerella pini, sün. Scirrhia pini, Eruptio pini) ning tema lähedane sugulane D. pini (teleomorfi pole teada), mis on temaga fülogeneetiliselt ja morfoloogiliselt sedavõrd sarnane, et ilma DNA-põhise määranguta on neil kahel seeneliigil peaaegu võimatu vahet teha (Barnes et al., 2007; Bednářová et al., 2006; Vuorinen, 2009). Taksonoomiliselt kuuluvad nii D. septosporum kui ka D. pini perekonda Dothistroma, kuhu kuulub peale nende veel kuus seeneliiki (Markovskaja, Treigienė, 2009). D. septosporum it võib oma ohtlikkuse ja tekitatud kahju poolest kõrvutada Fusarium circinatum iga tegemist on kahe kõige olulisema mändide seas leviva seenpatogeeniga terves maailmas (Watt et al., 2011) Peremeestaimed Männiliikidest eelistab punavöötaud eriti musta (Pinus nigra), kollast (Pinus ponderosa) ning mägimändi (Pinus mugo), kuid kahjustab ka muid männiliike, mida 8

9 kokku on 82 (Hanso, Drenkhan, 2008; Drenkhan et al., 2012). Samuti on punavöötaudi leitud Euroopa lehiselt (Larix decidua), ebatsuugalt (Pseudotsuga menziesii), harilikult kuuselt (Picea abies), sitka kuuselt (Picea sitchensis) (Hanso, Drenkhan, 2008), serbia kuuselt (Picea omorika), hõbekuuselt (Picea pungens) ja Schrencki kuuselt (Picea schrenkiana) (Brown, 2012). Punavöötaudi suhtes tundlikud männiliigid on toodud tabelis 1.1. Tabel 1.1. Punavöötaudi suhtes tundlikud männiliigid (Brown, 2012 järgi) Väga tundlikud P. attenuata P. brutia P. canariensis P. cembroides P. contorta var. latifolia P. engelmannii P. halepensis P. jeffreyi P. muricata P. nigra subsp. laricio P. nigra subsp. nigra P. pinea P. ponderosa P. radiata P. sabineana P. P. thunbergii P. x attenuradiata Keskmiselt tundlikud P. bungeana P. canariensis P. caribaea P. coulteri P. cubensis P. densiflora P. echinata P. echinata x taeda P. elliottii P. flexilis P. kesiya P. lambertiana P. massoniana P. monticola P. mugo subsp. mugo P. occidentalis P. palustris P. pinaster P. pungens P. radiata var. binata P. resinosa P. roxburghii P. strobiformis P. strobus P. taeda Vähetundlikud P. aristata P. ayacahuite P. contorta P. coulteri P. devoniana P. elliottii var. densa P. hartwegii P. heldreichii P. koraiensis P. merkusii P. montezumae P. oocarpa P. patula P. pseudostrobus P. rigida P. serotina P. sibirica P. strobus L. var. chiapensis P. tabuliformis P. torreyana P. wallichiana Tundlikkus ebaselge P. albicaulis P. arizonica var. cooperi P. banksiana P. cembra P. clausa P. contorta x banksiana P. contorta var. contorta P. kesiya var. kesiya P. maximinoi P. mugo subsp. rotundata P. mugo subsp. uncinata P. peuce P. var. mongolica P. tecunumanii Üldiselt on peremeestaimede tundlikkus punavöötaudi suhtes liigiti erinev (Brown et al., 2003). Näiteks niiskema ökosüsteemiga piirkondadest, kus okkahaigused on üsna tavalised, pärit männiliigid (nt. P. contorta var. latifolia) on võõras keskkonnas 9

10 tunduvalt resistentsemad kui kuivema ökosüsteemiga piirkondadest pärit perekonnakaaslased (Sturrock et al. 2011). Samuti on punavöötaudi suhtes immuunsed paljud Kesk-Ameerika männiliigid (Anonymous, 2008) Ohtlikkus Eestis kuulub punavöötaud karantiinsete haiguste nimekirja (Hanso, Drenkhan, 2007), kuid hetkel on nimetatud liik karantiinne ainult taimlates. Erinevalt mägimännist (P. mugo) ja mustast männist (P. nigra) pole harilikule männile (P. ) Eestis D. septosporum veel tõsist kahju tekitanud (Drenkhan et al., 2012). Siiski, Eestis kahjustab punavöötaud enamasti teise ja kolmanda aasta okkaid, kuid see mõjutab oluliselt männi juurdekasvu (Drenkhan, 2011). On pakutud, et punavöötaud on kõige ohtlikum ja dominantsem siis, kui peremeestaim asub väljaspool oma loomulikku kasvuala (Brown et al., 2003). Punavöötaud on üle maailma lausa nii palju kahju tekitanud, et mitmed mitte-euroopa riigid on loobunud mõnede punavöötaudi suhtes tundlike männiliikide (nagu näiteks P. radiata, P. nigra ja P. attenuata x radiata) istutamisest (EFSA, 2013) Sümptomid D. septosporum i näol on tegemist nekrotroofse patogeeniga, mis kude kahjustades põhjustab okka surma ja defoliatsiooni ehk okaste enneaegset varisemist (Hanso, Drenkhan, 2008). Haigus kahjustab teise ja kolmanda aasta okkaid, mis on juurdekasvu jaoks kõige olulisemad. Sellest johtuvalt jääb puu kiratsema, kuni võib lõpuks hukkuda (Hanso, Drenkhan, 2008). Näiteks alates aastast on Šotimaal mõnes piirkonnas 50-aastaste ja vanemate P. contorta var. latifolia puude puhul täheldatud koguni 90% suremust (Sturrock et al., 2011). 10

11 Defoliatsioon Punavöötaudist tingitud defoliatsioon võib hävitada kuni 80% okastikust, vähendades sellega fotosünteesi võimekust ning pärssides juurdekasvu (Bradshaw, 2004; Ivković el al, 2010; Woods et al., 2005). Samuti väheneb puittaime majanduslik ja esteetiline väärtus (Sturrock et al., 2011). Juba 25%-line defoliatsioon omab olulist mõju juurdekasvule ning 50%-line pärsib juurdekasvu lausa poole võrra (Anonymous, 2008). Suurema kui 85%-lise defoliatsiooniga kaasneb aga peaaegu täielik juurdekasvu lakkamine (Welsh et al., 2009). Defoliatsioon algab enamasti puuvõra alumistest okstest (Joonis 1.1) (Brown et al., 2003), jättes alles ainult viimase aasta okkad. Seetõttu meenutavad haigusest tabandunud oksad tihtipeale pintslitutte (OEPP/EPPO, 2005). Joonis 1.1. Punavöötaudi poolt kahjustatud mägimännid (P. mugo) (Rein Drenkhani foto, 2010) 11

12 Tõsisemate haiguspuhangute puhul muutuvad okkad tervenisti pruuniks ning varisevad enneaegselt maha, sealjuures vanemad okkad enne. Vähemtõsisemate haiguspuhangute puhul võivad okkad variseda alles aasta või kahe pärast (OEPP/EPPO, 2005) Sümptomite ilmnemine Esimesed haigussümptomid tekivad rohelistel okastel tavaliselt hilissuvel või varasügisel. Kõigepealt ilmuvad okastele ümber haiguspunktide kollaste laikudega tumerohelised vöödid. Seejärel muutuvad laigud haiguskollete ümber tänu seene poolt eritatavale mükotoksiinile punaseks ning kujunevad edasi ristseteks vöötideks (EFSA, 2013). Sealjuures võib punaseid laike ja ristvööte näha isegi maha varisenud okastel (Bradshaw, 2004). Samas võib aga juhtuda, et punaseid ristvööte ei teki üldse (Brown et al., 2003), kuna nende teke on suurel määral seotud ka valguse intensiivsusega. Seega, mida kehvemad on valgustingimused, seda rohkem on pärsitud punaste ristvöötide teke (OEPP/EPPO, 2005). Teisisõnu vöötide värvus on sõltuv aastaajast. Haigestunud okkad kaotavad mõne aja pärast oma rohelise pigmendi ning muutuvad punakaspruuniks. Kusjuures pruunistumine saab punavöötaudile omaselt alguse okka tipust (Brown et al., 2003). Erinevatel peremeestaimedel on samuti sümptomid okastel erinevad, s.o. harilikul männil erkpunased ning mägimännil pigem punakaspruunid vöödid (Rein Drenkhan, suulised andmed) Viljakehad D. septosporum i viljakehad on algselt valged ja subepidermaalsed. Arenedes tungivad need läbi kutiikula, kuni moodustavad tumepruunid või mustad silmaga nähtavad mügarikud (Joonis 1.2) (Bradshaw, 2004; EFSA, 2013). 12

13 Joonis 1.2. D. septosporum i viljakehad musta männi (P. nigra) okastel (allikas: OEPP/EPPO, 2005) Küpsed viljakehad on D. septosporum il enamasti ümarad või piklikud ning läbimõõduga x µm (samas kui sugulise arengujärgu M. pini viljakehad jäävad vahemikku x µm) (OEPP/EPPO, 2005). Okkal paiknevad viljakehad tihtilugu gruppidena ning neid võib leida selle mõlemalt küljelt (EFSA, 2013) Dothistromiin Punaseid paari millimeetrise läbimõõduga laike või ristvööte (Joonis 1.3) tekitab seene poolt eritatav mükotoksiin nimega dothistromiin (Drenkhan, Hanso, 2009), mis on oma keemilise struktuuri poolest sarnane Aspergillus spp. poolt eritatavate mükotoksiinide aflatoksiini ja sterigmatotsüstiini eelkäija versicolorin B-ga (Schwelm et al., 2009). 13

14 Joonis 1.3. Punavöötaudi sümptomitega hariliku männi (P. ) okkad (Jarmo Holopaineni foto, 2008). Ühelt poolt on pakutud, et dothistromiini eritamisega tapab seen peremeestaime rakke soodustades nii seeneniidistiku kasvu ja levikut (Brown et al., 2003). Samas on väidetud, et okkakahjustused on tingitud hoopis peremeestaime kaitsereaktsioonist ja pole otseselt dothistromiini eritamisega seotud. Kusjuures laboratoorsetes tingimustes tehtud uuringud on näidanud, et P. radiata puhul ei ole dothistromiini tootmine D. septosporum i viljakehade arengu seisukohalt oluline, vaid pigem määrava tähtsusega konkureerides teiste seeneliikidega (nt. Cyclaneusma minus ja Lophodermium conigenum) (Schwelm et al., 2009). Dothistromiini toodab D. septosporum ka puhaskultuuris, mistõttu on söötme peal näha ümber seenekoloonia punakat perimeetrit (OEPP/EPPO, 2005) (Joonis 1.4). 14

15 Joonis 1.4. D. septosporum puhaskultuuris Petri tassil (Priit Kaare foto, 2013) Sarnasus pruunvöötaudiga Vahel võib punavöötaudi segi ajada ka pruunvöötaudiga (tekitaja Lecanosticta acicola, teleomorf Mycosphaerella dearnessii) (Joonis 1.5), mis on esimesele oma iseloomu, eoste kuju ja sümptomite poolest küllaltki sarnane ning samuti väga ohtlik seenpatogeen (Bradshaw, 2004). 15

16 Joonis 1.5. Pruunvöötaudi sümptomitega mägimänni (P. mugo) okkad (Allikas: ) Kõige suurem erinevus seisneb ehk selles, et pruunvöötaudi tekitaja L. acicola ei erita dothistromiini ja seega ei teki viljakehade ümber punaseid ristvööte (Bradshaw, 2004). Samas ei pruugi punavöötaudi puhul talle iseloomulikke punaseid ristvööte alati tekkida ning sellisel juhul võib kergesti punavöötaudi ekslikult pruunvöötaudiks pidada (OEPP/EPPO, 2005). Morfoloogiliste tunnuste põhjal on kõige kindlam kahte seeneliiki eristada siiski eoste järgi: L. acicola eosed sisaldavad oma rakuseintes melaniinigraanuleid, mistõttu on nad pigmenteeritud, paksude seinte ning köbrulise pinnaga. D. septosporum i eosed on seevastu hüaliinsed, õhukeste seinte ning sileda pinnaga (OEPP/EPPO, 2005). Siiski on nende kahe liigi eristamine morfoloogiliste tunnuste põhjal keeruline, kui puudub võrdlemise võimalus. 16

17 1.5. Levik D. septosporum on laialdaselt levinud terves maailmas. Seda on leitud nii troopilise, subtroopilise, vahemerelise, parasvöötmelise, kontinentaalse kui ka subarktilise kliimaga aladelt, ent D. pini (D. septosporum i sõsarliik, mis lahutati D. septosporum ist alles üsna hiljuti) on seevastu tunduvalt kitsama areaaliga ja seda on leitud ainult Ameerika Ühendriikide põhjaosast ning paiguti Venemaalt, Ukrainast, Prantsusmaalt ja Ungarist (Drenkhan et al., 2012; Ioos et al., 2010). D. septosporum i esmakirjeldus tehti juba aastal Venemaal Doroguine i poolt C. septospora nime all (Drenkhan et al., 2012). Samas arvatakse, et Briti Columbias (Kanadas) on punavöötaud keerdokkalisi mände (P. contorta) nakatanud juba sajandeid (Woods, 2011). D. pini kohta spekuleeritakse, et see ilmus välja Kesk-Ameerika mägedes aastatel ning liikus seejärel kiiresti Põhja-Ameerikasse (Ameerika Ühendriikidesse ja Kanadasse) (Markovskaja, Treigienė, 2009). Riikidest, kus esinevad mõlemad liigid nii D. septosporum kui ka D. pini, on neid leitud sarnaste tingimustega keskkonnast. Kusjuures Ungarist on mõlemat liiki leitud isegi ühelt ja samalt okkalt (EFSA, 2013) Levikust Euroopas Euroopas leiti D. septosporum it esmaskordselt aastal puukoolist Inglismaalt (Brown et al., 2003). Erinevatel aegadel on seda leitud ka teistest Euroopa riikidest: näiteks Prantsusmaalt aastal, Bulgaariast aastal, Saksamaalt aastal, ning Poolast aastal (Jankovský et al., 2009) aastaks oli punavöötaud esindatud ka paljudes Kesk-Euroopa riikides, sh. Austrias, Sloveenias, Slovakkias, Ungaris ja Tšehhis, kust seda leiti esmakordselt aastal (Jankovský et al., 2004). Euroopast on punavöötaudi leitud veel Portugalist, Hispaaniast, Šveitsist, Itaaliast, Horvaatiast, Montenegrost, Serbiast, Rumeeniast, Gruusiast ja teistest riikidest. Hilisemad leiud on pärit Belgiast ning Hollandist 17

18 (Jankovský et al., 2009). Võib arvata, et haiguse plahvatuslik levik Kesk-Euroopas 1990ndatel aastatel võis olla tingitud istutusmaterjali suurenenud transpordist (Drenkhan et al., 2012) Levikust Eestis Baltimaades avastati D. septosporum esmakordselt aastal Leedus mägimännilt (P. mugo) (Drenkhan, Hanso, 2009), Eestis seevastu mustalt männilt (P. nigra) aasta hilissügisel Agali arboreetumist Järvseljalt (Hanso, Drenkhan, 2007). Samast piirkonnast leiti aasta märtsis D. septosporum ka mägimännilt (P. mugo) (Drenkhan, Hanso, 2009) ja juba sama aasta mais harilikult männilt (P. ) (Hanso, Drenkhan, 2007) aasta lõpuks oli D. septosporum levinud ka teistesse Lõuna-Eesti piirkondadesse (nt. Haabsaarde, Rebastesse, Kongutale) ning aasta kevadeks oli haigus Lõuna-Eestis laialdaselt levinud. Ühtlasi leiti juba esimesi haiguskoldeid nii Kesk- kui ka Põhja-Eestist ning isegi Lõuna- ja Kesk-Soomest (Drenkhan, Hanso, 2009) Levikust mujal maailmas 1960datel aastatel registreeriti üksikuid punavöötaudi haiguspuhanguid ka Ameerika Ühendriikides (Bradshaw, 2004) ning möödunud sajandi lõpuks oli punavöötaud tänu kliimamuutustele Põhja-Ameerikas (eriti Briti Columbias, Kanadas) juba tõsist kahju tekitanud. Lõunapoolkeral sai temast üsna ruttu üks ohtlikumaid patogeene männiliikidele (Pinus spp.) (Drenkhan, Hanso, 2009; Watt et al., 2009): alates 1960ndatest aastatest on punavöötaud keerdokkalise männi (P. contorta) istandustes tekitanud märkimisväärset kahju nii Aafrikas, Lõuna-Ameerikas (Tšiilis) kui ka Okeaanias (Uus-Meremaal) (Sturrock et al., 2011; Vuorinen, 2009). Samuti on punavöötaud laastanud kiirja männi (P. radiata) istandusi Brasiilias, Keenias, Zimbabwes, Uus-Meremaal ning Lõuna-Aafrikas (Woods et al., 2005). 18

19 Lisaks on punavöötaudi leitud veel Kesk-Ameerikast (Guatemalast, Costa Ricalt, Jamaikalt jne.) ning Aasiast (Bruneist, Hiinast, Indiast, Jaapanist, Nepaalist, Pakistanist jne.) (Watt et al. 2009) Suguline arengujärk Euroopas levib D. septosporum peamiselt suguta arengujärgu eostega. Eestist ei ole seni veel sugulist arengujärku ehk teleomorfi avastatud (Hanso, Drenkhan, 2008), samuti ei ole seda leitud teistest Balti riikidest, Skandinaaviast, Soomest ja Suurbritanniast (Drenkhan et al., 2012). Seevastu on teleomorf registreeritud Kanadas, Ameerika Ühendriikides, Saksamaal, endises Jugoslaavias, Poolas ja Portugalis (Bradshaw, 2004). Sisuliselt on nimetatud patogeeni suguline järk Euroopas harv nähtus, kuid äsjase Eesti, Soome ja Tšehhi D. septosporum i populatsiooni geneetilise analüüsi tulemusena selgus patogeeni suur geneetiline varieeruvus, mis viitab sugulise arengujärgu olemasolule (Drenkhan et al., 2012). Harva esinev teleomorf viitab sellele, et M. pini näol on tegemist heterotalse organismiga (Bradshaw, 2004), mis tähendab omakorda seda, et paljunemiseks on vajalik kahe erineva suguliselt sobiliku talluse olemasolu. Seetõttu piirnebki M. pini paljunemine populatsioonidega, kus on esindatud mõlemad paarumistüübid (Dale et al., 2011) Sporulatsioon Sporulatsiooni aeg D. septosporum sporuleerib olenevalt piirkonnast tavaliselt hiliskevadest hilissuveni või sügiseni, aprillist oktoobrini või maist septembrini (Drenkhan, Hanso, 2009), kuid enamasti vabanevad esimesed eosed eelmisel aastal nakatunud okastel arenenud viljakehadest siiski kevadel (Bradshaw, 2004). See kõik võib aga sõltuvalt ilmastikust ja peremeestaimest varieeruda ning sporulatsioon võib alata ka pehmel talvel (Hanso, Drenkhan, 2008). 19

20 Samuti võib sporulatsiooniperioodi pikkust mõjutada piirkonna geomorfoloogia ning kõrgus merepinnast nagu selgus aastal Tšehhi Vabariigis läbi viidud uuringute põhjal. Uurimistöö käigus jälgiti märtsist detsembrini D. septosporum i sporulatsiooni musta männi (P. nigra) istandustes kahel erineval proovialal: aastal Lanzhotis (pinnamood tasane, kõrgus merepinnast 141 meetrit) ning aastal Hackerovkas (pinnamood nõgus, kõrgus merepinnast 470 meetrit). Lanzhotis registreeriti sporulatsiooni algus 24. aprillil ja lõpp 6. oktoobril, Hackerovkas aga vastavalt 13. mail ning 11. oktoobril. Kusjuures sporulatsiooni jaoks vajalik minimaalne keskmine õhutemperatuur päevas oli mõlemal juhul 10 C, optimaalne aga C, sealjuures optimaalne suhteline õhuniiskus 90%. Sporulatsioon lakkas, kui keskmine päevane õhutemperatuur oli üle 18 C ning suhteline õhuniiskus alla 75% (Dvorak et al., 2012) Eoste levimine Koniidid (mittesugulise paljunemise eosed) levivad üldiselt vihmaga veetilkades ning ei jõua seetõttu eriti kaugele erinevalt askospooridest (sugulise paljunemise eostest), mis levivad eelkõige tuulega (Brown et al., 2003). Vihmapiiskadega laiali kandudes jääb koniidide levikukaugus enamasti 60 cm piiresse (Dale et al., 2011). Veel ei ole päris täpselt teada, kuidas D. septosporum pikemate vahemaade taha levib (Dale et al., 2011), kuid arvatakse, et koniidid võivad kaugemale kanduda näiteks metsamaterjali transpordi käigus ning võimalik, et vähesel määral ka tuule, tõusvate õhuvoolude ja udu abil (Bradshaw, 2004). Kuna teleomorfi esinemissagedus looduses on väiksem ning sporulatsiooni aeg lühem, siis on alust väita, et seen levibki looduses peamiselt koniidide abil (Dale et al., 2011). D. septosporum i eoseid on leitud ka mesilaste (Alpis spp.) õietolmu korvikeste seest, kuid dokumenteeritud andmed eoste entomohoorse leviku (ehk putuklevi) kohta puuduvad (EFSA, 2013). 20

21 Nakatumine D. septosporum i eosed nakatavad käesoleva või eelmise aasta okkaid seal idanedes ja tungides läbi õhulõhede või otse läbi kutiikula (Bradshaw, 2004). Eestis nakatab seen enamasti eelmise ja üle-eelmise aasta okkaid ning vähem jooksva aasta okkaid (Drenkhan, Hanso, 2009). Nakatumine sõltub nii temperatuurist, nakatamisvõimeliste eoste arvust, peremeestaime vanusest kui ka okaste niiskusfaktorist ajagradiendil (Brown et al., 2003). Nakatumiseks on tavaliselt vaja kümne või enama tunni pikkust niiskusperioodi. Briti Columbias ja Ühendkuningriikides läbi viidud uuringud näitasid, et mida suurem on kevadine ja suvine sademete hulk, seda suurem on ka nakkuse oht järgmisel aastal (Sturrock et al., 2011). D. septosporum i nakatumiseks sobilik temperatuurivahemik on C, kõige optimaalsem aga C (Sturrock et al., 2011). Teiste andmete kohaselt jällegi ei toimu nakatumist, kui temperatuur on alla 7 C (Anonymous, 2008) Eoste areng Oma elutsükli täielikuks läbimiseks kulub D. septosporum il 1 2 aastat (Welsh et al., 2009). Eoste arenedes tungib seenehüüf läbi epidermise ja kutiikula, kuni moodustuvad mustad mügarikud (Bradshaw, 2004). Talveks jäävad nakatunud okkad puu külge ning kevadel algava sporulatsiooni käigus väljuvad eosed viljakehast liimja läbipaistva massina (Brown et al., 2003; Bradshaw, 2004). Idanenud eostest arenenud viljakehad ilmutavad end enamasti kevadel või suvel, kuid mõnes piirkonnas ka alles sügisel või talvel (nt. Eestis, kus on veel oktoobrist kuni detsembrini rohkelt viljakehi leitud) (EFSA, 2013). Kinnitunud okastel võivad koniidid olla elujõulised mitu kuud, kuid maha varisenud okastel need enam kaua vastu ei pea (Brown et al., 2003), sest teised seened (eelkõige sekundaarsed lagundajad) hõivavad okkad. 21

22 Eoste arengut soodustavad faktorid Eoste idanemiseks ning viljakehade arenguks on vajalik niiske ja soe keskkond (Bradshaw, 2004). Seetõttu on punavöötaudi arenguks eriti soodne keskkond just tihedas paksu puhma- ja põõsarindega istanduses, kus puuvõra alumiste okste juures on niiskuse tase kõrge (Brown et al., 2003). Punavöötaud levib kiiresti ning selle üheks põhjuseks võib olla kliima muutustest (sealhulgas soojenemisest) tingitud suhtelise õhuniiskuse ja -temperatuuri tõus (Boonekamp, 2012). 22

23 2. MATERJAL JA METOODIKA 2.1. Sporulatsiooni seire Uurimistöö praktilise osa esimeses osas hinnati punavöötaudi tekitaja D. septosporum i sporulatsiooni koniidide (edaspidi: eoste) arvukuse põhjal ühest kindlast paigast kindla ajavahemiku jooksul võetud okkaproovidest. Saadud tulemused kõrvutati teisest Eesti piirkonnast pärit prooviandmestikuga Asukoht Proovikoht asub Lääne-Viru maakonnas Rakvere vallas Lasila külas Lasila-Tamsalu- Saksi teeristi lähedal (geograafilised koordinaadid N ' E '). Tegemist on Lasila kruusakarjääri põhjapoolsel küljel asuva hariliku männi (P. ) saluga. Puude vanusevahemik on aastat. Kuna võrdlusandmestik (harliku männi vanus ca 15 aastat) on pärit Tartumaalt Külitselt (geograafilised koordinaadid N ' E '), siis valiti proovikoht sellest võimalikult kaugel. Lääne-Virumaa osutus sobilikuks piirkonnaks, kuna põhja pool Eestis ei ole varem D. septosporum i sporulatsiooni uuritud. Rolli mängis ka logistiliselt hea asukoht. Kuna proovikoht asub uurimistöö autori kodukandis, siis oli okkaproovide korjamine selle võrra lihtsam Metoodika Haigustunnustega okkaproove korjati neljalt-viielt puult ühe proovivõtu kohta. Seiret alustati 9. septembril Okkaproove ei korjatud alati kindlate ajavahemike järel, 23

24 vaid nii kuidas jõuti enamasti paari nädala tagant. Kokku korjati 15 proovi ja viimane okkaproov korjati 19. aprillil Võrdlusandmestik on koostatud Rein Drenkhani korjatud ning Kalev Adamsoni ja Katrin Jürimaa prepareeritud hariliku männi (P. ) okaste põhjal. Okkaproovid on korjatud ajavahemikus Proove on kogutud kord kuus ning kokku on võrdlusandmestikus üheksa proovi Okaste prepareerimine Okkad korjati steriilsetesse kilekottidesse ning säilitati Eesti Maaülikooli metsapatoloogia labori sügavkülmikus 20 C juures. Preparaadi valmistamisel eemaldati okkalt binokulaarluubi CETI (suurendusel 20 korda) all skalpelliga viljakehad ning asetati alusklaasile veetilka. Ühe preparaadi kohta valiti vähemalt kolmelt juhuslikult valitud okkalt kokku keskmiselt kuus viljakeha. Ühe proovikoti kohta tehti kolm preparaati Eoste loendamine D. septosporum i eoste loendamiseks kasutati valgusmikroskoopi Nikon Eclipse 50i suurendusel 600 korda ja pildistamiseks ning mõõtmiseks programmi NIS-Elements D (versioon , tootja Nikon, Japan). Eoste loendamisel kasutati ainult 60-kordse suurendusega objektiivi (ehk 600-kordset suurendust). Objektiivi ava ette keerati preparaadi peal juhuslik koht ja loendati ära kõik vaatevälja jäänud eosed selliselt saadi üks lugem ühelt preparaadilt. Kokku tehti ühelt preparaadilt kolm lugemit. 24

25 Eoste mõõtmine Paralleelselt eoste loendamisega teostati ka eoste mõõtmine, mis oli vajalik selleks, et võrrelda eoste parameetreid kirjanduses toodud arvudega. Eoste mõõtmisel tehti mikroskoobi all preparaadist juhusliku koha peal 600-kordse suurendusega foto ning mõõdeti kõikide fotole jäänud D. septosporum i eoste pikkused ja laiused mikromeetrites. Seejärel arvutati aritmeetiline keskmine ning leiti minimaalsed ja maksimaalsed pikkused ja laiused. Eoste mõõtmine teostati Lääne-Virumaalt Lasilast korjatud okkaproovide põhjal Liigispetsiifilise praimeri testimine Uurimistöö praktilise osa teises osas testiti DNA-põhist punavöötaudi liigispetsiifilist praimerit (DNA fragment, mis osaleb uuritava DNA amplifitseerimisel) (vt. Ioos et al., 2010) esmalt D. septosporum i, seejärel D. pini olemasolu hindamiseks. Selleks analüüsiti nii töö autori ja aastal korjatud kui ka Rein Drenkhani aastal ning Kai Kattai ja aastal korjatud okkaproove Materjal Kokku tehti DNA analüüs 120 proovile, millest 17 olid töö autori ning 103 Kai Kattai ja Rein Drenkhani poolt kogutud. Proovide seas oli nii sümptomaatilisi kui ka asümptomaatilisi okkaid. Peremeestaimedeks olid valdavalt männid (Pinus spp.), s.o. 81 proovi harilik mänd (P. ) ning 33 proovi eksootmännid. Kuus proovi olid teised okaspuu liigid: harilik kuusk (Picea abies), ebatsuuga (Pseudotsuga sp.) või nulud (Abies spp.). Töö autori poolt kogutud proovid korjati ajavahemikul ning valdavalt Lääne-Virumaalt, kuna sealt pärit andmed punavöötaudi leviku kohta olid puudulikud. Proove korjati juhuslikest männikutest kuni vanuseni 20 aastat aastal Rein Drenkhani poolt kogutud proovid on korjatud ajavahemikul

26 Kogutud proovide seast üritati töö jaoks välja valida igast Eesti maakonnast (samuti Lätist) vähemalt kaks proovi. Samas üritati teha valik nii, et aasta proovikohad ei kattuks aasta proovikohtadega. Põhjuseks asjaolu, et teist punavöötaudi tekitajat otsida võimalikult laialt alalt aastal Kai Kattai poolt kogutud proovid on korjatud ajavahemikul ning Kai Kattai poolt pruunvöötaudi liigispetsiifilise praimeri testimiseks välja valitud samal põhimõttel nagu aasta proovid: igast maakonnast on üritatud valida vähemalt kaks proovi (Kattai, 2012). Lisaks tehti viie Kai Kattai proovikogust pärit proovi puhul DNA analüüs eraldi nii pruunidele kui ka rohelistele okastele aastal kogutud proove kasutati töös kokku 59, aasta proove samuti 59 ning aastal kogutud proove 2. Graafiliselt on proovikohad, kust töös kasutatud okkaproovid pärinevad, näidatud joonisel 2.1 Joonis 2.1. Töös kasutatud okkaproovide päritolukaart. Rohelised täpid märgivad aasta, punased täpid aasta ning sinised täpid aasta proovikohti. Töös kasutatud okkaproovide päritolu maakondade kaupa on toodud tabelis

27 Tabel 2.1. Töös kasutatud proovide päritolu tabel. Tulbad 2 4 näitavad, mitu proovi on antud maakonnast pärit vastaval kalendriaastal. Sulgudes on proovide arv, millele tehti DNA analüüs roheliste okaste põhjal. Maakond Harjumaa 25 3 Hiiumaa 2 2 Ida-Virumaa 2 2 Jõgevamaa 2 (+1) 2 Järvamaa 1 2 Lääne-Virumaa Läänemaa 2 (+2) 2 Põlvamaa 2 1 Pärnumaa 2 2 Raplamaa 2 (+2) 2 Saaremaa 3 (+3) 2 Tartumaa 2 1 Valgamaa 4 Viljandimaa 2 (+2) 2 Võrumaa 5 Läti 10 Kokku 49 (+10) Metoodika Okkaproovide prepareerimine Sarnaselt Lääne-Virumaalt Lasilast D. septosporum i sporulatsiooni seire tarvis korjatud okastele kõigepealt prepareeriti kõik ja aastal korjatud okkaproovid (vt. peatükk ) ning vaadeldi seejärel 600-kordse suurenduse all kasutades selleks valgusmikroskoopi Nikon Eclipse 50i. Selle tulemusena märgiti üles, kas vaadeldud preparaadil oli näha D. septosporum i eoseid või ei olnud DNA eraldamine DNA eraldamine tehti ja aastal korjatud proovidele aastal korjatud proovide puhul oli DNA juba varem eraldatud. 27

28 Esimeses etapis valiti igast proovikohast korjatud okkaproovist 3-4 okast. Sealjuures eelistati ennekõike haigussümptomitega okkaid, nende puudumisel kasutati asümptomaatilisi okkaid. Seejärel lõigati okkad eelnevalt piirituses ja priimusel steriliseeritud kääridega paberi peale paarimillimeetristeks tükkideks ning valati seejärel Eppendorfi tuubidesse dubleerides igat proovi, s.t. ühest proovikohast korjatud okkad tükeldati kordusanalüüsi vajadusel kahte tuubi. Seejärel lisati tuubidesse umbes kolme millimeetrise läbimõõduga metallkuulikesi ning pandi need homogenisaatorisse (Retsch 400, GmbH, Germany), mille abil purustati okkad. DNA eraldati E.Z.N.A. Fungal DNA Mini Kit iga (Omega, Bio-Tek, USA) ja juba kindlaks määratud tootjapoolse protokolli alusel. Proovide segamiseks kasutati vorteksit VELP Scientifica Vortex Mixer (Classic), proovide kuumutamiseks inkubaatorit INCU-Line VWR ja tsentrifuugimiseks Eppendorf Centrifuge 5415 D tsentrifuugi. Ühe koguse (12 või 24 proovi) DNA proovide eraldamise protsess võttis aega ligikaudu poolteist tundi, mille jooksul pipeteeriti proove korduvalt ümber ning lisati neile protokolli täpsel järgimisel erinevaid komponente: FG1, FG2 ja FG3 puhvrit, isopropanooli, eelsoojendatud ja steriliseeritud vett, absoluutset etanooli, tasakaalustavat puhvrit, pesupuhvrit (wash buffer) ja elution puhvrit. Lõpptulemuseks saadi ribosomaalse DNA (rdna) segu, mis säilitati Eppendorfi tuubides sügavkülmikus temperatuuril 20 C kuni edasiste analüüsideni PCR-segu valmistamine Teises etapis toimus PCR-segu valmistamine, mis viidi läbi steriilsetes tingimustes BioSan UVC/T-AR UV-kabinetis. PCR-segu valmistamist puudutavad nüansid olid mõlema seeneliigi puhul samad ning toimusid sama protokolli alusel. Ainukeseks erinevuseks oli vastavate liigispetsiifiliste praimerite (Ioos et al., 2010 järgi) kasutamine kummagi seeneliigi puhul. PCR-segu valmistamiseks segati kõigepealt kokku algkomponendid (Tabel 2.2). Seejärel segati saadud segu mõni sekund vorteksil ning jaotati protokolli järgi võrdselt uutesse PCR-tuubidesse, kuhu lisati ka varem eraldatud DNA. 28

29 Tabel 2.2. Ühe PCR-segu proovi valmistamiseks vajalikud komponendid (Ioos et al järgi). Komponendi nimetus Kogus, µl 5 U/µl DNA polümeraas 0,2 HOT FIREPol 10x Buffer B mm MgCl 2 1,6 20 mm dntp segu 0,2 20 µm F-praimer 0,4 20 µm R-praimer 0,4 Destilleeritud vesi 13,2 DNA 2 Kokku 20 Iga proovikogumi kohta tehti ka üks kontrollproov, kuhu lisati DNA asemel 2 µl destilleeritud vett. Kontrollproov oli vajalik veendumaks PCR-segu puhtuses. Kui kontroll agaroosgeelis näitas nn. band i, oli järelikult mõni PCR-segu komponent saastunud ning valmistada tuli uus segu. Liigispetsiifilise praimeri töökindluse kontrollimiseks kasutati võrdlusena juba varem kindlaks määratud D. septosporum i DNA-proovi (EPS 59, korjatud Külitsest ) DNA amplifikatsioon Valmissegatud PCR-seguga tuubid asetati termotsüklerisse TProfessional Thermocycler (Biometra, Germany). PCR, mis kujutab endast meetodit DNA järjestuse amplifikatsiooniks, viidi läbi mõlema seeneliigi (D. septosporum i ja D. pini) puhul ühe ning sama kindlaks määratud protokolli alusel (Ioos et al. 2010) ja koosnes viiest etapist: 1) Eelkuumutamine temperatuuril 95 C (10 minutit) 2) DNA denaturatsioon temperatuuril 95 C (kokku 35 tsüklit, iga tsükkel 30 sekundit) 3) Praimerite seondumine temperatuuril 60 C (30 sekundit) 4) DNA ahela süntees temperatuuril 72 C (1 minut) 29

30 5) Lõppekstensioon temperatuuril 72 C (10 minutit) Geelelektroforees Kolmas etapp oli agaroosgeeli valmistamine ja PCR-produkti analüüs elektroforeesis spetsiaalsel elektroforeesiaparaadil. Agaroosgeeli valmistamisel kasutati agaroosi pulbrit SeaKem LE Agarose, millest segati kindla retsepti alusel kokku vedel segu, mida seejärel mikrolaineahjus kuumutati. Peale kuumutamist jahutati agaroosisegu uuesti maha ning valati elektroforeesi alusvannile, kuhu see mõneks ajaks tahenema jäeti. Tahenenud geeli sisse vajutati spetsiaalse kammiga nn. avad, kuhu pipeteeriti PCR-produktid ning pikkusmarker. Seejärel käivitati elektroforees, mis vältas pool tundi 100 V pinge juures Tulemuste pildistamine UV-transilluminaatoriga DNA-analüüsi viimases etapis tõsteti agaroosgeel elektroforeesiaparaadilt UVtransilluminaatorisse (Quantum-ST4-3026/WL/25M). Tulemuste pildistamine toimus lauaarvuti vahendusel programmiga Quantum ST4 Xpress. Kui saadud fotol oli geelis vastaval kõrgusel näha band i, siis oli analüüs positiivne, st. okkad, millest eraldati DNA, olid konkreetse seeneliigi poolt nakatunud. Ebaselgeid proove analüüsiti kaks korda. 30

31 3. TULEMUSED 3.1. Punavöötaudi tekitaja sporulatsioon Esimese okkaproovi puhul D. septosporum i eoseid ei täheldatud. Ilmselt oli nakatumisest liiga vähe aega möödunud, kuna vaadeldud okkad olid kollakasrohelised helepruunide vöötidega ning selgelt eristatavaid viljakehasid ei olnud märgata. Teiseks põhjuseks võis olla halb juhus koostöös korjaja kogenematu silmaga, mille tulemusena sattusid proovikotti asümptomaatilised okkad. Juba teise okkaproovi puhul, mis korjati kõigest nädal aega hiljem ehk 16. septembril 2012, oli eoste keskmine arvukus mikroskoobi vaatevälja kohta suurendusel 600 korda üks suuremaid 3,2 eost. Siis korjatud okkad olid kollakaspruunid tumedamate pruunikate vöötidega. Selgelt eristuvaid punaseid ristvööte oli okastel näha aga alles kolmandal proovivõtukorral 12. oktoobril 2012, mil okkad olid juba pruunid. Kuni sama aasta lõpuni oli D. septosporum i viljakehasid okastel palju ja neid oli lihtne eristada ning prepareerida. Eoste arvukus kulmineerus teise sporulatsiooni tipphetkega 27. detsembril Alates aasta 11. jaanuarist oli viljakehasid leida juba raskem. Üheks põhjuseks võis olla see, et suur osa nakatunud okastest oli selleks ajaks juba maha varisenud. Kolmas sporulatsiooni tipphetk oli 22. veebruar 2013 (s.o. talvel), kui eoste keskmine arvukus mikroskoobi vaateväljal (suurendusel 600 korda) oli keskmiselt 3,7. See ei olnud muidugi üllatav, kuna tuli sulaperiood ja viljakehadesse tekkisid uued eosed. Samas viljakehasid oli endiselt suhteliselt vähe. D. septosporum i eoste arvukuse muutus Lasilast korjatud proovide põhjal on kajastatud tabelis 3.1, kus esimene veerg näitab okkaproovi korjamise kuupäeva, veerud P1-P9 pildi numbrit, millelt eosed loendati ning viimane veerg eoste arvu aritmeetilist keskmist kõikidelt piltidelt kokku. Graafiliselt on eoste keskmise arvukuse dünaamika Lasila proovide põhjal toodud kuude kaupa joonisel

32 Tabel 3.1. D. septosporum i eoste arvukus loendatud mikroskoobi all preparaadilt suurendusel 600 korda (Lääne-Virumaalt Lasilast korjatud proovide põhjal) Kuupäev P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 Kesk , , , , , , , , , , , , , ,1 Keskmine eoste arv preparaadi kohta 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 sept-12 okt-12 nov-12 dets-12 jaan-13 veebr-13 märts-13 apr-13 mai-13 Kalendrikuu Joonis 3.1. D. septosporum i keskmine eoste arvukuse (preparaadi kohta suurendusel 600 korda) dünaamika kuude kaupa kaheksa kalendrikuu jooksul Lasila proovialal. 32

33 Võrdluseks kasutati Tartumaalt Külitselt kogutud D. septosporum i sporulatsiooni seire andmestikku (Tabel 3.2), kust selgub, et esimene sporulatsiooni tipphetk on olnud 19. septembril 2012, kui eoste keskmine arvukus mikroskoobi vaateväljal (suurendusel 600 korda) oli 3,1. Järgneva kolme kuu jooksul on eoste arvukus langenud, mis 7. detsembriks on saavutanud nulltaseme ning jäänud sinna püsima kuni 20. veebruarini. Teine sporulatsiooni tipphetk on jäänud märtsi algusesse 1,6 eost keskmiselt mikroskoobi vaatevälja kohta. Aprillis ja mais seevastu olulisemat sporulatsiooni ei ole toimunud. Tabel 3.2. D. septosporum i eoste arvukus loendatud mikroskoobi all preparaadilt suurendusel 600 korda (Tartumaalt Külitselt korjatud proovide põhjal) Kuupäev P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 Kesk , , , , ,3 Graafiliselt on eoste keskmise arvukuse dünaamika Tartumaalt Külitselt korjatud proovide põhjal toodud joonisel

34 Keskmine eoste arv Preparaadi kohta 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 sept-12 okt-12 nov-12 dets-12 jaan-13 veebr-13 märts-13 apr-13 mai-13 juuni-13 Kalendrikuu Joonis 3.2. D. septosporum i keskmine eoste arvukuse (preparaadi kohta suurendusel 600 korda) dünaamika kuude kaupa üheksa kalendrikuu jooksul Külitse proovialal. Võrreldes kahte graafikut on näha, et esimene sporulatsiooni tipphetk jääb mõlemal juhul septembri keskele ning kuni aasta lõpuni on eoste keskmine arvukus langeva trendiga. Ka teine sporulatsiooni tipphetk langeb kahes proovikohas enamvähem kokku alates Lasilas veebruari lõpus ning Külitsel märtsi alguses ehk 12 päeva hiljem. Samas ei tea, kas sporulatsioon võis Külitsel vahepeal veel hoogustuda, kuna proove on sealt korjatud suuremate ajavahede tagant. Seega ei saa kinnitada, et D. septosporum i sporulatsioon oleks põhjapoolsel proovialal varasem kui lõunas. Huvitav on siiski see, et eosed tekkisid viljakehadesse juba veebruaris ja märtsis, s.o. talvel Eoste mikromorfoloogilised tunnused Kuju poolest olid mõõdetud D. septosporum i eosed (Joonis 3.3) kas sirged või kergelt kaarjad ning ümarate ja kohati isegi kergelt teravnenud otstega. Eosed olid enamasti ühe või kahe (vahel ka kolme) vaheseinaga ning hüaliinsed. 34

35 Joonis 3.3. D. septosporum i eosed preparaadilt pildistatuna 600-kordse suurenduse all (Priit Kaare foto) Kokku prepareeriti selleks üheksa proovi, mis kõik korjati erinevatel ajahetkedel ajavahemikus Igast preparaadist tehti kolm fotot (kokku seega 27 fotot) ning mõõdeti kõik fotole jäänud eosed. Mõõtmise käigus saadud andmete põhjal arvutati eoste aritmeetiline keskmine ning minimaalne ja maksimaalne pikkus ja laius (Tabel 3.3). Tabel 3.3. D. septosporum i koniidide mõõtmed mikromeetrites Korjamise Foto 1 Foto 2 Foto 3 kuupäev Pikkus, µm Laius, µm Pikkus, µm Laius, µm Pikkus, µm Laius, µm ,25 2,13 23,64 2,01 27,39 2,71 23,77 2,21 30,07 2,17 25,21 2,55 26,42 2,76 32,56 2,34 26,98 2, ,17 2,75 23,14 2,55 22,64 2,45 25,23 2,56 18,55 2,63 25,71 2,62 30,99 2,25 23,64 2,61 27,02 2,86 35

36 16,61 2, ,29 2,44 22,06 2,08 15,27 3,1 25,77 2,21 19,23 2,47 23,84 2,07 21,34 2,23 24,71 2, ,1 2, ,34 25,98 2, ,68 2,22 21,95 2,34 22,15 2, ,05 2,25 19,32 2,66 25,11 2,38 26,4 2,3 17,43 2, ,64 2,69 24,72 2,88 15,31 2,67 26,09 3,22 22,51 2, ,4 2,65 21,98 2,51 15,88 1,73 19,24 2, ,3 2,05 26,88 2,5 27,23 2,24 Pikkus Laius Aritm. kesk. Min. Max. Aritm. kesk. Min. Max. 23,98 µm 15,27 µm 33,25 µm 2,46 µm 1,73 µm 3,22 µm Mõõtmise jaoks kasutatud fotod tehti eoste loendamise käigus ning kokku mõõdeti kõikide fotode peale 50 eost Männiokastel ja -käbidel esinevad teised seeneliigid Okaste prepareerimisel ja mikroskopeerimisel pöörati tähelepanu eelkõige D. septosporum i viljakehadele ja eostele, kuid üles märgiti ka mõned olulisemad kaasnevad seeneliigid: Cyclaneusma minus (valgevöötaudi tekitaja), Sclerophoma pythiophila (viljakehad on küllaltki sarnased D. septosporum i viljakehadele), Lophodermium seditiosum (männi-pudetõve tekitaja), Lophodermium pinastri, Cenangium ferruginosum ja Rosellinia obliquata (leitud hariliku männi ehk P. käbilt). 36