EE - EP B1 IL-17A ja IL-17F antagonistid ja meetodid nende kasutamiseks TEHNIKA TASE Tsütokiinid on väikesed lahustuvad proteiini

Suurus: px
Alustada lehe näitamist:

Download "EE - EP B1 IL-17A ja IL-17F antagonistid ja meetodid nende kasutamiseks TEHNIKA TASE Tsütokiinid on väikesed lahustuvad proteiini"

Väljavõte

1

2 EE - EP B1 IL-17A ja IL-17F antagonistid ja meetodid nende kasutamiseks TEHNIKA TASE Tsütokiinid on väikesed lahustuvad proteiinid, mis vahendavad erinevaid bioloogilisi toimeid, muu hulgas reguleerivad erinevat tüüpi rakkude kasvu ja muutumist (vt nt Arai et al., Annu. Rev. Biochem. 59:783 (1990); Mosmann, Curr, Opin. Immunol. 3:311 (1991); Paul Seder, Cell 76:241 (1994)). Tsütokiinide grupi moodustavad proteiinid, millede hulka kuuluvad interleukiinid, interferoonid, kolooniaid stimuleerivad faktorid, kasvaja nekroosi faktorid ja teised reguleerivad molekulid. Näiteks on inimese interleukiin-17 tsütokiin, mis stimuleerib interleukiin- 6, rakusisese adhesiooni molekul 1, interleukiin-8, granulotsüüdi-makrofaagi kolooniaid stimuleeriva faktori ja prostaglandiini E2 ekspressiooni ja mängib olulist rolli CD34+ vereloome eellasrakkude eelistatavas valmimises neutrofiilideks (Yao jt., J. Immunol. 155:5483 (1995); Fossiez jt., J Exp. Med. 183:2593 (1996)). Retseptorid, mis seovad tsütokiine, moodustuvad tüüpiliselt ühest või enamast integraalse membraani proteiinist, mis seob tsütokiini suure ühtivusega ja kannavad sidumiseprotsessi üle rakule läbi mõnede retseptorite alajaotuste tsütoplasma osade. Tsütokiini retseptorid on grupeeritud mitmetesse klassidesse, võttes aluseks sarnasusi nende rakuvälises ligandsideme alas. Varem näidatud tsütokiinide ja nende retseptorite in vivo aktiivsus kujutab kliinilist potentsiaali ja osutab vajadust teiste tsütokiinide, tsütokiini retseptorite, tsütokiini agonistide ja tsütokiini antagonistide järele. Näiteks kujutab näidatud põletikueelsete tsütokiinide perekonna in vivo aktiivsus väga suurt kliinilist võimalust ja vajadust põletikueelsete molekulide antagonistide järele. Rahvusvaheline patenditaotlus WO 2005/ tutvustab antikehasid ja väikesi molekule IL-17A ja IL-17F takistamiseks. Rahvusvaheline patenditaotlus WO 2005/ tutvustab kimäärse IL-17 retseptoreid ja nende ligandeid. Sellele vaatamata ei ole avaldatud midagi lahustuvate IL-17C ja IL-17F retseptorite kohta, mis seoks just IL-17A ja IL-17F.

3 2 EE - EP B1 JOONISTE LOETELU Joonised 1A ja 1B kujutavad graafiliselt inimese IL-17RCx1 (SEQ ID nr:2) ekson struktuuri. Nende aminohapete jaoks, milles koodon oli ühendatud ekson/intron seosega, liigutati ühendust selliselt, et see hõlmaks kogu koodonit. 5 Joonised 2A ja 2B kujutavad graafiliselt inimese IL-17RCx4 (SEQ ID nr:166). Joonis 3 kujutab graafiliselt inimese IL-17RA (SEQ ID nr:21) ekson struktuuri Joonised 4A ja 4B kujutavad graafiliselt käesoleva leiutise eelistatava lahustuva polüpeptiidi ekson struktuuri, mida kirjeldatakse siin ning järjestusnumbrites SEQ ID nr: 157 ja 158. Antud polüpeptiid sisaldab nii inimese IL-17RA (SEQ ID nr:21) kui inimese IL17RCx1 (SEQ ID nr:2) eksone. Joonis 5 kujutab graafiliselt näites 34 esitatud protokolli tüüpilist katsetulemust. Graafiku koostamiseks kasutati arvutiprogrammi Prizm. Y-väärtused kujutavad normaliseeritud keskmise fluorestsentsi indeksi (MFI) maksimumi ja miinimumi (100% ja 0%), mis põhineb ainult ligandiga ja ligandita, või lahustuva retseptorita kontrollaukudel ja seega ligandi rakkudega sidumise protsendil. Arvutiprogramm arvutab välja iga kõvera IC50. LEIUTISE DETAILNE KIRJELDUS Käesolev leiutis lahendab antud vajadusi, pakkudes antagoniste põletikueelsetele tsütokiinidele IL-17A ja IL-17F. Täpsemalt on põletikueelsetel tsütokiinidel IL-17A ja IL-17F kõrge järjestussarnasus, neil on palju ühiseid bioloogilisi omadusi ja mõlemaid moodustavad aktiveeritud T rakud. Mõlemad nimetatud tsütokiinid osalevad faktoritena mitmete autoimmuunsete ja põletikuliste haiguste (näiteks reumatoidartriidi või astma) arengus. Reagendid, mis pärsivad IL-17A toimet, on märgatavalt vähendanud haiguse esinemist ja tõsidust mitmete inimhaiguste hiirmudelite puhul. IL-17A annab oma toimet edasi interaktsioonis oma retseptoriga, milleks on IL-17 retseptor (IL-17R), kuid IL-17F retseptorit ei ole varem tuvastatud. Eelnevalt teatasime, et IL-17RC on nii IL-17A kui IL-17F retseptor ja seob mõlemat võrdselt kõrge afiinsusega. IL-17R seob aga IL-17A kõrge afiinsusega, kuid IL-17F väga madala afiinsusega. Sellega kooskõlaliselt on

4 3 EE - EP B1 näidatud, et IL-17R lahustuv vorm blokeerib IL-17A sidumist ja signaalülekannet rakkudes, milles esineb üks retseptoritest, kui ei sekku IL-17F sidumisse ega toimesse IL-17RC'ga Kuna IL-17A sekkumist on pakutud tõhusa ravina mitmete autoimmuunsete haiguste puhul, kasutades antud leiutise antagoniste, mis võivad blokeerida, takistada, vähendada, antagoniseerida või neutraliseerida nii IL-17A kui IL-17F tegevust, on sellel eeliseid ravivahendite ees, mille sihtmärgiks on ainult üks nimetatud tsütokiinidest. Leiutis pakub lisaks kasutust põletikuliste haiguste puhul ning samuti sellega seotud koostisi ja meetodeid. A) Ülevaade Immuunsusega seotud ja põletikulised haigused on avalduseks või tagajärjeks üsna keerukatele ja sageli mitmetele omavahel seotud bioloogilistele jadadele, mis normaalse füsioloogia puhul on olulised vastamaks kahjustustele, algatamaks kahjustuste paranemist ning korraldamaks kaasasündinud või omandatud kaitset võõrorganismide vastu. Haigus või patoloogia esineb juhul, kui need normaalsed füsioloogilised jadad põhjustavad lisakahjustusi kas otseses seoses vastuse intensiivsusega, ebanormaalse regulatsiooni või eksessiivse stimulatsiooni tagajärjel, reaktsioonina iseendale või eelpool nimetatud nähtuste kombinatsioonina. Ehkki nimetatud haiguste geneesiks tuleb sageli arvestada mitmeastmelise jadaga ja tihti ka mitme erineva bioloogilise süsteemi/jadaga, võib kriitilistel hetkedel sekkumisel olla parandav või raviv toime. Teraapiline sekkumine võib toimuda kas kahjustava protsessi/jada antagonismina või soosiva protsessi/jada stimulatsioonina. Tuntakse paljusid immuunsusega seotud haigusi, mida on ka ulatuslikult uuritud. Selliste haiguste hulka kuuluvad immuunvahendatud põletikulised haigused (näiteks reumatoidartriit, immuunvahendatud neerupõletik, maksa- ja sapihaigused, põletikuline soolehaigus (IBD), psoriaas ja astma), mitteimmuunvahendatud põletikulised haigused, nakkushaigused, immuunpuudulikkuse haigused, neoplaasia jne.

5 EE - EP B1 T lümfotsüüdid (T rakud) on imetajate immuunreaktsiooni oluliseks komponendiks. T rakud tunnevad ära antigeenid, mida seostatakse isekoostuva molekuliga, mida kodeerivad geenid suures koesobivuskompleksis (MHC). Antigeen võib esineda koos MHC molekulidega antigeeni sisaldavate rakkude, viirusnakkusega rakkude, vähirakkude või poogendite pinnal. T raku süsteem kõrvaldab need muundunud rakud, mis on ohtlikud peremees-imetaja tervisele. T rakkude hulka kuuluvad abistaja T rakud ja tsütotoksilised T rakud. Abistaja T rakud vohavad ulatuslikult pärast antigeen-mhc kompleksi äratundmist antigeeniga rakus. Abistaja T rakud eritavad ka erinevaid tsütokiine, nt lümfokiine, millel on tähtis osa B-rakkude, tsütotoksiliste T rakkude ja mõnede teiste immuunvastuses osalevate rakkude aktiveerimisel. Keskne sündmus nii humoraalses kui rakkude poolt vahendatavas immuunvastuses on abistaja T rakkude klonaalne paljunemine. Abistaja T raku aktiveerimise algatab T raku retseptorikompleksi (TCR)-CD3 interaktsioon antigeen-mhcga antigeeni sisaldava raku pinnal. See interaktsioon vahendab hulga biokeemiliste sündmuste jada, mis põhjustavad puhkava abistaja T raku sisenemise rakutsüklisse (üleminek G0-G1) ja selle tulemuseks on kõrge afiinsusega retseptori tootmine IL-2le ja mõnikord IL-4le. Aktiveeritud T rakk liigub läbi tsükli, kasvades kiiresti ja eristudes mälurakkudeks ja efektorrakkudeks. Lisaks TCR kaudu edastatavatele signaalidele kuulub T rakkude aktiveerimise juurde lisanduv kostimulatsioon, mille kutsuvad esile antigeeni sisaldava raku poolt või antigeeni sisaldava raku membraaniga seotud molekulide ja T raku vahelise interaktsiooni läbi vabastatud tsütokiinid. Tsütokiinide IL-1 ja IL-6 puhul on näidatud kostimuleeriva signaali andmist. Samuti mõjutab T raku aktiveerimist interaktsioon antigeeni sisaldava raku pinnal avalduva B7 molekuli ja T raku pinnal avalduvate CD28 ning CTLA-4 molekulide vahel. Aktiveeritud T rakkudel on kõrgenenud hulk rakuadhesiooni molekule nagu näiteks ICAM-1, integriinid, VLA- 4, LFA-1, CD56 jne. T rakkude paljunemine lümfotsüütide segakultuuris või lümfotsüütide segareaktsioonis (MLR) on tuntud märk komponendi võimest stimuleerida immuunsüsteemi. Paljude immuunvastuste puhul imbuvad põletikulised rakud kahjustuse või nakkuse kohta. Migreeruvad rakud võivad olla neutrofiilsed,

6 5 EE - EP B1 eosinofiilsed, monotsüütilised või lümfotsüütsed, nagu seda võib määratleda kahjustatud kudede histoloogilise uuringu järgi. (Current Protocols in Immunology, toim. John E. Coligan, 1994, John Wiley & Sons, Inc.) Immuunsusega seotud haigusi võib ravida immuunvastuse mahasurumisega. Lahustuvate retseptorite kasutamine ja/või immuunsust stimuleeriva aktiivsusega molekule inhibeerivate antikehade neutraliseerimine võib olla kasulik immuunvahendatud haiguste ja põletikuliste haiguste raviks. Immuunvastust takistavaid molekule (kas valkusid otse või antikehade antagonistide kaudu) saab kasutada immuunvastuse inhibeerimiseks ja seega immuunsusega seonduvate haiguste ravimiseks. Interleukiin-17 (IL-17A) on tuvastatud T lümfotroobi Herpese viirus Saimiri (HSV) poolt kodeeritud valgu raku ortoloogina (vt Rouvier et al., J. Immunol., 150(12): (1993); Yao et al., J. Immunol., 122(12): (1995), ja Yao et al., Immunity, 3(6): (1995)). Järgnev iseloomustus on näidanud, et antud valk on potentne tsütokiin, mis kutsub esile põletikueelseid vastuseid väga erinevatel perifeersetel kudedel. IL-17A on disulfiidsillaga seotud homodimeerne, ligikaudu 32 kda tsütokiin, mida sünteesivad ja sekreteerivad ainult CD4+aktiveeritud mälu T rakud (ülevaade: Fossiez et al., Int. Rev. Immunol., 16: (1998)). Täpsemalt on IL-17 sünteesitud 155 aminohappelise prekursor polupeptiidina, millel on N-otsa signaalisagedusega jääki ja seda sekreteeritakse kui disulfiidsillaga seotud homodimeerset glükovalku. IL-17A on avaldatud WO (1995), WO (1997) ning WO (1997) ja samuti USA patenditaotluses nr 6,063,372. Vaatamata piiratud koelevikule osutab IL-17A pleiotroopilist bioloogilist aktiivsust mitmete erinevat tüüpi rakkude puhul. On avastatud, et IL-17A stimuleerib paljude tsütokiinide tootmist. See kutsub esile IL-6, IL-8, IL-12, leukeemia inhibiitorfaktori (LIF), E2 prostaglandiini, MCP-1 ja G-CSF sekreteerimist kleepuvate rakkude poolt, nagu näiteks fibroplastid, keratinotsüüdid, epiteelsed ja endoteelsed rakud. IL-17A omab ka võimet kutsuda esile ICAM-1 pinnatootmist, T rakkude paljunemist ja kasvu ning inimese CD34.sup.+ eellasrakkude diferentseerumist neutrofiilideks. IL-17A osaleb luu metabolismis ja arvatavalt mängib see olulist rolli patoloogilistes tingimustes, mille omaduseks on aktiveeritud T rakkude esinemine ja TNF-.alfa.

7 EE - EP B1 tootmine, näiteks reumatoidartriidi või luuimplantaadi lõdvenemise puhul (Van Bezooijen et al., J. Bone Miner. Res. 14: (1999)). Leitud on ka, et reumatoidartriidi patsientidelt tuletatud sünoviaalkoe aktiveeritud T rakud sekreteerivad suuremal hulgal IL-17Ad kui antud rakud, mis on tuletatud tervetelt inimestelt või osteoartriidi patsientidelt (Chabaud et al. Arthritis Rheum. 42: (1999)). Pakuti, et antud põletikueelne tsütokiin toetab aktiivselt sünoviaalset põletikku reumatoidartriidi puhul. Lisaks oma põletikueelsele rollile tundub IL-17A reumatoidartriidi patoloogiale kaasa aitavat veel ühe mehhanismi läbi. Näiteks on IL-17A puhul avastatud, et see algatab osteoklasti eristumisfaktori (ODF) mrna osteoblastides (Kotake et al., J. Clin. Invest., 103: (1999)). ODF stimuleerib eellasrakkude eristumist osteoklastideks ehk luud resorbeerivateks rakkudeks. Kuna IL-17A tase on reumatoidartriidi patsientide sünoviaalvedelikus oluliselt kõrgenenud, selgub sellest, et IL-17A algatatud osteoklastide moodustamine omab otsustavat rolli reumatoidartriidi luuresorbeerimisel. Samuti arvatakse, et IL-17A mängib juhtrolli mõnede autoimmuunhäirete, näiteks hulgiskleroosi puhul (Matusevicius et al., Mult. Scler., 5: (1999)). Rakusisese signaalülekande kaudu on ka näidatud IL-17A võimet stimuleerida Ca-sup-2+ sissevoolu ja [camp] vähenemist inimese makrofaagides (Jovanovic et al., J. Immunol., 160:3513 (1998)). Fibroplastid, mida on töödeldud IL-17Aga, aktiveerivad NF-.kappa.B (Yao et al., Immunity, 3:811 (1995), Jovanovic et al., supra) ja IL-17Aga töödeldud makrofaagid aktiveerivad NF-.kappa.B ja mitogeen-aktiveeritud valgu kinaasid (Shalom-Barek et al., J. Biol. Chem., 273:27467 (1998)). Lisaks jagab IL-17A järjestussarnasust imetajate tsütokiinilaadse 7. faktoriga, mis osaleb luu ja kõhrekasvamises. IL-17A polüpeptiidid jagavad lisaks järjestussarnasust valkudega, nagu näiteks inimese embrüost tuletatud interleukiiniga seotud faktoriga (EDIRF) ja interleukiin-20ga. IL-17A laiaulatuslike mõjudega kooskõlaliselt on IL-17A rakupinnaretseptorit leitud paljudes koe- ja rakutüüpides (Yao et al., Cytokine, 9:794 (1997)). Kuna inimese IL-17A retseptori (IL-17R) aminohappejärjestus (866 aminohapet) ennustab ühe transmembraani domeeniga valku ja pikka, 525 aminohappelist rakusisest domeeni, siis on retseptori järjestus ainulaadne ja ei ole sarnane ühegi teise

8 EE - EP B1 tsütokiini/kasvufaktori retseptorite perekonna retseptoritega. Antud omadus koos sarnasuse puudumisega IL-17A ja teiste teada olevate valkudega näitab, et IL-17A ja selle retseptor võivad olla osad signaalvalkude ja -retseptorite uuest perekonnast. On tõendatud, et IL-17A aktiivsust vahendatakse läbi sideme tema ainulaadse rakupinna retseptoriga, kusjuures eelnevad uuringud on näidanud, et T rakkude viimine kontakti IL-17A retseptori polüpeptiidi lahustuva vormiga tõi kaasa T rakkude paljunemise ja PHA, konkanavaliin A ja anti-tcr monoklonaalse antikeha poolt esile kutsutud IL-2 tootmise (Yao et al., J. Immunol., 155: (1995). Seega on märkimisväärne huvi tuvastada ja iseloomustada uusi polüpeptiide, mis on sarnased tuntud tsütokiinide retseptorite ja iseäranis IL-17A retseptoritega. IL-17F tootmismuster tundub olevat sarnane IL-17A mustriga, milles sisalduvad ainult aktiveeritud CD4+ T rakud ja montsüüdid. (Starnes et al., J. Immunol. 167: (2001)). On tõestatud, et IL-17F indutseerib G-CSF, IL-6 ja IL-8 sidekoerakkudes (Hymowitz et al., EMBO J. 20: (2001)) ja TGF-b endoteelsetes rakkudes (Starnes et al., J. Immunol (2001)). Hiljuti on teatatud, et tsütokiini poolt toodetud dendriitrakk IL-23 võib vahendada nii IL- 17A kui IL-17F tootmist, peamiselt mälu T rakkudes (Aggarwal et al., J. Biol. Chem. 278: (2003)). Lisaks on näidatud nii IL-17A kui IL-17F ületootmist või kasvatamist artriidi ja astmahaigetel (ülevaade: Moseley et al., CytokineGrowth Factor Rev 14: (2003)). Artriidi suhtes käituvad need tsütokiinid kõhre ja liigese hävinemisele omaselt, mis on seotud reumatoid- ja osteoartriidiga. Näiteks on tõestatud, et IL- 17A ja IL-17F võimendavad maatriks destruktsiooni liigese kõhre eksplantaadis, vabastades kõhre proteoglükaan glükosaminoglükaane ja kollageeni fragmente, takistades samal ajal uute proteoglükaanide ja kollageenide sünteesi (Cai et al., Cytokine 16:10-21 (2001)), Attur et al., Arthritis Rheum 44: (2001). Sarnaselt IL-17A on näidatud, et IL-17Fi ületootmine hiirte puhul tõstab neutrofiilide kaasamist ja selle tulemuseks on Thl-iga seotud tsütokiinide (IL-6, IFN-gamma, IP-10 ja MIG) kõrgenenud tootmine kopsus (Starnes et al., J. Immunol. 167: (2001)). IL-17F kasvatati ka allergeeni suhtes uuritavate astmaatikute T rakkudes (Kawaguchi et al., J. Immunol. 167: (2001)), ja

9 8 EE - EP B1 leiti, et see kutsub esile IL-6 ja IL-8 tootmise NHBEs. Erinevalt IL-17Ast takistab IL- 17F angiogeneesi in vitro (Starnes et al., J. Immunol. 167: (2001)) IL-17F mrnad ei leitud paljude inimkudede northern plotis, kuid seda indutseeriti oluliselt CD4+ T rakkudeja monotsüütide aktiveerimisel. Leiti ka, et IL-17F aktiveerimisel avalduvad hiirte Th2 rakud ja tüvirakud. Vt Dumont, Expert Opin. Ther. Patents 13(3) (2003). Sarnaselt IL-17Aga leiti, et hiirte IL-17F tootmist kasvatab IL-23. IL-17 tsütokiin/retseptor perekonnad esindavad ainulaadset signaalsüsteemi tsütokiinide võrgustikus, mis pakub uuenduslikke lähenemisi immuunvastuste ja põletikuliste vastuste käsitlemisel. Sellega seoses põhineb antud leiutis uue IL-17 perekonna retseptori IL-17RC avastamisel ja selle retseptori võimel siduda nii IL- 17A kui IL-17F. IL-17RC tuvastati algselt kasutades bioinformatiivset lähenemist IL-17RAga seotud valkude leidmiseks ja tuvastati läbi cdna, mis kodeerib IL-17 retseptoriga seotud valku IL-17RC. Vaatamata tema ilmsele sarnasusele IL-17 retseptoriga (IL- 17RA), mis seob end IL-17 perekonna prototüüpse liikme IL-17Aga, ja veel viie IL- 17 tsütokiinide perekonna liikme tuvastamisele ei ole varem teatatud spetsiaalsest IL-17RC ligandist. Sellele vaatamata olid IL-17A ja IL-17F tuvastatud spetsiifiliste liganditena IL-17RC-le, nagu seda kirjeldatakse patenditaotluses US 11/150,533, 10 juuni 2005, avaldatud US Publications nr Täpsemalt on nimetatud ligandid tuvastatud hamstripoja neeru rakkudes (Baby Hamster Kidney BHK), mis sisestati stabiilselt rakkudesse, mis kodeerivad kas inimese IL-17RAd (hil-17ra) või IL-17RC'd (hil-17rc). Retseptorite avaldumist pinnal kinnitati FACS analüüsiga, kasutades kas hil-17ra monoklonaalset antikeha või hil-17rc polüklonaalset antiseerumit. Tsütokiini seose määramiseks kasutati inimese IL- 17A, C, D, E ja F biotinüleeritud vorme ja fluorokroom-seotud streptavidiini, et voolutsütomeetria abil avastada tsütokiinseoseid sisestatud rakkudega. Tulemused näitasid selgelt, et stabiilselt sisestatud BHK rakud, mis avalduvad hil-17ras, seovad ootuspäraselt inimese IL-17Ad (hil-17a), kuid need rakud, mis sisestatakse tühja ekspressioonivektoriga, ei seostunud ühegi katsealuse IL-17 perekonna liikmega. Täheldati ka inimese IL-17F (hil-17f) võrdlemisi nõrka sidumist hil-17ra kaudu sisestatud rakkudega, kuid teiste katsealuste IL-17

10 EE - EP B1 perekonna liikmetega ei esinenud olulist sidumist. Uuriti ka teiste IL-17 perekonna liikmete seostumist hil-17rc kaudu sisestatud rakkudega ja täheldati, et rakud sidusid märgatavalt hil-17fga. Lisaks täheldati ka olulist hil-17a sidumist nimetatud rakkudega, kuid hil-17c, D või E sidumist ei esinenud. Nimetatud andmed tõestasid, et hil-17rc on retseptor nii hil-17f kui hil-17a jaoks. Lisaks uuriti fluorestsentsi taset tsütokiini kontsentratsiooni saiti, et määratleda hil- 17A ja F suhtelisi afiinsusi hil-17ra ja hil-17rc suhtes. Võrreldes iga sisestaja individuaalsete tsütokiinide keskmisi fluorestsentsi intensiivsusi, täheldati, et hil- 17A seob oluliselt paremini hil-17rad kui hil-17f, kuid mõlemad tsütokiinid näisid siduvat võrdselt hästi hil-17rc kaudu sisestatud rakke. Huvitav on märkida, et tsütokiini sidumine rakkudega, mille juures avaldusid mõlemad retseptorid, tundus olevat täiendav ega andnud ühtegi märki koostööst. Järgmiseks uuriti märgistamata tsütokiini konkureeriva sidumise kaudu antud sidumise spetsiifilisust. Sisestatud BHK rakud inkubeeriti biotinüleeritud tsütokiini fikseeritud kontsentratsiooniga ja märgistamata tsütokiinide kasvava kontsentratsiooniga ning seejärel määrati seotud biotinüleeritud materjali kogus FACSi abil. Sellega näidati, et nii hil-17a kui F sidumine hil-17rc'ga oli spetsiifiline, kuna märgistamata tsütokiinide kasvav kontsentratsioon sekkusid biotinüleeritud materjaliga sidumisse. Tegelikult konkureerisid efektiivselt märgistamata hil-17a ja F mõlema tsütokiini biotinüleeritud vormide sidumisel hil- 17RC sisestatud rakkudega, oletades, et mõlemad tsütokiinid seovad hil-17rc sarnase afiinsusega ning et nad sidusid kattuvates, kui isegi mitte identsetes kohtades. Märgistamata hil-17a konkureeris efektiivselt nii biotinüleeritud hil-17a kui F sidumisele hil-17ra sisestatud rakkudega, märgistamata hil-17f ei näidanud üles mingit olulist võimet konkureerida hil-17a sidumiseks hil-17raga. See näitas, et kuigi hil-17f osutas spetsiifilist sidumist hil-17raga, oli nimetatud interaktsiooni tugevus madalam kui hil-17a ja hil-17ra interaktsioon. Viidi läbi ka küllastussidumise uuringud, et mõõta hil-17a ja F sidumise afiinsust hil-17rc ja hil-17raga. BHK raku liinid, mis avaldavad hil-17ra või hil-17rc, inkubeeriti jodeeritud hil-17a või F küllastussidumise tingimustes, et määratleda iga tsütokiini afiinsuskonstante iga retseptori kohta. hil-17a sidus nii hil-17ra kui hil-17rc'ga võrreldava afiinsusega (tabel 1). Täpsemalt kasutati näidatud

11 10 EE - EP B1 retseptoriga seotud BHK rakke, et määrata K d väärtused hil-17a ja hil-17f jaoks, nagu kirjeldatud Meetodites. Näidatud tulemused on kolmekordsetest määramisest tuletatud keskmised K d väärtused. Tabel Lisaks oli hil-17f afiinsus hil-17rc suhtes väga sarnane hil-17a afiinsusele selle retseptori suhtes (vt tabel 1 ülal). Kooskõlaliselt biotinüleeritud tsütokiinide kasutamisest saadud tulemustega on hil-17f afiinsus hil-17ra suhtes siiski ligikaudu 1000 volti madalam võrreldes teiste mõõdetud afiinsustega (ld.). See näitab, et hil-17a ja F seostuvad hil-17rc'ga sarnase afiinsusega, kuid nende afiinsused hil-17ra suhtes on oluliselt erinevad. Tulemus, et hil-17rc seondub nii hil-17a kui Fga kõrge afiinsusega, tähendab, et hil-17rc avaldavad rakud peaksid olema võrdselt suutelised vastama nii hil- 17Ale kui Fle. Teiselt poolt aga, kuna hil-17ra seondub hil-17aga kõrge afiinsusega, kui hil-17fga 1000 voldi võrra vähema afiinsusega, siis võib oletada, et rakud, mis avaldavad hil-17rad võivad füsioloogilisi tingimusi arvestades vastata ainult hil-17ale. Varasemalt on näidatud, et hil-17ra avaldub kõikjal olevana, kuid selle ekspressioon on kõrgem vereloome rakkudes ning madalam teistes kudedes. Seega uuriti hil-17rc avaldumist, et määratleda ekspressioonimustrite kattuvuste määra. Northern plot analüüs näitas, et hil-17rc avaldus kõrgel määral näärmekudedes, näiteks neerupealse nääre, eesnääre, maks ja kilpnääre, kuid selle avaldumist ei tuvastatud vereloome kudedes. Jätkamaks antud retseptorite ekspressiooni uuringuid vereloome rakkudes, uuriti ka biotinüleeritud hil-17a ja F sidumist vere perifeersete mononukleaarsete rakkudega (PBMC) multiparameetrilise FACS analüüsi abil. Tulemused osutasid, et hil-17a seob enam-vähem kõikide uuritud PBMC alahulkadega, kuid hil-17f ei näidanud mingit sidumist ühegi nimetatud populatsiooniga. See on kooskõlas

12 11 EE - EP B1 hil-17ra võimega siduda hil-17ad kõrge afiinsusega, kuid mitte hil-17f, ning võimega avastada PBMCdes hil-17rc nrna. See andmekogu osutab, et IL- 17RC on eelistatavalt avaldunud mitte-vereloomekudedes, kuid IL-17RA on eelistatavalt avaldunud just vereloome rakkudes Kõrge afiinsusega hil-17a ja F sidumine hil-17rc sisestatud rakkudega võimaldab oletada, et tõhus raviaine võiks olla hil-17rc lahustuv vorm. Selline molekul oleks tõhusaks antagonistiks neile kahele tsütokiinile. Selle otseseks väljaselgitamiseks toodeti inimese hil-17rc lahustuv vorm FC-liitvalguna ja katsetati selle võimet inhibeerida nii hil-17a kui F sidumist. Neid mõjusid võrreldi hil-17ra lahustuva vormi kasutamise tulemustega. hil-17rc-lg või hil-17rc-lg kasvavad kontsentratsioonid lisati sidumisreaktsioonidele ja seejärel kasutati FACS analüüsi, et hinnata lahustuvate retseptorite mõju biotinüleeritud tsütokiinide sidumisele stabiilselt sisestatud BHK rakkudega. Lahustuv hil-17rc inhibeeris nii hil-17a kui F sidumist sarnasel määral, kuid ühe teise hil-17r perekonna liikme Fc-liitvalk hil-17rd ei omanud mingit mõju. Teiselt poolt blokeeris hil-17ra efektiivselt hil-17a sidumist, kuid ei omanud mingit olulist mõju hil-17f sidumisele. Sarnaseid tulemusi saadi hil-17a sidumise katsetest vereloomerakkudes. Antud seost blokeeriti efektiivselt, kasutades hil-17ra-lg ja hil-17rc-lg, kuid mitte hil-17rd-lg. Nimetatud andmed on kooskõlas afiinsuse mõõtmistulemustega ja osutavad, et lahustuvad retseptorid käituvad samamoodi nagu nende membraan-ankurdatud vormid. Veel ühe võimalusena hinnata inimese hil-17rc-lg võimet siduda hil-17a ja F hinnati Biacore analüüsi abil nimetatud tsütokiinide lahustuvate retseptorite afiinsust. Lahustuv hil-17rc sidus nii hil-17a kui F kõrge afiinsusega (tabel 2), toetades ideed kasutada seda reagenti nii hil-17a kui F in vivo antagonistina. Täpsemalt võeti lahustuvad retseptorid kiibile ja viidi läbi sidumiskatsed, nagu kirjeldatud allpool: ND = ei tuvastatud sidumist. Tabel 2

13 12 EE - EP B Splaissvariantide hulk inimestel on hulga suurem, ja seega me viisime läbi oma algsed katsed üksnes nende molekulide alahulkadega. Antud analüüsiks valitud alahulgad erinesid üksteisest ka ekson 7 kaasaarvamise või väljaarvamise poolest, kuid erinevalt hiirtest kaasasid kõik splaissvariandid ekson 8. Hiire ekson 8 järjestuse keskel leiduvat krüptilist splaissakseptorit ei esine inimese 8 eksonis. Teised katsealused splaissvariandid aga kas kaasasid või välistasid hil-17rc ekson 12. Nimetatud variandid tähistati hil-17rcx1 (identne ülalmainitud hiire x1 eksonkompositsiooniga), hil-17rcx4 (identne ülalmainitud hiire x4 eksonkompositsiooniga), hil-17rcx2 ja hil-17rcx7. Needki splaissvariandid avaldusid 293F rakkudes ja uuriti nende võimet siduda hiire ja inimese biotinüleeritud hil-17a ja F, mille tulemused on näha tabelis 3.

14 13 Tabel 3 EE - EP B Kooskõlaliselt varem esitatud katsetega sidus hil-17rcx1 nii hil-17a kui F, kuid ei sidunud kumbagi hiire tsütokiini. hil-17rcx4 sidus ka mõlemat inimese tsütokiini ja sarnaselt hiire analoogiga sidus ta mil-17f, kuid mitte mil-17a. hil-17rcx2 ja x7 ei sidunud ühegagi katsealustest tsütokiinidest, kuigi nad olid selgelt avaldunud sisestatud rakkude pinnal, kuna hil-17rc vastane polüklonaalne antiseerum värvis CD8 + rakke (andmeid ei ole näidatud). Antud sidumistulemusi korrati edukalt ka stabiilselt sisestatud BHK rakkude puhul. Nimetatud andmekogu toetab järeldusi, mis puudutavad vajalikku hulka IL-17RC valku, mis on nõutav inimese tsütokiinide sidumiseks. Mitmed artiklid kaasavad IL-17A ja vähemal määral ka IL-17F haiguse arengule ja tõsidusele kaasa aitavana hiire kollageen-indutseeritud artriidis (CIA) ja inimese reumatoidartriidis. Antud mil-17a ja F ekspressioone uuriti CIA indutseerimiseks kollageeniga immuniseeritud hiirte liigestes või lümfisõlmedes (DLN). Reaalaja PCR analüüs näitas selgelt, et mõlemaid tsütokiine kasvatati haigestunud hiirte mõlemas koes immuniseerimata kontrollgrupiga võrreldes, osutades selgelt, et ekspressioon on haigusega korrelatsioonis. Lisaks uuriti samades kudedes mil- 17RA ja mil-17rc suhtelist ekspressiooni. Nimetatud juhul aga ei olnud ekspressiooni reprodutseerivat korrelatsiooni haigusega kummagi retseptori puhul. Veelgi enam, oli ilmne, et esines lahknevus ekspressioonis DLN võrdluses mittevereloomekudedega (tagajalas). Kooskõlaliselt eelnevate tulemustega inimese retseptorite ekspressiooni kohta leiti mil-17ra olevat kõrgema ekspressiooniga vereloomekoes ja mil-17rc kõrgema ekspressiooniga mitte-vereloomekoes. Need andmed võimaldavad oletada, et mil-17a ja mil-17f ekspressioon on

15 14 EE - EP B1 korrelatsioonis haigusega ning et mõlemad nõutavad retseptorid esinevad haigestunud ja terves koes ja võimaldab oletada, et need tsütokiinid võivad olla tõhusaks raviks haiguse arengu ärahoidmisel Seega on näidatud, et IL-17A ja F sugulasretseptoriks on IL-17RC. Täpsemalt, hil-17rc seob hil-17a ja F sarnase afiinsusega. Kuna need kaks IL-17 perekonna liiget jagavad 55% järjestussarnasust, ei ole ilmselt üllatuseks, et nad jagavad ka retseptoreid. Siiski tuleb märkida, et hil-17ra seob hil-17a kõrge afiinsusega, kuid hil-17f afiinsusega, mis on ligikaudu 1000 volti madalam, võimaldades oletada, et vastavate füsioloogiliste tingimuste puhul hil-17ra ei seoks hil-17f. Järeldus on, et rakud, mis avaldavad hil-17rc, peaksid vastama nii hil-17a kui Fle, kuid rakud, mis avaldavad ainult hil-17ra, vastavad ainult IL- 17Ale. Sellel erinevusel on potentsiaal mõjutada seda, kuidas tsütokiinid mõjutavad erinevaid kudesid. Ekspressioonianalüüsi kaudu näidati, et kuigi IL- 17RA avaldub kõikjal olevana, on ta rohkem avaldunud vereloomerakkudes, kuid IL-17RC on pigem avaldunud mitte-vereloomekudedes ega avaldu üldse vereloomerakkudes. Sellega kooskõlaliselt seovad kõik inimese perifeersete mononukleaarsete vererakkude alahulgad hil-17aga, kuid ei seo hil-17fga. Lisaks lubab see oletada, et mitte-vereloomekoed peaksid vastama nii IL-17Ale kui Fle, kuid vereloomerakud peaksid vastama ainult IL-17Ale. Antud katse tsütokiinide sidumise kohta erinevate IL-17RC splaissvariantidega on toonud esile kaks hulka retseptoreid, mis on tsütokiinide sidumiseks peamised, kusjuures on vaevu märgatavad erinevused inimeste ja hiirte tsütokiinide sidumiste omadustes. Lisaks on need omadused kooskõlalised tsütokiinide kohta sõltumata uuritud retseptori liigist. Tabelis 3 esitatud andmete järgi on ekson 12 ja kogu ekson 8 vajalikud h IL-17A ja F sidumiseks IL-17RC'ga, kuna need tsütokiinid seovad ainult inimese x1 variante ja inimese x4 variante. Iga isovorm sisaldab ekson 8 ja ekson 12, kuigi nad erinevad selles, kas ekson 7 on kaasatud või mitte. Sellest järeldub, et ekson 7 ei ole vajalik inimese tsütokiinide sidumiseks. IL-17A ja IL-17F funktsioonile ühise antagonisti loomise olulisus tundub seega ilmne, otsustades kättesaadava informatsiooni põhjal, mis näitab tugevat korrelatsiooni IL-17A ja F ekspressiooni ja mitmete autoimmuunsete ning põletikuliste haiguste arengu vahel. Nimetatud tsütokiinid kutsuvad esile

16 15 EE - EP B1 põletikulisi tsütokiine ja kemokiine ning maatriks metalloproteaase, mis panustavad autoimmuunse artriidi kollageeni ja luudestruktsiooni. Antud reagent peaks olema tõhus raviaine reumatoidartriidile ja teistele põletikulistele haigustele, milles osalevad hil-17a ja F Seega arendati välja inimese IL-17RC lahustuvad vormid, et neid kasutada nii IL- 17A kui IL-17F antagonistidena. Antud lahustuvad IL-17RC polüpeptiidid olid ravimiseks tõhusad. Sellele vaatamata ei sekreteerunud mitmete asjaolude tõttu IL-17RC kergesti paljudes erinevates tootmissüsteemides, mis on praeguses tehnoloogias kättesaadavad. Samuti ei sekreteerita seda adekvaatsel hulgal, mis on tootmiseks vajalik. Seetõttu esineb tehnoloogias vajadus arendada välja antagonistid IL-17Ale ja IL-17Fle, mida saaks avaldada ja sekreteerida tootmiseks vajalikes kogustes. Seega vastab käesolev leiutis vajadusele pakkuda avalduvaid ja sekreteeruvaid IL-17A ja IL-17F antagoniste. Täpsemalt põhineb antud leiutis isoleeritud lahustuva, polüpeptiidi avastamisel ja arendamisel, mis kaasab IL-17RC eksoneid 8-16 (aminohappe jäägid järjestusest SEQ ID nr:2) ja IL-17RA eksoneid 1-6, kusjuures nimetatud lahustuv polüpeptiid seostub spetsiifiliselt IL-17A ja IL- 17Fga. Selliselt on IL-17F ja IL-17A antagonistide, nagu näiteks käesoleva leiutise lahustuvad retseptorid IL-17RC/IL-17RA, tegevus kasulik põletikuliste haiguste ravimiseks, iseäranis seetõttu, et nii IL-17F kui IL-17A antagonistid, kas eraldi või mõlemad koos, kaasavad ravis antud molekule. Lisaks on IL-17F ja IL-17A antagonistide tegevus kasulik teiste põletikuliste haiguste ravimiseks, näiteks sidudes, blokeerides, inhibeerides, vähendades, antagoniseerides või neutraliseerides IL-17F ja IL-17Ad (kas koos või eraldi), ravides psoriaasi, kontaktdermatiiti, põletikulise soolehaiguse, ärritatud soole sündroomi (IBS), koliiti, artriiti, reumatoidartriiti, astmat, kroonilist obstruktiivset kopsuhaigust (KOK), põletikulisi soolehaigusi, näiteks haavandilist koliiti või Crohni tõbe, hulgiskleroosi, organi siiriku tagasilükkamist ja siirdatud neeru, kopsu, südame jne tagasilükkamist. Tsütokiinide retseptorite alaüksuseid kirjeldatakse kui multidomeenseid struktuure, mis kaasavad ligandsideme domeeni ja efektordomeeni, mis on tüüpiliselt

17 EE - EP B1 kaasatud signaalülekandes. Multimeersete tsütokiini retseptorite hulka kuuluvad monomeerid, homodimeerid (nt PDGF retseptor αα ja ββ isovormid, erütropoetiinretseptor, MPL (trombopoetiinretseptor) ja G-CSF retseptor), ning multieerid, millel on ühitamatute funktsioonidega alaüksused (nt IL-2, IL-3, IL-4, IL- 5, IL-6, IL-7 ja GM-CSF retseptorid). Mõned retseptorite alaüksused on ühised paljudele retseptoritele. Näiteks AIC2B alaüksus, mis ei saa iseseisvalt siduda ligandit, kuid see sisaldab rakusisest signaalülekande domeeni, on IL-3 ja GM- CSF retseptorite komponent. Paljusid tsütokiinide retseptoreid võib nende struktuuride ja funktsioonide põhjal paigutada ühte neljast seotud perekonnast. Klass 1 vereloome retseptoreid näiteks kirjeldatakse konserveeritud tsüsteiinijääkide sisaldava domeeni olemasolu ja WSXWS motiivi alusel. Mõnedes vereloome retseptorites esinevad lisadomeenid, mis sisaldavad proteiinkinaasi domeene; fibronektiin tüüp III domeenid; immunoglobuliindomeenid, mida kirjeldatakse disulfiid-seotud kordustega. Tsütokiinide retseptorite struktuure on tutvustanud Urdal, Ann. Reports Med. Chem. 26: , 1991, ja Cosman, Cytokine 5:95-106, Üldiselt arvatakse, et organismidele selektiivse surve avaldamisel saada uusi bioloogilisi funktsioone on esile kerkinud uued retseptorperekondade liikmed, mis on tekkinud olemasolevate retseptorgeenide duplitseerimisel, mis on viinud multigeensete perekondade tekkimiseni. Seega kuulub perekonna liikmete hulka eellasgeeni jääke ning neid iseloomulikke omadusi võib kasutada lisanduvate perekonnaliikmete eristamisel ja tuvastamisel. Järelikult on käesolev leiutis suunatud isoleeritud lahustuvale polüpeptiidile, mille hulka kuuluvad IL-17RC eksonid 8-16 (aminohappe jäägid järjestusest SEQ ID nr:2) ja IL-17RA eksonid 1-6, kusjuures nimetatud lahustuv polüpeptiid seob spetsiifiliselt IL-17A ja IL-17Fga. IL-17RC retseptoril on suur hulk splaissvariante, mis põhinevad kas spetsiifiliste eksonite kaasa- või väljaarvamisel. Nagu allpool kirjeldatakse, on mõned nendest eksonitest vajalikud ligand (IL-17A ja/või IL-17F) sidumiseks. 30 Käesolev leiutis põhineb osaliselt strukturaalse sarnasuse avastamisel ( domeenid ) IL-17RC ja teiste IL-17 perekonna liikmete vahel, nagu näiteks IL- 17RA (SEQ ID nr.21). Täpsemalt on tuvastatud kolm domeeni:

18 EE - EP B1 1) Domeen 1 (SEQ ID nr:159 ja 160) sisaldab IL-17RC eksone See vastab IL-17RCx1 aminohappejääkidele järjestusest (SEQ ID nr:2) ja IL-17RCx4 aminohappejääkidele järjestusest (SEQ ID nr:166). 2) Domeen 2 (SEQ ID nr:161 ja 162) sisaldab IL-17RC eksone See vastab IL-17RCx1 aminohappejääkidele järjestusest (SEQ ID nr:2) ja IL-17RCx4 aminohappejääkidele järjestusest (SEQ ID nr:166). 3) Domeen 3 (SEQ ID nr:163 ja 164) sisaldab IL-17RC eksone See vastab IL-17RCx1 aminohappejääkidele järjestusest (SEQ ID nr:2) ja IL-17RCx4 aminohappejääkidele järjestusest (SEQ ID nr:166). Käesolev leiutis pakub ka lahustuvat polüpeptiidi antud leiutise järgi, mida saab kasutada inimese põletikuliste ja autoimmuunsete haiguste puhul. Lahustuv polüpeptiidi antud leiutise järgi võib kasutada nii IL-17A kui IL-17F tegevuse blokeerimiseks, inhibeerimiseks, vähendamiseks, antagoniseerimiseks või neutraliseerimiseks, ravides põletikku ja põletikulisi haigusi, näiteks psoriaasi, reumatoidartriiti, IBD, IBS, koliiti, astmat, organi siiriku tagasilükkamist, hulgiskleroosi ja teisi põletikulisi haigusi, mida siin avaldatakse. Illustreerivat nukleotiidijärjestust, mis kodeerib inimese IL-17RC ( IL-17RCx1 ), pakub järjestus SEQ ID nr:1; kodeeritud polüpeptiidi näidatakse järjestuses SEQ ID nr:2. IL-17RC toimib retseptorina nii IL-17A (SEQ ID nr:13 ja 14) kui IL-17F (SEQ ID nr:15 ja 16) suhtes. IL-17RC võib käituda monomeerina, homodimeerina või heterodimeerina. Lahustuva polüpeptiidi juurde antud leiutise järgi kuulub IL- 17RC ja osad IL-17RAst ( IL-17RC/IL-17RA ), nagu kirjeldatakse käesolevas taotluses. Seega hõlmab antud leiutis lahustuvaid retseptoreid, mille hulka kuuluvad portsjonid IL-17RC kombineerituna IL-17RAga. IL-17RC tutvustatakse ühisomanduses olevas patenditaotluses US 10/458,647 ja ühisomanduses olevas avaldatud WIPO patendis WO 01/ IL-17RC (SEQ ID nr:1) kodeeriva inimese cdna klooni analüüs näitas transkribeeritavat järjestust, mis kodeerib 692 aminohapet (SEQ ID nr:2), mis hõlmab ligikaudu 20 aminohappejäägi oletatavat signaaljärjestust (aminohappejäägid 1 kuni 20 järjestusest SEQ ID nr:2), ligikaudu 431 aminohappejäägi rakuvälist ligandsidumise domeeni (aminohappejäägid järjestusest SEQ ID nr:2; SEQ ID nr:3), ligikaudu 20 aminohappejäägi transmembraanset domeeni (aminohappejäägid järjestusest SEQ ID nr:2)

19 18 EE - EP B1 ja ligikaudu 203 aminohappejäägi rakusisest domeeni (aminohappejäägid järjestusest SEQ ID nr:2). Lisaks esitatakse ligandsidumise domeeni järjestuses SEQ ID nr: Järjestus SEQ ID nr:4 pakub veel ühte illustreerivat nukleotiidjärjestust, mis kodeerib varianti inimese IL-17RC'st, mida märgistatakse IL-17RC-1, ja kodeeritud polüpeptiidi näidatakse järjestuses SEQ ID nr:5. IL-17RC-1 tutvustatakse ühisomanduses olevas patenditaotluses US 10/458,647 ja ühisomanduses olevas avaldatud WIPO patendis WO 01/ Järjestuse analüüs näitas, et IL-17RC-1 kärbitakse retseptor polüpeptiidist. See tähendab, et IL-17RC-1 puuduvad aminohappejäägid järjestusest SEQ ID nr:2. SEQ ID nr:10 esitab IL-17RC-1 polüpeptiidi aminohapete järjestust, mis sisaldab IL-17RC N-otsa osa. IL-17RC ja IL-17RC-1 aminohapete järjestuste võrdlemine näitas samuti, et mõlemad polüpeptiidid esitavad alternatiivselt splaissvariante. IL-17RC aminohapete järjestusse kuulub 17 aminohappe lõiku (aminohappejäägid järjestusest SEQ ID nr:2), mis puuduvad IL-17RC-1'l, seevastu IL-17RC puudub 479 aminohappele järgnevalt 13 aminohappe lõik, mis leidub IL-17RC-1's (aminohappejäägid järjestusest SEQ ID nr:5). Polüpeptiidi, mis sisaldab mõlemat aminohapete lõiku, pakub järjestus SEQ ID nr:11, kuid järjestus SEQ ID nr:12 pakub polüpeptiidi aminohapete lõiku, millel puuduvad nii 13 kui 17 aminohapete lõigud. Järgmist illustreerivat nukleotiidijärjestust, mis kodeerib inimese IL-17RC varianti ja mida tähistatakse IL-17RC-6, pakub järjestus SEQ ID nr:23, kodeeritud polüpeptiidid näitab järjestus SEQ ID nr:24. IL-17RC-6 sisaldab 25 aminohappejäägi kustutust, võrrelduna järjestuse SEQ ID nr:2 IL-17RC'ga. Täpsemalt ei sisalda IL-17RC-6 aminohappejääke 94 kuni 118 järjestusest SEQ ID nr:2. IL-17RC-6 (SEQ ID nr:223 kodeeriva inimese cdna klooni analüüs tõi esile ligikaudu 427 aminohappejäägi pikkuse rakuvälise ligandsideme domeeni (aminohappejäägid järjestusest SEQ ID nr:24), ligikaudu 20 aminohappejäägi transmembraanse domeeni (aminohappejäägid järjestusest SEQ ID nr:24) ja ligikaudu 218 aminohappejäägi rakusisese domeeni (aminohappejäägid järjestusest SEQ ID nr:24).

20 5 19 EE - EP B1 Järgmist illustreerivat nukleotiidijärjestust, mis kodeerib hiire IL-17RC varianti, pakub järjestus SEQ ID nr:25; kodeeritud polüpeptiidi näitab SEQ ID nr:26. Hiire IL-17RC toimib retseptorina nii IL-17A (SEQ ID nr:17 ja 18) ja hiire IL-17F (SEQ ID nr:19 ja 20). IL-17RC kodeeriva hiire cdna klooni (SEQ ID nr:25) analüüs tõi esile ligikaudu 449 aminohappejäägi rakuvälise ligandsidumise domeeni (SEQ ID nr:27). Lisaks esitab ligandsidumise domeeni järjestus SEQ ID nr:28. Järgmist illustreerivat nukleotiidijärjestust, mis kodeerib hiire IL-17RC, pakub järjestus SEQ ID nr:29; kodeeritud polüpeptiidi näitab järjestus SEQ ID nr: IL-17RC geen paikneb kromosoomis 3p25 3p24. Nagu alljärgnevalt väidetakse, on see piirkond seotud erinevate häirete ja haigustega. Northern spot analüüs näitab tugeva IL-17RC geeni ekspressiooni kilpnäärme, neerupealse näärme, eesnäärme ja maksa kudedes ja väiksemat ekspressiooni südame, peensoole, mao ja hingetoru kudedes. Seevastu on ekspressioon väga väike või olematu ajus, platsentas, kopsus, skeletilihastes, neerus, kõhunäärmes, põrnas, tüümuses, munandis, munasarja rakus, käärsooles, perifeerse vere leukotsüütides, selgroos, lümfisõlmes ja luuüdis. Need tulemused näitavad, et IL- 17RC järjestusi võib kasutada erinevate kudede eristamiseks. Käesolev leiutis kaasab ka isoleeritud nukleiinhappemolekule, mis kodeerivad antud leiutise järgset isoleeritud polüpeptiidi. 20 Need ja teised leiutise omadused saavad selgeks järgnevate detailsete kirjelduste kaudu. Lisaks on mitmeid mõisteid järgnevalt defineeritud. B) Definitsioonid Järgnevas kirjelduses kasutatakse laialdaselt suurt hulka termineid. Järgnevalt pakume mõningaid definitsioone leiutise paremaks mõistmiseks. 25 Nukleiinhape või nukleiinhappemolekul tähistab siinses kasutuses polünukleotiide nagu deoksüribonukleiinhape (DNA) või ribonukleiinhape (RNA), oligonukleotiide, polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) fragmente ja ligandi, lõikamise, endonukleaaside ja eksonukleaaside tegevuse poolt loodud fragmente. nukleiinhappemolekulid võivad moodustuda monomeeridest, mis on naturaalselt

21 EE - EP B1 esinevad nukleotiidid (nagu DNA ja RNA) või naturaalselt esinevate nukleotiidide analoogid (nt α-enantiomeeriline vorm naturaalselt esinevatest nukleotiididest) või kombinatsioonist mõlemast. Muudetud nukleotiidid võivad omada teisenemisi suhkru fragmentides ja/või pürimidiini või puriini põhistes fragmentides. Suhkru teisendite hulka kuuluvad näiteks ühe või enama hüdroksüüligrupi asendamine halogeenidega, alküülgruppidega, amiinidega ja asiidgruppidega, või suhkrud võivad toimida kas eetritena või estritena. Lisaks võib asendada kogu suhkru fragmenti steeriliselt ja elektrooniliselt sarnaste struktuuridega, nagu näiteks asasuhkrud ja karbotsüklilise suhkru analoogid. Näideteks muudatustest algses individuaalühendis on alküleeritud puriinid ja pürimidiinid, aküleeritud puriinid või pürimidiinid või teised tuntud heterotsüklilised asendajad. Nukleiinhapete monomeerid võivad olla seotud fosfodiestersidemetega või antud sidemete analoogidega. Fosfodiestersidemete analoogide hulka kuuluvad fosforotioaat, fosforamidaat ja teised sarnased sidemed. Termin nukleiinhappemolekul kaasab samuti nii-nimetatud peptiid nukleiinhapped, millede juurde kuuluvad naturaalselt esinevad või muundatud nukleiinhappe alused, mis on seotud polüamiidi põhiahelaga. Nukleiinhapped võivad olla kas üheahelalised või kaksikahelalised. Termin nukleiinhappemolekuli täiend tähistab nukleiinhappemolekuli, millel on täiendav nukleotiidjärjestus ning pööratud suund võrreldes vastava nukleotiidjärjestusega. Näiteks on järjestus 5' ATGCACGGG 3' täiendiks järjestusele 5' CCGTGCAT 3'. Termin kõdunud nukleotiidjärjestus tähistab nukleotiidide järjestust, millesse kuulub üks või enam kõdunud koodonit, võrreldes vastava nukleiinhappemolekuliga, mis kodeerib polüpeptiidi. Kõdunud koodonid sisaldavad erinevat nukleotiid-tripletti, kuid kodeerivad sama aminohappejääki (st GAU ja GAC tripletid kodeerivad mõlemad Asp'i). Termin struktuurgeen tähistab nukleiinhappemolekulile, mida transkribeeritakse maatriks-rnasse (mrna), mis seejärel transleeritakse aminohapete järjestuseks, mis on omane mingile kindlale polüpeptiidile. 30 Isoleeritud nukleiinhappemolekul on nukleiinhappemolekul, mis ei ole integreeritud organismi genoomilisse DNAsse. Näiteks on DNA molekul, mis

22 5 21 EE - EP B1 kodeerib kasvufaktorit, mis on eraldatud raku genoomilisest DNAst, isoleeritud DNA molekul. Teiseks näiteks isoleeritud nukleiinhappemolekulist on keemiliselt sünteesitud nukleiinhappemolekul, mis ei ole integreeritud organismi genoomi. nukleiinhappemolekul, mis on isoleeritud kindlast liigist, on väiksem kui antud liigist pärineva kromosoomi kogu DNA molekul. nukleiinhappemolekuli ahel on kas üheahelaline või kaksikahelaline nukleiinhappemolekul, mida on muudetud inimese sekkumisel, et antud molekul sisaldaks lõikusid nukleiinhappest, mida on kombineeritud ja kõrvutatud looduses mitteesineva asetusega Lineaarne DNA tähistab mitte-tsirkulaarseid DNA molekule, millel on vabad 5' ja 3' otsad. Lineaarset DNAd võib valmistada kas ensüümse digestiooni või füüsilise sekkumise kaudu suletud tsirkulaasetest DNA molekulidest, nagu näiteks plasmiidid. Komplementaarne DNA (cdna) on üheahelaline DNA molekul, mis on moodustatud ensüümi pöördtranskriptaasi läbi mrna matriitsist. Tüüpiliselt kasutatakse pöördtranskriptsiooni algatamiseks mrna portsjonite alguslõigu komplementaari. Eriala spetsialistid kasutavad ka terminit cdna tähistamaks kaksikahelaga DNA molekuli, mis sisaldab selliseid üheahelalisi DNA molekule ja selle komplementaarset DNA ahelat. Termin cdna tähistab ka cdna molekuli klooni, mis on sünteesitud RNA matriitsist. Promootor on nukleotiidijärjestus, mis juhib struktuurgeeni transkriptsiooni. Tüüpiliselt asub promootor geeni 5' mitte-kodeerivas piirkonnas, struktuurgeeni transkriptsiooni algussaidi läheduses. Transkriptsiooni algatamises osalevate promootorite järjestuses olevad elemente iseloomustavad sageli nukleotiidi konsensusjärjestused. Antud promootorelementide hulka kuuluvad RNA polümeraassidumise saidid, TATA järjestused, CAAT järjestused, eristusspetsiifilised elemendid (DSEd; MnGehee et al., Mol. Endocrinol. 7:551 (1993)), tsüklilised AMP vastuse elemendid (CREd), seerumvastuse elemendid (SREd; Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1:47 (1990)), glükokortikoidvastuse elemendid (GREd) ja teiste transkriptsioonifaktorite sidumissaidid, nagu näiteks CRE/ATF, (O'Reilly et al., J. Biol. Chem. 267:19938 (1992)), AP2 (Ye et al., J. Biol.

23 EE - EP B1 Chem. 269:25728 (1994)), SP1, valkusid siduv camp vastuse element (CREB; Loeken, Gene Expr. 3:253 (1993)) ja oktamer faktorid (vt üldiselt Watson et al., toim., Molecular Biology of the Gene, 4. trükk. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., 1987), ja Lemaigre ja Rousseau, Biochem, J. 303:1 (1994)). Kui promootoriks on algataja promootor, siis transkriptsiooni tase tõuseb vastusena algatajale. Seevastu transkriptsiooni tase ei ole reguleeritud algataja poolt, kui promootoriks on konstruktiivne promootor. Tuntakse ka repressiivseid promootoreid. Tuumpromootor sisaldab ergutustegevuseks vajalikke põhilisi nukleotiidijärjestusi, mille hulka kuuluvad TATA boks ja transkriptsiooni algus. Sellise definitsiooni järgi võib tuumpromootor omada või mitte omada tuvastatavat aktiivsust spetsiifilise järjestuse puudumisel, mis võib võimendada aktiivsust või kutsuda esile koespetsiifilist aktiivsust. Korraldav element on nukleotiidijärjestus, mis mõjutab tuumpromootori tegevust. Näiteks võib korraldav element sisaldada nukleotiidijärjestust, mis seob raku faktoreid, mis võimaldavad transkriptsiooni kas ainult või eelistatavalt teatud rakkudes, kudedes või organellides. Seda tüüpi korraldavad elemendid on tavaliselt seotud geenidega, mis avalduvad rakuspetsiifilisel, koespetsiifilisel või organellispetsiifilisel viisil. Võimendaja on üks korraldavate elementide liik, mis võib suurendada transkriptsiooni tõhusust, sõltumata võimendaja kaugusest või suunast transkriptsiooni alguse suhtes. Heteroloogiline DNA tähistab DNA molekuli või DNA molekulide populatsiooni, mida ei esine antud peremeesrakus loomulikul kujul. DNA molekulid, mis on heteroloogilised teatud kindla raku suhtes, võivad sisaldada peremeesraku liigist tuletatud DNAd (nt endogeenset DNAd), seni kuni antud peremees-dna on moodustatud mitte-peremees-dnast (nt eksogeensest DNAst). Näiteks peetakse heteroloogiliseks DNA molekuliks sellist DNA molekuli, mis sisaldab mitteperemees-dna lõiku, mis kodeerib transkriptsioonipromootorit hõlmavat, peremees-dna lõiguga rakenduslikult seotud polüpeptiidi. Seevastu võib heteroloogiline DNA molekul hõlmata endogeenset geeni, mis on rakenduslikult

24 23 EE - EP B1 seotud eksogeense promootoriga. Teise näitena peetakse heterogeenseks DNAks DNA molekuli, mis sisaldab metsikut tüüpi rakust tuletatud geeni, juhul kui see DNA molekul viiakse mutantrakku, millel puudub metsikut tüüpi geen Polüpeptiid on peptiidsidemetega seotud aminohappejääkide polümeer, mis on toodetud kas loomulikul teel või sünteetiliselt. Polüpeptiidid, mis on vähem kui 10 aminohappejäägi pikkused, on üldiselt tuntud kui peptiidid. Valk on makromolekul, mis sisaldab ühte või enamat polüpeptiidiahelat. Valk võib sisaldada ka mitte-peptiidseid komponente, näiteks süsivesikute gruppi. Süsivesikuid ja teisi mitte-peptiidseid asendajaid võib lisada valgule rakuga, milles valk on toodetud, ning need erinevad sõltuvalt rakutüübist. Valkusid määratletakse siinkohal nende aminohappe põhiahela struktuuri suhtes; süsivesikute grupi laadsed asendajad on üldiselt mitte-spetsiifilised, kuid võivad siiski esineda. Peptiid või polüpeptiid, mis on kodeeritud mitte-peremees DNA molekuli poolt on heteroloogiline peptiid või polüpeptiid Kloonimisvektor on nukleiinhappemolekul, nagu plasmiid, kosmiid või bakteriofaag, millel on võime autonoomselt replikeeruda peremeesrakus. Kloonimisvektorid sisaldavad tavaliselt ühte või mõnda restriktsiooni endonukleaasi äratundmissaiti, mis võimaldab nukleiinhappemolekuli sisestamist determineerivalt ja ilma vektori põhilise bioloogilise funktsiooni kadumiseta, ning nukleotiidijärjestust, mis kodeerib markergeeni, mis on sobiv kloonimisvektori poolt muundatud rakkude tuvastamiseks ja valimiseks. Markergeenide hulka kuuluvad tavaliselt geenid, mis tekitavad vastupidavust tetratsükliinile või ampitsilliinile. Ekspressioonivektor on nukleiinhappemolekul, mis kodeerib peremeesrakus avalduvat geeni. Tavaliselt kuuluvad ekspressioonivektorisse transkriptsioonipromootor, geen ja transkriptsiooni lõpetaja. Geeni ekspressioon on tavaliselt promootori kontrolli all ja sellist geeni nimetatakse promootoriga rakenduslikult seotud geeniks. Eelnevaga sarnaselt on rakenduslikult seotud korraldav element ja tuumpromootor juhul, kui korraldav element muudab tuumpromootori tegevust. Tehis-peremees on rakk, mis sisaldab heteroloogilist nukleiinhappemolekuli,

25 24 EE - EP B1 näiteks kloonimisvektorit või ekspressioonivektorit. Antud kontekstis on tehisperemeheks rakk, mis toodab ekspressioonivektorist IL-17RC'd. Seevastu IL- 17RC'd võib toota ka rakk, mis on looduslikku päritolu IL-17RC ja millel puudub ekspressioonivektor Interaktiivsed muundajad on tehis-peremeesrakud, milles heteroloogiline DNA on integreeritud raku genoomsesse DNAsse. Liitvalk on hübriidvalk, mis avaldub nukleiinhappemolekulis, mis sisaldab vähemalt kahe geeni nukleotiidijärjestust. Näiteks võib liitvalk hõlmata vähemalt osa IL-17RC polüpeptiidi, mis on liitunud afiinsusmaatriksit siduva polüpeptiidiga. Selline liitvalk pakub võimalust afiinsuskromatograafia abil isoleerida suurt hulka IL-17RC. Termin retseptor tähistab rakuga seotud valku, mis seob bioaktiivse molekuliga, mida nimetatakse ligandiks. See interaktsioon vahendab ligandi mõju rakule. Retseptorid võivad olla membraan-, tsütosool- või nukleaarseotud; monomeersed (nt hormoonretseptoreid või beta-adrenergilisi retseptoreid stimuleeriv türoid) või multimeerne (nt PDGF-retseptor, kasvuhormooni retseptor, IL-3 retseptor, GM- CSF retseptor, G-CSF retseptor, erütropoeetiline retseptor ja IL-6 retseptor). Membraan-seotud retseptoreid iseloomustatakse multidomeense struktuuriga, mis sisaldab rakuvälist ligandseose domeeni ja rakusisest efektordomeeni, mis on tavaliselt kaasatud signaalülekandes. Mõnedes membraanseotud retseptorites paiknevad rakuväline ligandseose domeen ja rakusisene efektordomeen eraldi polüpeptiidides, mis sisaldavad täielikku funktsionaalretseptorit. Üldiselt on ligandseos retseptoriga tagajärjeks asendilisele muutusele retseptoris, mis põhjustab interaktsiooni efektordomeeni ja teis(t)e molekuli(d)e vahel rakus, mis omakorda viib muutuseni raku metabolismis. Metaboolsed sündmused, mis on sageli seotud retseptori-ligandi interaktsiooniga, kaasavad geeni transkriptsiooni, fosforüülimise, defosforüülimise, kasvu tsüklilise AMP tootmises, rakukaltsiumi mobilisatsiooni, membraanlipiidide mobilisatsiooni, rakuadhesiooni, inositoollipiidide hüdrolüüsi ja fosfolipiidide hüdrolüüsi. Lahustuv retseptor on polüpeptiidretseptor, mis ei ole seotud rakumembraaniga.

26 EE - EP B1 Lahustuvad retseptorid on kõige sagedamini ligand-seotud polüpeptiidretseptorid, millel puuduvad membraani läbivad ja tsütoplasmalised domeenid ja teised seosed rakumembraaniga, näiteks glükofosfoiositooli (gpi) kaudu. Lahustuvad retseptorid võivad sisaldada lisa aminohappejääke, näiteks afiinsuse märgid, mis võimaldavad polüpeptiidi puhastamist või pakuvad saite polüpeptiidide või asendajate külge kinnitumiseks või ka immunoglobuliin konstant piirkonna järjestusi. Paljud rakupinna retseptorid omavad loomulikult esinevaid lahustuvaid vastandeid, mida toodetakse proteolüüsi kaudu või tranleeritakse splaissitud mrnadest. Lahustuvad retseptorid võivad olla momomeersed, homodimeersed, heterodimeersed või multimeersed retseptorid, mis üldiselt ei sisalda enam kui 9 alaühikut, eelistatavalt vähem kui 6 alaühikut, ning kõige eelistatavamalt ei sisalda enam kui 3 alaühikut. Retseptorpolüpeptiidid on teatavasti võrdlemisi vabad transmembraansetest ja rakusisestest polüpeptiidide lõikudest, kui neil puudub piisav hulk neid lõikusid, et pakkuda vastavalt kas membraan-ankurdamist või signaalülekannet. Tsütokiinretseptorite lahustuvad retseptorid sisaldavad enamasti rakuväliseid tsütokiinide sidumise domeeni, mis on vaba transmembraansest domeenist ja rakusisesest domeenist. Näiteks kuulub lahustuvate retseptorite hulka IL-17RA lahustuvad retseptorid, nagu näitavad järjestused SEQ ID nr: 167 (polünukleotiid) ja 21 (polüpeptiid). Eriala spetsialistidele on igati jõukohane täpselt kirjeldada, millised järjestused tundud tsütokiinretseptori järjestusest sisaldavad rakuvälist tsütokiini siduvat domeeni, mis on vaba transmembraansest domeenist ja rakusisesest domeenist. Lisaks võidad eriala spetsialistid geneetilist koodi kasutades kergesti määratleda polünukleotiidid, mis kodeerivad selliseid lahustuvaid retseptorpolüpeptiide. Termin sekretoorne signaaljärjestus tähistab DNA järjestust, mis kodeerib peptiid ( sekretoorne peptiid ), mis juhi suurema polüpeptiidi komponendina antud suuremat polüpeptiidi läbi selle raku sekretoorse raja, milles ta on sünteesitud. Tavaliselt suurem polüpeptiid lõhestatakse, eemaldamaks sekretoorset peptiidi selle ülekandmisel mööda sekretoorset rada. Isoleeritud polüpeptiid on polüpeptiid, mis on vaba nakatavatest rakulistest komponentidest, näiteks süsivesikutest, lipiididest või teistest valgulisanditest, mis on seotud polüpeptiidiga looduses. Tavaliselt sisaldab isoleeritud polüpeptiidi

27 EE - EP B1 preparaat ülipuhtal kujul polüpeptiidi, nt vähemalt ligikaudu 80% puhtusega, vähemalt ligikaudu 90% puhtusega, vähemalt ligikaudu 95% puhtusega, üle 95% puhtusega, näiteks 96%, 97% või 98% ja enama puhtusega, või üle 99% puhtusega. Üks võimalus näidata, et antud valgupreparaat sisaldab isoleeritud polüpeptiidi, üksiku laigu esinemise kaudu pärast valgupreparaadi naatriumdodeküülsulfaat (SDS)-polüakrüülamiidi geel-elektorforeesi ja geeli värvimist Coomassie Briljantsinisega. Termin isoleeritud ei välista siiski sama polüpeptiidid esinemist alternatiivsetes füüsilises vormides, näiteks dimeerides või glükosüleeritud või tuletatud vormides. Termineid amino-ots ja karboksüülots kasutatakse siin tähistamaks polüpeptiidide siseseid positsioone. Kui kontekst seda lubab, kasutatakse antud termineid viitega teatud polüpeptiidi järjestusele või portsjonile, tähistades lähedust või suhtelist positsiooni. Näiteks üks polüpeptiidi võrdlusjärjestuse karboksüülotsa paigutusega järjestus paikneb võrdlusjärjestuse karboksüülotsa läheduses, kuid ei ole tingimata täieliku polüpeptiidi karboksüülots. Termin ekspressioon tähistab geeniprodukti biosünteesi. Näiteks struktuurgeeni puhul tähendab ekspressioon struktuurgeeni transkriptsiooni mrnasse ja mrna translatsiooni üheks või mitmeks polüpeptiidiks Terminit splaissvariant kasutatakse siin tähistamaks alternatiivseid RNA vorme, mis on geenist transkribeeritud. Splaissvarieerumine tekib loomulikul teel alternatiivse splaissimis-saidi kasutamisest transkribeeritud RNA molekulis või harvemini eraldi transkribeeritud RNA molekulide vahel ja võib viia mitme, samast geenist transkribeeritud mrna tekkeni. Splaissvariandid võivad kodeerida polüpeptiide, millel on muudetud aminohappe järjestus. Splaissvariandi terminit kasutatakse siin ka geenist transkribeeritud mrna splaissvariandi poolt kodeeritud polüpeptiidi tähistamiseks. Termin immunomodulaator, nagu seda käesolevas töös on kasutatud, hõlmab tsütokiine, tüviraku kasvufaktoreid, lümfotoksiine, kostimuleerivaid molekule, vereloomefaktoreid ja teisi sarnaseid elemente ning nende molekulide sünteetilisi analooge.

28 5 27 EE - EP B1 Termin komplement/antikomplement paar tähistab mitteidentseid fragmente, mis moodustavad sobivate tingimuste korral mittekovalentselt seotud stabiilse paari. Näiteks on biotiin ja avidiin (või streptavidiin) komplement/antikomplement paari prototüüpsed liikmed. Lisaks kuuluvad näitlike komplement/antikomplement paaride hulka veel retseptor/ligand paarid, antikeha/antigeeni (või hapteeni või epitoobi) paarid, senss/antisenss polünukleotiidpaarid ja teised sarnased. Kui soovitakse komplement/antikomplement paari hiljem lahutada, on komplement/antikomplement paari sidumisafiinsus eelistatavalt väiksem kui 10 9 M Anti-idiotüüpne antikeha on antikeha, mis seob immunoglobiini varieeruva piirkonna domeeniga. Siinses kontekstis seob anti-idiotüüpne antikeha anti-il- 17RC antikeha varieeruva piirkonnaga ja seega mimikeerib anti-idiotüüpne antikeha IL-17RC epitoopi. Antikeha fragment on osa antikehast, näiteks F(ab'), F(ab), Fab', Fab ja teised sarnased. Hoolimata sellest, milline on antikeha fragmendi struktuur, seob ta sama antigeeniga, mille tunneb ära terviklik antikeha. Näiteks seob anti-il- 17RC monoklonaalne antikeha fragment IL-17RC epitoobiga. Termin antikeha fragment hõlmab ka sünteetilisi või geneetiliselt toodetud polüpeptiidi, mis seob kindla antigeeniga, näiteks kerge ahela varieeruvat piirkonda sisaldavate polüpeptiididega, raske ja kerge ahela varieeruvat piirkonda sisaldavate Fv fragmentidega, rekombineerivate üheahelaliste polüpeptiidide molekulidega, milles kerged ja rasked varieeruvad piirkonnad on seotud peptiidvahelüliga ( scfv valgud ) ja vähima äratuntava ühikuga, mis koosneb aminohappejääkidest, mis mimikeerivad hüpervarieeruvat piirkonda. Kimäärne antikeha on tehisvalk, mis sisaldab varieeruvaid domeene ja komplementaarseid determineerivaid piirkondi, mis on tuletatud närilise antikehast, antikeha molekuli ülejääk tuletatakse aga inimese antikehast. Inimesestatud antikehad on tehisvalgud, milles hiire monoklonaalse antikeha komplementaarsust determineerivad piirkonnad on üle kantud hiire immunoglobuliini raske ja kerge varieeruvusega ahelatest inimese varieeruvasse

29 28 EE - EP B1 domeeni. Inimeste raviks kasutatavate, hiire antikehadest tuletatud inimesestatud antikehade, näiteks inimvalkudega sidumiseks või nende neutraliseerimiseks vajalike antikehade tootmine kuulub eriala spetsialistide kompetentsi Teraapiline agent on käesolevas töös kasutatud tähistamaks molekuli või aatomit, mis on konjugeeritud antikeha fragmendiga, et luua ravimiseks kasulik konjugatsioon. Teraapilise agendi näidete hulka kuuluvad ravimid; toksiinid, immunomodulaatorid, kelaatorid, boori ühendid, fotoaktiivsed ained või värvained ja radioisotoobid. Tuvastatav märgis on molekul või aatom, mida võib konjugeerida antikeha fragmendiks, et luua diagnoosimiseks kasulikku molekuli. Tuvastatava märgise näideteks on kelaatorid, fotoaktiivsed agendid, radioisotoobid, fluorestseeruvad ained, paramagneetilised ioonid või teised märgistavad fragmendid. Termin afiinsusmärgis kasutatakse käesolevas tekstis tähistamaks polüpeptiidi lõiku, mida saab kinnitada teise polüpeptiidi külge, et korraldada teise polüpeptiidi puhastamist või tuvastamist või luua saite teise polüpeptiidi kinnitamiseks substraadi külge. Põhimõtteliselt võib afiinsusmärgisena kasutada iga peptiidi või valku, mille jaoks on saadaval antikeha või mõni muu spetsiifiline sidumisaine. Afiinsusmärgisteks on polü-histidiini jääk, A valk (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075 (1985); Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3 (1991)), glutatioon S transferaas (Smith ja Johnson, Gene 67:31 (1998)), Glu-Glu afiinsusmärge (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952 (1985)), P aine, FLAG peptiid (Hopp et al., Biotechnology 6:1204 (1988)), streptavidiin-seotud peptiid või mõni teine antigeeniline epitoop või siduv domeen. Vaata üldiselt Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95 (1991). Afiinsusmärgiseid kodeerivad DNA molekulid on saadaval kaubanduslike varustajate kaudu (nt Pharmatcia Biotech, Piscataway, NJ). Paljas antikeha on terviklik antikeha (vastandatuna antikeha fragmendile), mida ei ole raviainega konjugeeritud. Paljasteks antikehadeks on nii polüklonaalsed kui monoklonaalsed antikehad, ning samuti mõned tehis-antikehad, näiteks kimäärsed ja inimesestatud antikehad.

30 29 EE - EP B1 Terminit antikeha komponent on siinkohal kasutatud nii tervikliku antikeha kui antikeha fragmendi tähistamiseks. Immunokonjugaat on antikeha komponendi konjugaat raviainega või tuvastatava märgisega Termin antikeha liitvalk tähistab siinses tekstis tehismolekuli, mis sisaldab antikeha komponenti ja IL-17RC polüpeptiidi komponenti. Antikeha liitvalgu näiteks on valk, mis sisaldab IL-17RC rakuvälist domeeni ja kas Fc domeeni või antigeensidumise piirkonda. Sihtmärk-polüpeptiid või sihtmärk-peptiid on aminohappe järjestus, millesse kuulub vähemalt üks epitoop ja mis avaldub sihtmärk-rakus, näiteks kasvaja rakus või rakus, mis kannab põletikulise toimeaine antigeeni. T rakud tunnevad ära peptiidi epitoode, mida suur koesobivuskompleksi molekul esitab sihtmärkpolüpeptiidile või sihtmärk-peptiidile ja tavaliselt lagundab sihtmärk-raku või värbab teisi immuunrakke sihtmärk-raku kohale, tappes sellega sihtmärk-raku. Antigeeniline peptiid on peptiid, mis seob suure koesobivuskompleksi molekuli, moodustamaks MHC-peptiidikompleksi, mille tunneb ära T rakk, mis indutseerib sellega tsütotoksilise lümfotsüüdi vastuse T rakule esitamisel. Seega on antigeenilised peptiidid suutelised siduma sobiva suure koesobivuskompleksi molekuliga ja indutseerima tsütotoksilise T raku vastust; näiteks raku lagundamine või spetsiifilise tsütokiini vabastamine sihtmärk-raku vastu, mis seob või avaldab antigeeni. Antigeen-peptiide võib leida antigeeni esitava raku või sihtmärk-raku klass I või klass II suure koesobivuskompleksi molekuli kontekstis. Eukarüootide puhul katalüüsib RNA polümeraas II struktuurgeeni transkriptsiooni mrna loomiseks. nukleiinhappemolekuli võib kavandada selliselt, et see sisaldab RNA polümeraas II matriitsi, milles RNA transkriptil on spetsiifilist mrna järjestust täiendav järjestus. RNA transkript lõppeb antisenss RNAga ja nukleiinhappemolekul, mis kodeerib antisenss RNAd, lõppeb antisenss geeniga. Antisenss RNA molekulid on suutelised siduma mrna molekule, mille tulemuseks on mrna translatsiooni inhibeerimine. IL-17RC spetsiifiline antisenss oligonukleotiid ehk IL-17RC antisenss

31 30 EE - EP B1 oligonukleotiid on oligonukleotiid, millel on järjestus, mis on suuteline (a) moodustama stabiilset tripletti IL-17RC geeni osaga või (b) moodustama stabiilset dupleksit mrna transkripti osaga IL-17RC geenist Ribosüüm on nukleiinhappemolekul, mis sisaldab katalüütilist keskust. Termin hõlmab RNA ensüüme, isesplassivaid RNAsid, iselõikuvaid RNAsid ja nukleiinhappemolekule, mis teostavad antud katalüüsivaid funktsioone. nukleiinhappemolekuli, mis kodeerib ribosüüme, nimetatakse ribosüümgeeniks. Väline juhtjärjestus on nukleiinhappemolekul, mis juhib endogeenseid ribosüüme Rnaas P'sid teatud rakusisese mrna liigi juurde, mille tulemuseks on mrna lõikumine RNaas P poolt. nukleiinhappemolekuli, mis kodeerib ribosüümi, nimetatakse välise juhtjärjestuse geeniks. Termin varieeruv IL-17RC geen tähistab nukleiinhappemolekuli, mis kodeerib polüpeptiidid, millel on aminohappe järjestus, mis on SEQ ID nr:2 modifikatsioon. Selliste variantide hulka kuuluvad looduses esinevad IL-17RC geenide polümorfismid ja sünteetilised geenid, mis sisaldavad aminohappe järjestuse SEQ ID nr:2 konservatiivset aminohappe asendajat. Lisaks on IL-17RC varieeruvateks vormideks nukleiinhappemolekulid, mis sisaldavad siinkirjeldatud nukleotiidijärjestuste sisestusi või kustutusi. Varieeruvat IL-17RC geeni võib tuvastada näiteks määratledes, kas geen hübridiseerub karmidel tingimustel nukleiinhappemolekuliga, millel on nukleotiidijärjestus SEQ ID nr: 1 või SEQ ID nr: 4 või selle komplement. Teise võimalusena saab varieeruvaid IL-17RC geene tuvastada järjestuse võrdlemise kaudu. Kahel aminohappe järjestusel on 100% aminohappe järjestuse sarnasus kui mõlema aminohappe järjestuse aminohappejäägid on samad, kui neid maksimaalses vastavuses kohakuti paigutada. Sarnaselt on kahel nukleotiidijärjestusel 100% nukleotiidijärjestuse samasus, kui kahe nukleotiidijärjestuse nukleotiidijäägid on samad, kui neid maksimaalses vastavuses kohakuti paigutada. Järjestuse võrdlust võib läbi viia standardse arvutiprogrammiga, näiteks DNASTARi (Madison, Wisconsin) poolt toodetud LASERGENE bioinformatiivne programm. Tuntakse ka teisi optimaalse kõrvutamise määratlusel põhinevaid nukleotiidijärjestuste või aminohappe

32 EE - EP B1 järjestuste võrdlemise meetodeid (vt nt Peruski ja Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc, 1997), Wu et al. (toim), Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins - Methods in Gene Biotechnology, lk (CRC Press, Inc. 1997), ja Bishop (toim), Guide to Human Genome Computing, 2 trükk (Academic Press, Inc. 1998)). Täpsemalt kirjeldatakse järjestuste sarnasuse tuvastamise meetodeid allpool. Sõltumata sellest, millist meetodit kasutatakse varieeruva IL-17RC geeni või varieeruva IL-17RC polüpeptiidi tuvastamiseks, võib varieeruvat geeni või varieeruva geeni poolt kodeeritud polüpeptiidi kirjeldada funktsionaalselt tema võimega spetsiifiliselt siduda anti-il-17rc antikeha. Varieeruvat IL-17RC geeni või varieeruvat IL-17RC polüpeptiidi võib samuti kirjeldada funktsionaalselt tema võimega siduda oma ligandit, näiteks IL-17A ja/või IL-17F, kasutades bioloogilist või biokeemilist metoodikat, mida kirjeldatakse käesolevas töös. Terminit alleelne variant kasutatakse siin tähistamaks ühte kahest või enamast alternatiivsest geenivormist, mis paiknevad samas kromosoomses lookuses. Alleeline variatsioon tekib loodusliku muteerumise teel ja võib viia fenotüüpse polümorfismini populatsioonis. Geenimutatsioonid võivad olla vaiksed (kodeeritud polüpeptiidis ei ole muutusi) või nad võivad kodeerida polüpeptiide, millel on muudetud aminohappe järjestus. Termin alleelne variant tähistab siin ka valku, mis on kodeeritud geeni alleelse variandi poolt. Termin ortoloog tähistab polüpeptiidi või valku, mis on saadud ühel liigilt, mis on funktsionaalseks vastandiks mõne teise liigi polüpeptiidile või valgule. Ortoloogide järjestuse erinevused tulenevad spetsialiseerumisest Paraloogid on eristuvad, kuid strukturaalselt seotud valgud. Arvatakse, et paraloogid kerkivad esile geeni duplitseerimisel. Näiteks α-globiin, β-globiin ja myoglobiin on üksteise suhtes paraloogid. Käesolev leiutis hõlmab IL-17RC geenide funktsionaalseid fragmente. Antud leiutise kontekstis tähistab IL-17RC geeni funktsionaalne fragment nukleiinhappemolekulile, mis kodeerib IL-17RC polüpeptiidi osa, mis on

33 32 EE - EP B1 siinkirjeldatud domeen või vähemalt seob spetsiifiliselt anti-il-17rc antikehaga. 5 Standardsete analüütiliste meetodite ebatäpsuse tõttu peetakse polümeeride molekulide raskusi ja pikkusi ligikaudseteks väärtusteks. Kui antud väärtust väljendatakse ligikaudu X või läheneb X-le, arvestatakse antud X väärtust täpsusega ±10%. C) IL-17RA ja IL-17RC polünukleotiidide või geenide tootmine nukleiinhappemolekule, mis kodeerivad inimese IL-17RA või IL-17RC geeni või polünukleotiide, mis kodeerivad mis tahes lahustuvaid polüpeptiide käesoleva leiutise järgi, võib saada inimese cdna või geenipanga sõeluuringu abil, kasutades polünukleotiidsonde, mis põhinevad järjestustel SEQ ID nr:1 ja SEQ ID nr:4. Antud tehnikad on standardsed ja hästi tuntud ning neid võib sooritada kasutades kloonimiskomplekte, mis on saadaval kaubanduslike varustajate juures. Vt nt Ausbel et al. (toim), Short Protocols in Molecular Biology, 3. trükk, John Wiley & Sons 1995; Wu et al., Methosd in Gene Biotechnology, CRC Press, Inc. 1997; Aviv ja Leder, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:1408 (1972); Huynh et al., Constructing and Screening cdna Libraries in λgt10 and λgt11 - DNA Cloning: A Practical Approach Vol. I, Glover (toim), lk 49 (IRL Press, 1985); Wu (1997) lk nukleiinhappemolekule, mis kodeerivad inimese IL-17RA või IL-17RC geeni, võib saada ka kasutades polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) oligonukleotiidi alguslõiguga, millel on IL-17RA või IL-17RC geenil või cdna-l põhinevad nukleotiidijärjestused. Üldisi meetodeid geenipankade sõeluuringuteks polümeraasi ahelreaktsiooniga pakuvad näiteks Yu et al., Use of the Polymerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries - Methods in Molecular Biology, nr. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (toim), Humana Press, Inc., Lisaks kirjeldatakse PCR kasutavaid tehnikaid seotud geenide isoleerimiseks näiteks artiklis Preston, Use of Degenerate Olibonucleotide Primers and the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene family Members - Methods in Molecular Biology, nr. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (toim), Humana Press, Inc., Alternatiivina võib IL-17RA või IL-17RC geeni saada ka nukleiinhappemolekulide sünteesimise teel,

34 EE - EP B1 kasutades vastastikuseid pikki alguslõigu oligonukleotiide ja siinses töös kirjeldatud nukleotiidijärjestusi (vt nt Ausubel (1995)). Tuntud tehnikad, mis kasutavad polümeraasi ahelreaktsiooni, pakuvad võimalust sünteesida DNA molekule pikkusega vähemalt kaks tuhat aluspaari (Adang et al., Plant Molec. Biol. 21:1131 (1993), Bambot et al., PCR Methods and Applications 2:266 (1993), Dillon et al., Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes - Methods in Molecular Biology, nr. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (toim), lk (Humana Press, Inc., 1993), ja Holowachuk et al., PCR Methods Appl. 4:299 (1995)). Ülevaateid polünukleotiid sünteeside kohta vt nt Glick ja Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press 1994), Itakura et al., Annu. Rev. Biochem. 53:323 (1984), ja Climie et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:633 (1990). D) IL-17RA või IL-17RC geeni variantide tootmine Käesolev leiutis pakub mitmesuguseid nukleiinhappemolekule, millede hulka kuuluvad DNA ja RNA molekulid, mis kodeerivad IL-17A või IL-17RC polüpeptiidid, mida siinkohal avaldatakse. Eriala spetsialistid teavad, et arvestades geneetilise koodi kõdumisega on antud polünukleotiidide molekulide hulgas suuri järjestuserinevusi. Käesolev leiutis pakub lisaks ka isoleeritud lahustuvaid monomeerseid, homodimeerseid, heterodimeerseid ja multimeerseid retseptorpolüpeptiide, mis sisaldavad vähemalt ühte osa IL-17RC, mis on oluliselt homoloogne järjestuse SEQ ID nr:2 retseptor-polüpeptiidiga. Seega vaatleb antud leiutis IL-17RA või IL-17RC polüpeptiidi kodeerivaid nukleiinhappemolekule, mis sisaldavad kõdu-nukleotiide järjestustest SEQ ID nr: 1 või SEQ ID nr: 4 ja nende RNA vasteid. Eriala spetsialistid teavad, et arvestades geneetilise koodi kõdumisega on antud polünukleotiidide molekulide hulgas suuri järjestuserinevusi. Järjestus SEQ ID nr:7 on kõdu-nukleotiidjärjestus, mis hõlmab kõiki nukleiinhappemolekule, mis kodeerivad IL-17RC polüpeptiidi SEQ ID nr:2. Eriala spetsialistidele on teada, et kõdujärjestus SEQ ID nr:7 pakub ka kõiki RNA järjestusi, mis kodeerivad SEQ ID nr: 2, asendades U-d T-ga. Seega vaatleb käesolev leiutis IL-17RC polüpeptiide kodeerivaid nukleiinhappemolekule, mis sisaldavad nukleotiidi 154 kuni 2229 järjestusest SEQ ID nr:1 ja nende RNA vasteid. Sarnaselt eelnevaga pakub IL-

35 34 EE - EP B1 17RC-1 kõdujärjestus SEQ ID nr:6 ka RNA järjestusi, mis kodeerivad SEQ ID nr:5, asendades U-d T-ga. 5 Tabel 4 esitab ühetähelisi koode, mis tähistavad kõdunukleotiidide asendeid. Resolutsioonid on nukleotiidid, mida tähistatakse koodtähega. Komplement näitab koodi komplementaarsete nukleotiidide kohta. Näiteks kood Y tähistab kas C või T ja selle komplement R tähistab A või G, kusjuures A on komplementaarne T-le ja G on komplementaarne C-le. Tabel 4 10 Kõdukoodonid, mis hõlmavad kõiki võimalikke koodoneid antud aminohappe kohta, on toodud tabelis 5. Tabel 5

36 35 (järgneb) EE - EP B Eriala spetsialistid võivad täheldada teatud määral ebamäärasust kõdukoodoni määratlemises, mis esitab kõiki võimalikke aminohapete kodeerimiskoodoneid. Näiteks võib seriini (WSN) kõdukoodon mõnedel juhtudel kodeerida arginiini (AGR) ja arginiini kõdukoodon (MGN) võib mõnedel juhtudel kodeerida seriini (AGY). Sarnane suhe on fenüülalaniini ja leukiini kodeerivate kõdukoodonite vahel. Seega võivad mõned kõdujärjestuste poolt kaasatud polünukleotiidid kodeerida varieeruvaid aminohappejärjestusi, kuid eriala spetsialist suudab kergesti tuvastada sellised varieeruvad järjestused, viidates aminohappejärjestusele SEQ ID nr:6. Varieeruvaid järjestusi võib testida funktsionaalsuse kohta, nagu kirjeldatud käesolevas töös. Erinevad liigid võivad osutada eelistatavat koodoni kasutust. Üldiseks teabeks vt

37 EE - EP B1 Grantham et al., Nucl. Acids Res. 8: ), Haas et al. Curr. Biol. 6:315 (1996), Wain-Hobson et al., Gene 13:355 (1981), Grosjean and Fiers, Gene 18:199 (1982), Holm, Nuc. Acids Res. 14:3075 (1986), Ikemura, J. Mol. Biol. 158:573 (1982), Sharp and Matassi, Curr. Opin. Genet. Dev. 4:851 (1994), Kane, Curr. Opin. Biotechnol. 6:494 (1995), ja Makrides, Microbiol. Rev. 60:512 (1996). Terminid eelistatav koodoni kasutus või eelistatavad koodonid kasutatakse siin viitena valkusid transleerivatele koodonitele, mida kõige sagedamini kasutatakse mõnede liikide rakkudes, seega eelistades ühte või mõnda esindajat võimalikest koodonitest, mis kodeerivad iga aminohapet (vt tabel 5). Näiteks võivad aminohappetreoniinid (Thr) olla kodeeritud ACA, ACC, ACG või ACT, kuid imetajate rakud ACC on kõige sagedamini kasutatavad koodonid; teiste liikide puhul, näiteks putukad, pärm, viirused või bakterid, võivad olla eelistatud teised Thr koodonid. Teatud liigi jaoks eelistatavad koodonid võib sisestada käesoleva leiutise polünukleotiididesse väga erinevatel meetoditel, mis on teada eriala spetsialistidele. Eelistatava koodonijärjestuse sisestamine rekombineerivasse DNAsse võib näiteks võimendada valgu tootmist, muutes valgu translatsiooni tõhusamaks mingis teatud tüüpi rakus või liigis. Seega on siinkirjeldatud kõdukoodonite järjestused matriitsiks, et optimeerida polünukleotiidide ekspressiooni erinevates rakutüüpides ja liikides, mida tavaliselt antud tehnoloogias kasutatakse ja mida siinkohal kirjeldatakse. Eelistatavaid koodoneid sisaldavaid järjestusi võib testida ja optimeerida ekspressiooniks erinevates liikides ning testida nende funktsionaalsust, nagu on kirjeldatud siinses töös. IL-17RA või IL-17RC kodeeriv cdna võib olla isoleeritud mitmesuguste meetodite abil, näiteks sondeerides täieliku või osalise inim-cdnaga või mõnega kõdusondidest, mis põhinevad siinkirjeldatud järjestustel. CDNA võib olla ka kloonitud, kasutades polümeraasi ahelreaktsiooni koos alguslõikudega, mis on kavandatud siinkirjeldatud inim-il-17ra või IL-17RC järjestuste põhjal. Lisaks võib kasutada cdna andmebaasi, et muuta või sisestada peremeesrakke, ja huvipakkuva cdna ekspressiooni võib tuvastada IL-17RA või IL-17RC polüpeptiidi antikeha abil. Eriala spetsialistidele on teada, et avaldatud järjestus SEQ ID nr:1 esindab inimese IL-17RC üksikut alleeli ning et antud alleeli varieerumine ja alternatiivne

38 EE - EP B1 splaissimine on ootuspärased. Antud järjestuse alleelseid variante võib kloonida standardsete protseduuride kohaselt erinevate inimeste DNA või geenikogude sondeerimise kaudu. Siinkirjeldatud nukleotiidijärjestuse alleelsed variandid, mis hõlmavad vaikseid või aminohappejärjestustes muudatusi kaasavaid mutatsioone, jäävad käesoleva leiutise raamidesse, nii nagu ka valgud, mis on siinkirjeldatud aminohappejärjestuse alleelseteks variantideks. Käesoleva leiutise piiridesse jäävad veel cdna molekulid, mis on loodud IL-17RC polüpeptiidi omadusi säilitavatest alternatiivselt splaissitud mrnadest, ja selliste cdnade ning mrnade poolt kodeeritud polüpeptiidid. Antud järjestuste alleelseid variante ja splaissvariante saab kloonida standardsete protseduuride kohaselt erinevate inimeste või kudede DNA või geenikogude sondeerimise kaudu. Ülaltoodud meetodeid kasutades võib eriala spetsialist valmistada antud leiutise polüpeptiidi. E) IL-17RC, IL-17RA ja IL-17RC/IL-17RA polüpeptiidide valmistamine Käesoleva leiutise polüpeptiidi võib valmistada tehis-peremeesrakkudest, kasutades tavapäraseid meetodeid. IL-17RC/IL-17RA geeni ekspressiooniks peab polüpeptiidi kodeeriv nukleiinhappemolekul olema rakenduslikult seotud reguleerivate järjestustega, mis kontrollivad transkriptsionaalset ekspressiooni ekspressioonivektoris, ja seejärel sisestatud peremeesrakku. Lisaks transkriptionaalsetele reguleerivatele järjestustele, nagu näiteks promootorid ja võimendajad, võivad ekspressioonivektorite hulka kuuluda ka translatsionaalsed reguleerivad järjestused ja markergeen, mis on sobilik ekspressioonivektorit kandvate rakkude valimiseks. Päristuumsetes rakkudes võõrvalgu toomiseks sobilikud ekspressioonivektorid sisaldavad (1) eeltuumse DNA elemente, mis kodeerivad bakteriaalse replikatsiooni alguspunkti ja antibiootikumi resistentsuse markerit, põhjustamaks ekspressioonivektori kasvu ja valikut bakterperemehes; (2) päristuumse DNA elemente, mis kontrollivad transkriptsiooni algust, näiteks promootor; ja (3) DNA elemente, mis kontrollivad transkriptide töötlemist, näiteks transkriptsiooni lõpetav/polüadenüleeriv järjestus. Nagu ülalpool kirjeldatud, võivad ekspressioonivektorite hulka kuuluda ka nukleotiidijärjestused, mis kodeerivad

39 38 EE - EP B1 sekreteerivat järjestust, mis juhib heteroloogilise polüpeptiidi peremeesraku sekretoorsele rajale. Näiteks võib ekspressioonivektor hõlmata IL-17RC/IL-17RA geeni ja sekreteerivat järjestust, mis on tuletatud mis tahes sekreteerivast geenist Käesoleva leiutise polüpeptiid võib avalduda imetajate rakkudes. Näiteks sobivatest imetajate peremeesrakkudest on Aafrika rohepärdiku neerurakud (Vero; ATCC CRL 1587), inimembrüo neerurakud (293-HEK; ATCC CRL 1573), beebihamstri neerurakud (BHK-21, NHK-570; ATCC CRL 8544, ATCC CRL 10314), koera neerurakud (MDCK; ATCC CCL 34), Hiina hamstri munasarja rakud (CHO-K1; ATCC CCL61; CHO DG44 (Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986)), roti ajuripatsirakud (GH1; ATCC CCL82), HeLa S3 rakud (ATCC CCL2.2), roti maksarakud (H-4-II-E; ATCC CRL 1548) pärdiku SV40-muundatud neerurakud (COS-1; ATCC CRL 1650) ja hiire embrüorakud (NIH-3T3; ATCC CRL 1658). Imetajast peremehe puhul võivad transkriptsioonilised ja translatsioonilised reguleerivad signaalid tuleneda imetaja viirusallikatest, näiteks adenoviirusest, veise papilloomiviirus, reesusmakaagi viirus või teised sarnased viirused, mille reguleerivad signaalid on seotud konkreetse, kõrge tootmistasemega geeniga. Sobivaid transkriptsioonilisi ja translatsioonilisi reguleerivaid järjestusi võib saada ka imetaja geenidest, näiteks kollageenist, müosiinist ja metallotioniingeenidest. Transkriptsioonilised reguleerivad järjestused hõlmavad promootorpiirkonda, mis on piisav RNA sünteesi algatamiseks. Sobivate päristuumsete promootorite hulka kuuluvad hiire metallotioniin I geeni promootor (Hamer et al., J. Molec. Appl. Genet 1:273 (1982), Herpes viiruse TK promootor (McKnight, Cell 31:355 (1982)), SV40 varane promotoor (Benoist et al., Nature 290:304 (1981); Rous'i sarkoomi viirus promotoor (Gorman et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 79:6777 (1982); tsütomegaloviiruse promootor (Foecking et al., Gene 45:101 (1980) ja hiire imetajakasvaja viiruse promootor (vt üldiselt Etchceverry, Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture - Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (toim), lk (John Wiley & Sons, Inc. 1996)). Alternatiivina võib eeltuumset promootorit, näiteks bakteriofaagi T3 RNA polümeraasi promootorit kasutada geeni ekspressiooni kontrollimiseks

40 39 EE - EP B1 imetajarakkudes, kui päristuumne promootor reguleerib eeltuumset promootorit (Zhou et al., Mol. Cell. Biol. 10_4529 (1990), ja Kaufman et al.,, Nucl. Acids Res. 19:4485 (1991)) Mõnede kasutuskujude puhul on lahustuvat polüpeptiidi kodeeriv DNA järjestus rakenduslikult seotud teiste geneetiliste elementidega, mis on ekspressioonivektoril ekspressiooniks vajalikud, tavaliselt kuulub nende hulka transkriptsiooni promootor ja lõpetaja. Vektor sisaldab tavaliselt ka ühte või enamat valitavat markerit ja ühte või enamat replikatsiooni alguslõiku, kuigi eriala spetsialistid teavad, et mõnede süsteemide puhul võib valitavaid markereid pakkuda eraldi vektoritel ja eksogeense DNA replikatsiooni võib teostada peremeesraku genoomi integreerimise teel. Promootorite, lõpetajate, valitavate markerite, vektorite ja teiste elementide valik on eriala spetsialistide kompetentsi jääv tavapärane tegevus. Paljusid nendest elementidest on tutvustatud kirjanduses ja nad on kaubanduslikult saadavad. Lahustuva retseptori kompleksi mitmeid komponente saab koos sisestada individuaalsetesse ekspressioonivektoritesse või nad võivad sisalduda ühes ekspressioonivektoris. Sellised valgukomplekside mitme komponendi avaldamise tehnikad on eriala spetsialistidele hästi teada. Ekspressioonivektorit saab sisestada peremeesrakkudesse, kasutades standardseid meetodeid, millede hulka kuuluvad kaltsiumfosfaat-sisestus, liposoom-vahendatud sisestus, mikrokuul-vahendatud sisestamine, elektroporatsioon ja teised sarnased meetodid. Sisestatud rakke võib valida ja paljundada, et pakkuda tehis-peremeesrakke, mis sisaldavad stabiilselt integreeritud ekspressioonivektorit peremeesraku genoomis. Meetodeid vektorite sisestamiseks päristuumsetesse rakkudesse ja meetodeid selliste stabiilsete muundajate valikuks dominantse selektsioonimarkeriga kirjeldavad näiteks Ausbel (1995) ja Murray (toim.), Gene Transfer and Expression Protocols (Human Press 1991). Üheks sobivaks selektsioonimarkeriks on geen, mis võimaldab resistentsust antibiootilisele neomütsiinile. Antud juhul toimub selektsioon neomütsiini tüüpi ravimi osalusel, näiteks G-418 või teised sarnased ravimid. Selektsioonisüsteeme võib kasutada ka soovitava geeni tootmistaseme tõstmiseks, mida nimetatakse võimenduseks. Võimendust teostatakse sisestajate kultiveerimisega

41 EE - EP B1 selektsiooniagendi madalal tasemel, seejärel tõstes selektsiooniagendi hulka, et valida rakkusid, mis annavad sisestatud geenide toodete kõrgeid tasemeid. Sobivaks võimendatavaks selektsioonimarkeriks on dihüdrofolaat reduktaas (DHFR), mis osutab resistentsust metotrekstaadile. Võib kasutada ka teisi ravimite resistentsusgeene (nt hügromütsiin-resistentsust, mitme ravimi resistentsust või puromütsiin atsetüültranferaasi). Alternatiivina võib sisestatud rakkude pinnavalkude sorteerimiseks näiteks FACS sortimise või magnetilise teraeralduse meetodil kasutada ka markereid, mis sisestavad muudetud fenotüüpe, näiteks rohefluorestseeruvat valku või rakupinnavalke, näiteks CD4, CD8, klass I MHC, platsenta leelis-fosfataasi. Antud leiutise polüpeptiidi võib toota ka kultiveeritud imetajageenidega, kasutades viiruse sisestamissüsteemi. Näideteks selleks otstarbeks sobilikest viirustest on adenoviirus, retroviirused, herpesviirus, vaktsiiniaviirus ja adeno-seotud viirused AVV). Kaheahelalise DNAga adenoviirus on praegusel hetkel kõige paremini uuritud geeni sisestamisvektor heteroloogilise nukleiinhappe sisestamiseks (ülevaate saamiseks vt Becker et al., Meth. Cell Biol. 43:161 (1994), ja Douglas ja Curiel, Science & Medicine 4:44 (1997)). Adenoviirussüsteemi eeliste hulka kuulub küllaltki suurte DNA sisestuste mahutavus, võime kasvada kõrgeks tiitriks, võime nakatada paljusid imetajate rakutüüpe ja paindlikkus, mis võimaldab seda kasutada koos suure hulga saadavalolevate, erinevaid promootoreid sisaldavate vektoritega. Adenoviiruse genoomi osade kustutamisega saab mahutada suuremaid (kuni 7kb) heteroloogilist DNAd. Sellised sisestused võib kaasata viirus-dnasse otsese ligandi kaudu või koos sisestatud plasmiidiga homoloogilise rekombineerimise teel. Teine võimalus on kustutada viirusvektorist põhiline E1 geen, mille tulemuseks on võimetus replikeeruda ilma E1 geenita peremeesrakus. Adenoviirusega vektor-nakatatud 293 inimrakke (ATCC nr. CRL-1573, ja 45005) võib kasvatada kleepuvate rakkudena või kultuuri suspensioonina suhteliselt kõrgel rakutihedusel, et toota määrav hulk valke (vt Garnier et al., Cytotechnol. 15:145 (1994)). Leiutise polüpeptiidid võib avalduda ka teistes kõrgemates päristuumsetes rakkudes, näiteks linnu-, seene-, putuka-, pärmi- või taimerakkudes.

42 EE - EP B1 Bakuloviirussüsteem pakub tõhusaid vahendeid kloonitud geenide sisestamiseks putukarakkudesse. Sobivad ekspressioonivektorid põhinevad Autographa californica mitmetuumsel polühedroosiviirusel (Ac-MNPV) ja sisaldavad tuntud promootoreid, näiteks Drosopila kuumavalgu (hsp) 70 promootor, Autographa californica nukleaarse polühedroosi viiruse otseselt varajase geeni promootor (ie- 1) ja hilinemisega varajane 39K promootor, bakuloviirus p10 promootor ja Drosophila metallotioniin promootor. Teine meetod rekomineeriva bakuloviiruse tootmiseks on kasutada transposoonil põhinevat süsteemi, mida kirjeldab Luckow (Luckow et al., J. Virol. 67:4566 (1993)). Nimetatud süsteem kasutab sisestusvektorit PFASTBAC (Life Technologies), mis sisaldab Tn7 transposooni polüpeptiidi kodeeriva DNA liigutamiseks bakuloviiruse genoomi, mida hoitakse bakmiidi nime all tuntud suure plasmiidina E. Coli's (vt Hill-Perkins ja Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990), Bonning et al., J. Gen. Virol. 75:1551 (1994) ja Chazenbalk ja Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995)). Lisaks võivad sisestusvektorid sisaldada raamisisest sulandumist epitoop-märgist, näiteks Glu- Glu epitoop-märgist kodeeriva DNAga avaldunud polüpeptiidi C- või T-otsas (Grussenmeyer et al., Proc. Nat'l Acad.. Sci. 82;7952 (1985)). Tehnoloogiast tuntud meetodit kasutades muudetakse käesoleva leiutise polüpeptiidi kodeerivat geeni sisaldav sisestusvektor E. Coli'ks ja skriinitakse bakmiidiks, mis sisaldab rekombineerivat bakuloviirust näitavat katkestatud lacz geeni. Seejärel isoleeritakse rekomibnantse bakuloviiruse genoomi sisaldav bakmiid DNA tavapäraste meetoditega. Illustreerivat PFASTBAC vektorit võib muuta olulisel määral. Näiteks võib eemaldada polühedriin-promootori ja asendada selle bakuloviirusel põhineva valgupromootoriga (tuntud ka kui Pcor, p6.9 või MP promootor), mis avaldus eelnevalt bakuloviiruse nakkuses ja mida on näidatud eelistatavana sekreteeritud valkude avaldumiseks (vt nt Hill-Perkins ja Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990). Selliste sisestusvektori konstruktide puhul võib kasutada lühikest või pikka valgupromootorit. Lisaks võib moodustada sisestusvektoreid, mis asendavad algseid sekretoorseid signaaljärjestusi putuka valkudest tuletatud sekretoorsete signaaljärjestustega. Näiteks võib konstruktides kasutada sekretoorset signaaljärjestust Ecdüsteroid Glukosüültransferaasist (EGT), mesilase Melittiinist (Invitrogen Corporation; Carlsbad, CA), või bakulaoviirusest gp67 (PharMingen;

43 42 EE - EP B1 San Diego, CA), et asendada looduslikku IL-17RC sekretoorset signaaljärjestust Rekombineerivat viirust või bakmiidi kasutatakse peremeesrakkude sisestamiseks. Sobivate putuka peremeesrakkude hulka kuuluvad IPLB-Sf-21 tuletatud rakuliinid, Spodoptera frigiperda nuku munasarjarakuliinid, näiteks Sf9 (ATCC CRL 1711), SF21 AE ja Sf21 (Invitrogen Corporation; San Diego, CA), ja Drosophila Schneider-2 rakud ning Trichoplusia ni'st (Patent US 5,30,435) tuletatud HIGH FIVEO rakuliinid (Invitrogen). Kaubanduslikult saadaval olevad seerumivabu sööteid võib kasutada rakkude kasvatamiseks ja hoidmiseks. Sobivateks söödeteks on Sf900 II (Life Technologies) või ESF 921 (Expression Systems) Sf9 rakkude jaoks; Ex-cellO405 (JRH Biosciences, Lenexa, KS) või Express FiveO (Life Technologies) T, ni rakkude jaoks. Rekombineeriva viiruse kasutamisel kasvatatakse rakkusid tüüpiliselt inokulatsioonitihedusega ligikaudu 2-5 x 10 5 rakku kuni 1-2 x 10 6 rakku, seejärel liidetakse rekombineeriv viirusvaru nakatuskordsusega (MOI) 0.1 kuni 10, tüüpiliselt ligikaudu 3. Tuntud meetodeid tehisvalkude tootmiseks bakuloviirusesüsteemides pakuvad Bailey et al., Manipualtion of Baculovirus Vectors - Methods in Molecular Biology, Volume 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray (toim.), lk (The Humana Press, Inc. 1991), Patel et al., The baculovirus expression system, - DNA Cloning 2: Expression Systems, 2 trükk, Glover et al (toim.), lk (Oxford University Press 1995), Ausubel (1995) lk kuni 16-57, Richardson (toim.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995), ja Lucknow, Insect Cell Expression Technology, - Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (toim.), lk (John Wiley & Sons, Inc. 1996). Seenhaiguse rakke, sealhulgas pärmirakke, võib kasutada siinkirjeldatud geenide avaldamiseks. Selleks eesmärgiks erilist huvi pakkuvad pärmiliigid on Sccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris ja Pichia methanolica. Sobivateks promootoriteks pärmis avaldumiseks on GAL1 (galactoos), PGK (fosfoglütseraatkinaas), ADH (alkohol dehüdrogenaas), AOX1 (alkohol oksüdaas), HIS4 (histidinool dehüdrogenaas) ja teistest sarnastest ainetest pärinevad promootorid. Kavandatud on mitmeid pärmi kloonivaid vektoreid ja nad on kättesaadavad. Antud vektorite hulka kuuluvad YIp'l põhinevad vektorid, näiteks YIp5, YRp vektorid, näiteks YRp 17, YEp vektorid, näiteks YEp 13 ja YCp vektorid,

44 EE - EP B1 näiteks YCp 19. Meetodeid S. cerevisiae rakkude muutmiseks eksogeense DNAga ja sellest rekombineerivate polüpeptiidide tootmiseks avaldatakse näiteks patentides Kawasaki, U.S. Pat. nr. 4,599,311, Kawasaki et al., U.S. Pat. nr. 4,931,373, Brake, U.S. Pat. nr. 4,870,008, Welch et al., U.S. Pat. nr. 5,037,743, ja Murray et al., U.S. Pat. nr. 4,845,075. Muundatud rakud valitakse fenotüübi järgi, mille määrab selektsioonimarker, tavaliselt resistentsus ravimile või võime kasvada teatud toitaine (nt leutsiini) puudumisel. Saccharomyces cerevisiae jaoks sobivat vektrosüsteemi POT1 tutvustab Kawasaki et al., (U.S. Patent nr. 4,931,373), mis võimaldab muundatud rakkusid valida glükoosi sisaldava sööte kasvamise järgi. Lisaks sobivad pärmi jaoks promootorid ja lõpetajad, mis pärinevad glükolüütilise ensüümi geenidest (vt nt Kawasaki, U.S. Patent nr 4,599,311, Kingsman et al., U.S. Patent nr. 4,615,974 ja Bitter, U.S. Patent nr. 4,977,092) ja alkoholi dehüdrogenaas-geenid. Vt ka U.S. Patendid nr. 4,990,446, 5,063,154, 5,139,936 ja 4,661,454. Tuntakse ka teiste pärmide muundamissüsteeme, näiteks Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii ja Candida maltosa. Vt nt Geeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459 (1986) ja Cregg, U.S. Patent nr 4,882,279. Aspergilluse rakke võib kasutada vastavalt McKnight et al., U.S. Patent nr. 4,935,349 meetoditele. Acremonium chrysogenumi muundamise meetodeid avaldavad Sumino et al., U.S. Patent nr 5,162,228. Neurospora muundamise meetodeid avaldab Lambowitz, U.S. Patent nr. 4,486,533. Pichia methanolica kasutamist peremehena tehisvalkude tootmises tutvustavad näiteks Raymond, U.S. Patent nr 5,716,808, Raymond, U.S. Patent nr. 5,736,383, Raymond et al., Yeast 14:11-23 (1998) ja rahvusvaheliselt avaldatud patentides WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 ja WO 98/ P. methanolica muundamiseks valmistatakse DNA molekule tavaliselt kaheahelaliste tsirkulaarsete plasmiitidena, mis on eelistatavalt enne muundamist lineariseeritud. Polüpeptiidide tootmiseks P. methanolica juures võivad promootoriks ja lõpetajaks plasmiidis olla P. methanolica enda promootor ja lõpetaja, näiteks P. methanolica alkoholi kasutuse geen (AUG1 või AUG2). Teiste kasulike promootorite hulka

45 EE - EP B1 kuuluvad dihüdriksüatsetoon süntaasi promootorid (DHAS), formaat dehüdrogenaasi promootor (FMD) ja katalaasi (CAT) promootor. Lihtsustamaks DNA integratsiooni peremeeskromosoomi, eelistatakse omada plasmiidi terviklikku ekspressioonilõiku, mis külgneb mõlemast otsast peremees-dna järjestusega. Sobilik selektsioonimarker Pichia methanolica puhul kasutamiseks on P. methanolica ADE2 geen, mis kodeerib fosforibosüül-5-aminoimidasool karboksülaasi (AIRC; EC 4,1,121) ja mis võimaldab ade2 peremeesrakkudel adeniini puudumisel kasvada. Suure ulatusega tööstuslikes protsessides, kus soovitakse vähendada metanooli kasutust, võib kasutada peremeesrakke, milles kustutatakse mõlemad metanooli kasutuse geenid (AUG1 ja AUG2). Sekreteerivate valkude tootmiseks võivad peremeesrakud olla puudulikud vakuoolse proteaasi geenide (PEP4 ja RPB1) poolest. Elektroporatsiooni kasutatakse P. methanolica rakkude puhul huvipakkuvat polüpeptiidi kodeerivat DNAd sisaldava plasmiidi sisestamise lihtsustamiseks. P. methanolica rakke võib muundada elektroporatsiooni kaudu, kasutades eksponentsiaalselt taanduvat impulsselektrivälja, mille väljatugevuseks on 2,5 kuni 4,5 kv/cm, eelistatavalt 3,75 kv/cm, ja mille ajakonstant (t) on 1 kuni 40 millisekundit, eelistatavalt umbes 20 millisekundit. Ekspressioonivektoreid võib samuti sisestada taime protoplasti, terviklikesse taimekudedesse või isoleeritud taimerakkudesse. Meetodid ekspressioonivektorite sisestamiseks taimekoesse on otsene nakatamine või taimekoe kasvatamine koos Agrobacterium tumefaciensiga, mikrokuul-vahendatud sisestamine, DNA süstimine, elektroporatsioon ja teised meetodid. Vt nt Horsh, et al., Science 227:1229 (1985), Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992) ja Miki et al., Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants - Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al. (toim.), lk (CRC Press, 1993). Teise võimalusena võib leiutise polüpeptiidi kodeerivaid geene avaldada eeltuumsetes peremeesrakkudes. Sobilikud promootorid, mida saab kasutada polüpeptiidid avaldamiseks eeltuumses peremeesrakus, on eriala spetsialistidele hästi tuntud ja antud promootorite hulka kuuluvad promootorid, mis suudavad ära tunda T4, T3, Sp6 ja T7 polümeraase, bakteriofaag lambda P R ja P L promootoreid, bakteriofaag E. coli' promootorid trp, reca, kuumavalgu, lacuv5, tac, lpp-lacspr,

46 EE - EP B1 phoa, ja lacz, B. subtilis'e promootorid, bakteriofaagide Bacillus ja Streptomyces promootorid, bakteriofaag lambda int promootor, pbr322 bla promootor ja klooramfenikool atsetüül transferaasi geeni CAT promootor. Eeltuumsed promootoreid kirjeldavad ülevaateartiklid Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277 (1987), Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4. trükk, (Benjamin Cummins 1987) ja Ausubel et al., (1995). Sobilike eeltuumsete peremeesrakkude hulka kuuluvad E. coli ja Bacillus subtilus. Sobilike E. coli tüvede hulka kuuluvad BL21 (DE3), BL 21 (DE3) plyss, BL21 (DE3)pLysE, DH1, DH4I, DH5, DH5I, DH5IF', DH5IMCR, DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1099, CSH18, ER1451 ja ER1647 (vt nt Brown (toim.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)). Sobilike Bacillus subtiluse tüvede hulka kuuluvad BR151, YB886, MI119, MI120 ja B170 (vt nt Hardy, Bacillus Cloninc Methods - DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (toim.) (IRL Press 1985)). Leiutise polüpeptiidi avaldamisel bakterites, nagu näiteks E. coli, võib polüpeptiid asuda tsütoplasmas, tavaliselt lahustumatute graanulitena, või võib bakteriaalse sekretsioonijärjestuse poolt olla suunatud periplasmaatilisse ruumi. Esimesel juhul on rakud lagundatud ja graanulid taastatud ja dimeeritud, näiteks kas guanidiin isotiotsütanaadi või uureaga. Denatureeritud polüpeptiidi võib seejärel ümber voltida ja dimeerida denaturandi lahjendusega, näiteks dialüüs uurea lahuse vastu ja kombinatsioon vähendatud ja oksüdeeritud glutatioonist, millele järgneb dialüüs puhverdatud füsioloogilises lahuses. Teisel juhul võib polüpeptiidi taastada periplasmaatilisest ruumist lahustuvas ja funktsionaalses vormis, häirides rakke (näiteks neid heliga või osmolaarse šokiga töödeldes), et vabastada periplasmaatilise ruumi koostisosad ja taastada valk, vältides sellega vajadust denaturaliseerimiseks ja ümbervoltimiseks. Eriala spetsialistidele on hästi tuntud meetodid valkude ekspressiooniks eeltuumsetes peremeesrakkudes (vt nt Williams et al., Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies - DNA Cloning 2: Expression Systems, 2 trükk, Glover et al. (toim.), lk 15 (Oxford University Presss 1995), Ward et al., Genetic Manipulation and Expression of Antibodies - Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, lk

47 46 EE - EP B1 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995) ja Georgiou, Expression of Proteins in Bacteria - Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (toim.), lk. 101 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)) Standardseid meetodeid ekspressioonivektorite sisestamiseks bakteri, pärmi, putuka ja taimerakkudesse pakub Ausubel (1995). Üldiseid meetodeid imetajate rakusüsteemi poolt toodetud võõrvalgu avaldamiseks ja taastamiseks pakuvad näiteks Etcheverry, Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture - Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (toim.), lk 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996). Standardseid meetodeid bakterisüsteemi poolt toodetud valgu taastamiseks pakub näiteks Grisshammer et al., Purification of over-produced proteins from E. coli cells - DNA Cloning 2: Expression Systems, 2. trükk, Glover et al. (toim.), lk (Oxford University Press 1995). Tuntud meetodeid bakuloviirussüsteemist pärinevate tehisvalkude isoleerimiseks kirjeldab Richardson (toim.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995). Teise variandina võib leiutise polüpeptiidi sünteesida välistava sünteesiga tahkel kandjal, osaliste tahkete meetoditega, fragmendi kondenseerimise teel või klassikalise lahussünteesiga. Antud sünteesimeetodid on eriala spetsialistidele hästi tuntud (vt nt Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963), Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2. trükk, (Pierce Chemical Co., 1984), Bayer ja Rapp, Chem. Pept. Prot. (1986) ja Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1989), Fields ja Colowick, Solid-Phase Peptide Synthesis, Methods in Enzymology Volume 289 (Academic Press 1997) ja Lloyd-Williams et al., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (CRC Press, Inc. 1997)). Erinevused kogu keemilise sünteesi strateegiates, näiteks looduslik kemikaali sidumine ja avaldunud valgu sidumine on samuti standardsed (vt nt Dawson et al., Science 266:776 (1994), Hackeng et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:7845 (1997), Dawson, Methods Enzymol. 287:34 (1997), Muir et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:6705 (1998) ja Severinov ja Muir, J. Biol. Chem. 273:16205 (1998)). Leiutis vaatleb ka keemiliselt muudetud kompositsioone, milles polüpeptiid on

48 EE - EP B1 seotud polümeeriga. Tüüpiliselt on polümeer vees lahustuv, nii et konjugaat ei sadestu veekeskkonnas, näiteks füsioloogilises keskkonnas. Näiteks sobilikust polümeerist on polümeer, mida on muudetud, et tal oleks üks reaktiivne grupp, näiteks aktiivne ester atsetüleerimiseks või aldehüüd alküleerimiseks. Selliselt saab kontrollida polümeerimise taset. Näide reaktiivsest aldehüüdist on polüetüleen glükool propioonaldehüüd või mono-(c1-c10) alkoksü- või arüloksüderivaadid nendest (vt nt Harris, et al., U.S. Patent nr. 5,252,714). Polümeer võib olla harudega või harudeta. Lisaks võib kasutada polümeeride segu, et toota konjugaate. Leiutise konjugaadid, mida kasutatakse ravis, võivad hõlmata farmatseutiliselt aktsepteeritavaid vees lahustuvaid polümeerjääke. Sobivate vees lahustuvate polümeeride hulka kuuluvad polüetüleen glükool (PEG), monometoksü-peg, mono-(c1-c10)alkoksü-peg, arüloksü-peg, polü-(n-vinüül pürrolidoon)peg, tresüül monometoksü- PEG, PEG propioonaldehüüd, bis-suksinimidüül karbonaat PEG, propüleen glükool homopolümeerid, polüpropüleen oksiid/etüleen oksiid kopolümeer, polüoksuetüleeritud polüoolid (nt glütserool), polüvinüül alkohol, dekstraan, tselluloos või mõni teine süsivesikutel põhinevatest polümeeridest. Sobilikel PEGidel võib olla molekulikaaluks ligikaudu 600 kuni ligikaudu , seejuures näiteks 5 000, , ja Konjugaat võib samuti hõlmata selliste vees lahustuvate polümeeride segusid. Konjugaatide näiteks on käesoleva leiutise polüpeptiid ja polüalküül oksiid jääk, mis on kinnitunud polüpeptiidi N-otsa. PEG on üks sobilikest polüalküül oksiididest. Näitena võib polüpeptiidi muuta PEGiga antud protseduuri nimetatakse PEGüleerimiseks. Polüpeptiidi PEGüleerimist võib teostada mis tahes teadaoleva PEGüleerimisreaktsiooniga (vt nt EP , Delgado et al., Critical Reviews in therapeutic Drug Carrier Systems 9:249 (1992), Duncan ja Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27:290 (1994) ja Francis et al., Int J Hematol 68:11 (1998)). PEGüleerimist võib läbi viia ka näiteks aküleerimisreaktsioonina või alküleerimisreaktsioonina reaktiivse polüetüleen glükooli molekuliga. Alternatiivse lähenemisena moodustatakse konjugaate aktiveeritud PEGi kondenseerimise teel, milles PEGi terminaalne hüdroksüül või amino grupp on asendatud aktiveeritud vahelüliga (vt nt Karasiewicz et al., U.S. Patent nr. 5,382,657).

49 EE - EP B1 Alküleerimise kaudu PEGüleerimine nõuab tavaliselt PEGi aktiivse ester-derivaadi reageerimist polüpeptiidiga. Näide aktiveeritud PEG esterist on N- hüdroksüsuktsinimiidiks esteriseeritud PEG. Termin alkülatsioon tähistab siinses kontekstis järgnevaid sidumistüüpe polüpeptiidide ja vees lahustuvate polümeeride vahel: amiid, karbamaat, uretaan ja teised sarnased. Meetodid PEGüleeritud IL- 17RC/IL-17RA valmistamiseks alkülatsiooni teel hõlmavad tavaliselt (a) IL- 17RC/IL-17RA polüpeptiidi reageerimist PEGiga (näiteks PEGist tuletatud aldehüüdi reaktiivse estriga) tingimustel, kus üks või mitu PEG gruppi kinnituvad IL- 17RC/IL-17RA külge, ja (b) reaktsiooni tulemus(t)e saamist. Üldiselt määratakse optimaalsed reaktsioonitingimused alküleerumiseks põhinedes tuntud parameetritel ja soovitud tulemustel. Näiteks mida suurem on suhe PEG:IL- 17RC/IL-17RA, seda suurem on polüpegüleeritud IL-17RC/IL-17RA toote protsent. Alküleerimise kaudu PEGüleerimise produkt on tavaliselt polüpegüleeritud produkt, milles lüsiin ε-amino grupid on PEGüleeritud alküülsidumise grupi kaudu. Näiteks ühendavast sidumisest on amiid. Tavaliselt on saadud IL-17RC/IL-17RA vähemalt 95% mono-, di- või tri-pegüleeritud, ehkki mõned, kõrgema PEGüleerimistasemega liigid võivad olla moodustatud sõltuvalt reaktsiooni tingimustest. PEGüleeritud liike võib eraldada mittekonjugeeritud IL-17RC/IL-17RA polüpeptiididest, kasutades tavapäraseid puhastusmeetodeid, näiteks dialüüsi, ultrafiltreerimist, ioonvahetuskromatograafiat, afiinsuskromatograafiat ja teisi sarnaseid. Alküleerimise kaudu PEGüleerimisel toimub tavaliselt PEGist tuletatud terminaal aldehüüdi reageerimine IL-17RC/IL-17RA'ga koos redutseeriva ainega. PEG grupid võivad kinnituda polüpeptiidide külge -CH-NH grupi kaudu. Alküleerimise kaudu derivatiseerimise eeliseks monopegüleeritud toote valmistamisel on derivatiseerimiseks saadaval olevate erinevat tüüpi primaarsete aminogruppide eristav reaktiivsus. Tavaliselt toimub reaktsioon ph'ga, mis võimaldab kasutada eelisena pka erisusi valgu lüsiinjääkide ε-amino gruppide ja N-otsa jäägi α-amino grupi vahel. Sellise selektiivse derivatiseerimise kaudu kontrollitakse reaktiivgruppi (näiteks aldehüüdi) sisaldava vees lahustuva polümeeri kinnitumist valgule. Konjugatsioon polümeeriga toimub predominantselt

50 49 EE - EP B1 valgu N-otsas, ilma oluliste muudatusteta teistes reaktiivsetes gruppides, näiteks lüsiin kõrvalahela aminogruppides. Leiutis võimaldab IL-17RC/IL-17RA monopolümeer konjugaatide substantsiaalselt homogeenset valmistamist Redutseeriv alkülatsioon IL-17RC/IL-17RA monopolümeeri konjugaatmolekuli substantsiaalselt homogeense populatsiooni valmistamiseks võib sisaldada järgmisi samme: (a) IL-17RC/IL-17RA polüpeptiidi reageerimine reaktiivse PEGiga redutseeriva alkülatsiooni tingimustel ph'ga, mis on sobilik võimaldamaks α-amino grupi selektiivset muutmist IL-17RC/IL-17RA α-amino otsas, ja (b) reaktsiooni tulemus(t)e saamine. Redutseeriv aine, mida kasutatakse redutseerivaks alküleerimiseks, peaks olema stabiilne vesilahuses ja suuteline vähendama ainult Schiff alust, mis on moodustunud redutseeriva alküleerimise algses protsessis. Näitlikud redutseerivad ained on naatrium boorhüdriid, naatrium tsüanoboorhüdriid, dimetüülamiin boraan, trimetüülamiin boraan ja püridiin boraan. Monopolümeer IL-17RC/IL-17RA konjugaatide substantsiaalselt homogeense populatsiooni jaoks on redutseeriva alküleerimise reaktsiooni tingimused sellised, mis lubavad vees lahustuva polümeerijäägi selektiivset kinnitumist IL-17RC/IL- 17RA N-otsa. Selliseid reaktsioonitingimused pakuvad üldiselt pka erisusi lüsiin amino gruppide ja α-amino grupi vahel N-otsas. ph mõjutab samuti polümeeri suhet kasutatavasse valku. Üldiselt on madalama ph taseme juures soovitav valgu suhtes suurem hulk polümeeri, kuna mida vähem reaktiivne on α-grupi N-ots, seda enam on vaja polümeeri optimaalsete tingimuste saavutamiseks. Kui ph on kõrgem, ei pea polümeer IL-17RC/IL-17RA hulk olema nii suur, sest saadaval on rohkem reaktiivseid gruppe. Tavaliselt jääb ph tase vahemikku 3 kuni 9 või 3 kuni 6. Seda meetodit võib kasutada IL-17RC/IL-17RA'd sisaldava homodimeerse, heterodimeerse või multimeerse lahustuva retseptori konjugaatide tegemiseks. Teine faktor, millega tuleb arvestada, on vees lahustuva polümeeri molekulide kaal. Üldiselt on polümeeri kõrgema molekulikaalu puhul vähem polümeeri molekule, mis võivad kinnituda valgule. PEGüleerimise reaktsioonide jaoks on tüüpiline molekulikaal ligikaudu 2 kda kuni 100 kda, ligikaudu 5 kda kuni 50 kda või ligikaudu 12 kda kuni 25 kda. IL-17RC/IL-17RA vees lahustuva polümeeri molaarsuhe jääb enamasti vahemikku 1:1 kuni 100:1. Tavaliselt on IL-17RC/IL- 17RA vees lahustuva polümeeri molaarsuhe polüpegüleerimisel 1:1 kuni 20:1 ja

51 monopegüleerimisel 1:1 kuni 5:1. 50 EE - EP B Üldised meetodid polüpeptiidi ja vees lahustuvate polümeerjääkide sisaldavate konjugaatide tootmiseks on eriala spetsialistidele tuttavad. Vt nt Karasiewicz et al., U.S. Patent nr. 5,382,657, Greenwald et al., U.S. Patent nr. 5,738,846, Nieforth et al., Clin. Pharmacol. Ther, 59:636 (1996), Monkarsh et al., Anal. Biochem. 247:434 (1997)). Leiutis vaatleb moodustisi, mis sisaldavad antud leiutise polüpeptiidi. Sellised moodustised võivad sisaldada ka kandjat. Kandjaks võib olla konventsionaalne orgaaniline või anorgaaniline kandja. Kandjate näidete hulka kuuluvad vesi, puhverlahus, alkohol, propüleenglükool, makrogool, seesamiõli, maisiõli ja teised sarnased ained. G) IL-17RC või IL-17RC/IL-17RA polüpeptiidide isolatsioon Käesoleva leiutise polüpeptiidi võib puhastada nakatavatest makromolekulidest, eriti teistest valkudest ja nukleiinhapetest, ning nakatavatest ja pürogeensetest ainetest, vähemalt 80% puhtuseni, vähemalt 90% puhtuseni, vähemalt 95% puhtuseni või üle 95% puhtuseni, näiteks 96%, 97%, 98% või üle 99% puhtuseni. Leiutise polüpeptiidi võib puhastada ka farmatseutiliselt puhta staadiumini, mis on rohkem kui 99,9% puhas. Mõnede preparaatide puhul on puhastatud polüpeptiid substantsiaalselt vaba teistest polüpeptiididest, eriti teistest loomsetest polüpeptiididest. Tehis-peremeesrakkudest puhastatud IL-17RC/IL-17RA preparaatide saamiseks võib kasutada fraktsioneerimist ja/või konventsionaalseid puhastusmeetodeid. Puhastamisetappide näidete hulka võivad kuuluda hüdroksüapatiit, suuruskromograafia, FPLC ja pöördfaasi kõrgefektiivne vedelik-kromatograafia. Sobilikud kromatograafia sööted võivad olla derivatiseeritud dekstranid, agaroos, tselluloos, polüakrüülamiid, eriotstarbelised ränidioksiidid ja teised sarnased. PEI, DEAE, QAE ja Q derivatiivid on samuti sobivad. Kromatograafiliste söödete näiteks on sööted, mis on derivatiseeritud fenüüli, butüüli või oktüüli gruppidest, näiteks Phenyl-Sepbarose FF (Phramacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose (Pharmacia) ja teised sarnased sööted;

52 EE - EP B1 või polüakrüülvaigud, näiteks Amberchrom CG 71 (Toso Haas) ja teised sarnased vaigud. Sobilikud tahked kandjad on klaashelmed, silikoonil põhinevad vaigud, tselluloosvaigud, agaroosterad, ristseotud polüakrüülamiidvaigud ja teised sarnased ained, mis on lahustumatud tingimustel, kus neid on kavas kasutada. Antud kandjaid võib muuta reaktiivgruppidega, mis võimaldavad valkude kinnitumist aminogruppide, karboksüülgruppide, surlfhüdrüülgruppide, hüdroksüülgruppidega ja/või süsivesikujääkidega. Näideteks sidumistehnikatest on tsüanogeen bromiid aktiveerimine, N- hüdroksüsuktsinimiid aktiveerimine, epoksiid aktiveerimine, sulfüdrüül aktiveerimine, hüdrasiid aktiveerimine ja karboksüül- ning amino-tuletised karbodiimiidi sidumistehnikateks. Antud tehnikad ja neile lisaks veel mitmed teised tahked söötmed on eriala spetsialistidele hästi tuntud ja laialdaselt kasutatavad ning kaubanduslikult kättesaadavad. Täpse meetodi valimine polüpeptiidi isoleerimiseks ja puhastamiseks on tavatoiming ja selle määravad osaliselt ka valitava kandja omadused. Vt nt Affinity Chromatography: Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology 1988) ja Doonan, Protein Purification Protocols (The Humana Press 1996). Eriala spetsialistid võivad kavandada ka teisi võimalusi IL-17RC/IL-17RA isoleerimiseks ja puhastamiseks Leiutise polüpeptiid võib olla isoleeritud ka teatud omaduste kasutamisel. Näiteks võib kasutada liikumatu metalliiooni adsorptsiooni (IMAC) kromatograafiat histidiinirikaste valkude, sealhulgas polühistidiinmärgiseid sisaldavate valkude puhastamiseks. Lühidalt selgitades on protseduur järgmine. Geel laetakse divalentse metalli ioonidega kelaadist (Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1 (1985)). Histidiinirikkad valgud adsorbeeritakse sellele maatriksile afiinsustega, mis sõltuvad kasutatavast metalliioonist, ja seejärel voolutatakse võistleva voolutamisega, langetades ph'd, või kasutatakse tugevat kelaatimisainet. Alternatiivseta puhastusmeetodite hulka kuuluvad glükosüleeritud valkude puhastamine lektiinafiinsuse kromatograafiaga ja ioonivahetuskromatograafia (M. Deutscher, (toim.), Meth. Enzymol. 182:529 (1990)). Leiutise alternatiivses kasutuskujuna võib puhastamise lihtsustamseks moodustada huvipakkuva polüpeptiidi ühendi ja afiinsusmärgise (nt maltoos-seotud valgu,

53 EE - EP B1 immunoglobuliindomeeni). Lisaks võib puhastamiseks kasutada lahustuva IL- 17RC/IL-17RA polüpeptiidi ligandseose omadusi, näiteks IL-17RC'd sisaldava lahuse retseptorid; kasutades afiinsuskromatograafiat, kus IL-17F ligand on seotud kolonniga ja IL-17RC'd sisaldav retseptor on seotud ja seejärel voolutatakse, kasutades tavapäraseid kromatograafia meetodeid. IL-17RC/IL-17RA polüpeptiide või nende fragmente võib valmistada ka keemilise sünteesi teel, mida on kirjeldatud ülal. Antud polüpeptiidid võivad olla nii monomeerid kui multimeerid; glükosüleeritud või mitte glükosüleeritud; PEGüleeritud või mitte-pegüleeritud; ja nad võivad sisaldada või mitte sisaldada algset metioniin aminohappejääki. I) Leiutise polüpeptiidide IL-17RC/IL-17RA kasutamine ravis Käesoleva leiutise polüpeptiide võib kasutada immuunsüsteemi mõjutamiseks ligandite IL-17A ja IL-17F (kas koos või eraldi) sidumisega, millega hoitakse ära antud ligandite sidumine endogeense IL-17RC ja/või IL-17RA retseptoriga. Sellest tuleneb, et leiutise juurde kuulub leiutise polüpeptiidide kasutamine nende manustamisel subjektile, kellel puudub piisav hulk nimetatud polüpeptiidi või kes toodab liigselt IL-17A ja/või IL-17F. Leiutise polüpeptiidi (IL-17RC/IL-17RA) võib kasutada ka liigselt IL-17A, IL-17F, IL-17RA või IL-17RC tootva subjekti ravimiseks. Sobilike subjektide hulka kuuluvad imetajad, näiteks inimesed. Näiteks on antud lahustuvad polüpeptiidid kasulikud IL-17A ja IL-17F (kas koos või eraldi) sidumiseks, blokeerimiseks, inhibeerimiseks, vähendamiseks, antagoniseerimiseks või neutraliseerimiseks põletike ja põletikuliste haiguste, näiteks psoriaasi, reumatoidartriidi, IBD, IBS, koliidi, astma, siirde äratõukereaktsiooni, hulgiskleroosi ja teiste siinkäsitletavate põletikuliste haiguste ravis. Leiutise polüpeptiid seob, blokeerib, inhibeerib, vähendab, antagoniseerib või neutraliseerib IL-17F ja IL-17A (kas koos või üksinda) in vivo. 30 IL-17RC cdnale vastava mrna koejaotuse analüüs näitas, et IL-17RC geenist pärinev mrna on tugevalt avaldunud kilpnäärme, neerupealse näärme, eesnäärme ja maksa kudedes ja vähem avaldunud südame, peensoole, mao ja

54 EE - EP B1 hingetoru kudedes. Täpsemalt on IL-17RC pidevalt avaldunud mitte-t raku perifeerse vere rakuliinides, sealhulgas monotsüütides, B-rakkudes ja müeloidliinis. Samuti on IL-17RC mrna usaldusväärselt avaldunud nahast tuletatud rakuliinides. Lisaks avaldub IL-17RC kõigis viies jämesoole rakuliinis, mis olid reas esindatud. Seevastu on ekspressioon väga väike või olematu ajus, platsentas, kopsus, skeletilihastes, neerus, kõhunäärmes, põrnas, tüümuses, munandis, munasarja rakus, käärsooles, perifeerse vere leukotsüütides, selgroos, lümfisõlmes ja luuüdis. Ligand, millega IL-17RC seob (IL-17F ja/või IL-17A), on kaasatud põletikulise vastuse esilekutsumises ja põletikulistele haigustele kaasaaitamises, peamiselt selle kaudu, et võimendab põletikuliste vahendajate tootmist (IL-1β, IL-6 ja TNF-α ja lisaks neutrofiilide paljunemises, kasvamises ja kemotaksises kaasatud vahendajad ülevaade Witowski et al., Cell. Mol. Life Sci. 61: (2004)). Seega on leiutise täpsemad teostusnäited juhitakse lahustuva polüpeptiidi IL- 17RC/IL-17RA suunas kui antagonistid põletikulistes ja immuunhaigustes nagu näiteks psoriaas, põletikuline nahahaigus, reumatoidartriit, IBD, IBS, Crohni tõbi, astma, autoimmuunhaigused, organi või luuüdi siire; põletikud traumade, kirurgia või nakkuse tagajärjel; transplantaat-peremehe-vastu haigus; ja kus põletiku inhibeerimine, immuunsuse allasurumine, vereloome, immuunsuse, põletikuliste või lümfoidi rakkude, makrofaagide, T rakkude (sh Th1 ja Th2 rakud) paljunemise vähendamine, immuunvastuse allasurumine patogeeni või antigeeniga või teised instantsid, kus IL-17F ja/või IL-17A inhibeerimine on soovitav. Lisaks on lahustuv IL-17RC/IL-17RA polüpeptiid kasulik: (1) IL-17RC või IL-17RA kaudu signaalülekande blokeerimisel, inhibeerimisel, vähendamisel, antagoniseerimisel või neutraliseerimisel ägeda põletiku raviks, trauma, koekahjustuse, kirurgia või nakkuse järgse põletiku raviks, krooniliste põletikuliste haiguste, näiteks astma, põletikulise soolehaiguse (IBD), IBS, kroonilise koliidi, reumatoidartriidi, astma ja teiste akuutse faasi vastust näitavate haiguste raviks. (2) IL-17RC või IL-17RA kaudu signaalülekande blokeerimisel, inhibeerimisel, vähendamisel, antagoniseerimisel või neutraliseerimisel autoimmuunhaiguste,

55 EE - EP B1 näiteks IDDM, hulgi-skleroosi (MS), reumatoidartriidi, IBS ja IBD ravimiseks, et ära hoida või inhibeerida signaalülekannet immuunrakkudes (st lümfotsüüdid, monotsüüdid, leukotsüüdid). IL-17RC või IL-17RA kaudu signaali blokeerimine, inhibeerimine, vähendamine, antagoniseerimine või neutraliseerimine leiutise polüpeptiidi kaasabil võib olla kasulik ka kõhunäärme-, neeru-, ajuripatsi- ja närvirakkude haiguste puhul. (3) IL-17RC või IL-17RA kaudu signaalülekande agoniseerimiseks, võimendamiseks, suurendamiseks või algatamiseks autoimmuunhaiguste, näiteks MS, reumatoidartriidi, IBS ja IBD ravis. Leiutise lahustuv polüpeptiid võib signaalida lümfotsüüte või teisi immuunrakke, et eristada immuunsust parendavaid tsütokiine või rakupinnavalke, muuta nende paljunemist või tootmist. Täpsemalt võib T-abistajaraku vastuse moduleerimine tsütokiini sekretsiooni alternatiivsesse mustrisse kõrvale kallutada autoimmuunvastust ja ravida haigust (Smith et al., J. Immunol. 160: , 1998). Sarnaselt võib agonistlikke lahustuvaid polüpeptiide kasutada astmaga, allergiaga ja atoopilise haigusega seotud immuunrakkude signaalülekandeks, puhastamiseks ja kõrvalekallutamiseks. IL- 17RC ja/või IL-17RA kaudu signaalülekanne võib olla kasulik ka kõhunäärme-, neeru-, ajuripatsi- ja närvirakkude haiguste puhul. Siinkirjeldatud lahustuvat IL-17RC/IL-17RA polüpeptiidi võib kasutada IL-17F või IL-17A (kas üksinda või koos) aktiivsuse sidumiseks, inhibeerimiseks, vähendamiseks, antagoniseerimiseks või neutraliseerimiseks autoimmuunhaiguste ja atoopilise haiguse raviks, nagu ülal kirjeldatud. IL-17RC/IL-17RA lahustuvat vormi võib kasutada Th rakkude vahendatud antikeha vastuse esilekutsumiseks ja/või IL-4 või teiste tsütokiinide tootmise soodustamiseks lümfotsüütide või teiste immuunrakkudega. Leiutise lahustuv polüpeptiid on kasulik IL-17A ja/või IL-17F antagonistina. Selliseid antagonistlikke mõjusid võib saavutada IL-17A või IL-17F otsese neutraliseerimise või sidumisega. Lisaks antagonistlikule kasutusele võib leiutise lahustuv retseptor siduda IL-17A või IL-17F ja olla kandjaks ligandi valkudele, et seda transportida erinevatesse kudedesse, organitesse ja rakkudesse üle keha. Sellisena on leiutise lahustuvat retseptorit võimalik liita või siduda molekulide, polüpeptiidide või keemiliste osadega, mis juhivad lahustuv-retseptor-ligand

56 EE - EP B1 kompleksi spetsiifilisse kohta näiteks koesse, spetsiifilisse immuunrakku või kasvajasse. Näiteks akuutse põletiku või mõnede vähkkasvajate puhul võib kasulikkus tuleneda põletikuliste ja kohaliku akuutse faasi vastuse valkude sisestamine IL-17F tegevuse kaudu. Seega võib leiutise lahustuvaid retseptoreid kasutada selleks, et juhtida spetsiifiliselt IL-17A või IL-17F tegevust. Vaata Cosman, D. Cytokine 5:95-106, 1993; ja Fernandez-Botran, R. Exp. Onion. Invest, Drugs 9: , Põletik on organismi kaitsevastus sissetungiva mõjuri tõrjumiseks. Põletik on järkjärguline sündmus, mis puudutab paljusid raku- ja kehavedelikevahendajaid. Ühelt poolt võib põletikuvastuste allasurumine ohustada peremehe immuunsust; teisest küljest aga, kui põletikuga ei tegeleta, võib see viia tõsiste tüsistusteni, näiteks kroonilise põletikulise haiguse tekkeni (st psoriaas, artriit, reumatoidartriit, hulgi-skleroos, põletikuline soolehaigus ja teised sarnased). Oluline on märkida, et neil erinevatel haigusestaadiumidel on ühised põletikuvahendajad. Seetõttu on selge, et põletikuvastased valgud, näiteks leiutise lahustuv polüpeptiid, võivad olla määrava ravipotentsiaaliga suurele hulgale inimese ja loomade haigustele, astmast ja allergiast autoimmuunhaiguseni. 1. Artriit Artriit, sealhulgas osteo-artriit, reumatoidartriit, vigastusele järgnev liigeste artriit jt, on sagedased põletikulised haigused, mille puhul oleks kasulik kasutada raviks põletikuvastaseid valke, näiteks leiutise lahustuvaid polüpeptiide. Näiteks reumatoidartriit (RA) on süsteemne haigus, mis mõjutab kogu keha ja on üks kõike levinumatest artriidi vormidest. Selle tunnuseks on liigese sisevooderdise põletik, mis põhjustab valu, kangust, soojust, punetust ja paistetust. Põletikulised rakud vabastavad ensüüme, mis võivad kahjustada luud ja kõhre. Reumatoidartriidi tulemusena võib põletikuline liigese sisevooderdis sünoovium peale tungida ja kahjustada luud ja kõhre, mis viib liigese muundumiseni ja põhjustab muudele füsioloogilistele toimetele lisaks tõsist valu. Reumatoidartriit (RA) on immuunvahendatud haigus, mida täpsemalt kirjeldab põletik ja arvestatav koekahjustus, mis viib tõsise invaliidsuse ja suurenenud suremuseni. Reumatoidsetes liigestes toodetakse mitmeid tsütokiine. Paljud

57 EE - EP B1 uuringud on näidanud, et kaks prototüüpset põletikueelset tsütokiini IL-1 ja TNFalfa mängivad olulist rolli sünoviaalse põletiku ja jätkuva liigesekahjustuse mehhanismides. TNF-alfa ja IL-1 inhibiitorite manustamine RA patsientidele on tõepoolest viinud olulise paranemiseni põletiku kliinilistes ja bioloogilistes sümptomites ja luuerosiooni ja kõhrehävingu radioloogiliste sümptomite vähenemises. Kuid hoolimata nendest julgustavatest tulemustest ei vasta suur hulk patsiente neile ainetele, mis lubab oletada, et artriidi patofüsiologiasse on kaasatud ka teised vahendajad (Gabay, Expert. Opin. Biol. Ther. 2(2): ). Üks sellistest vahendajatest võibki olla kas IL-17A või IL-17F, ja seega oleks molekul, mis seob või inhibeerib IL-17F või IL-17A aktiivsust, näiteks lahustuv IL-17RC/IL-17RA kasutatav väärtusliku ravimina reumatoidartriidi ja teiste artriithaiguste põletiku vähendamises. Tuntakse paljusid loomadel esinevaid reumatoidartriidi analooge. Näiteks kollageen-indutseeritud artriidi (CIA) vormi puhul areneb hiirtel krooniline põletikulise artriit, mis sarnaneb inimeste reumatoidartriidiga. Kuna CIA jagab RAga sarnaseid immunoloogilisi ja patoloogilisi omadusi, on see haigus suurepäraseks mudeliks inimese potentsiaalse põletikuvastase koostise skriinimiseks. CIA mudel on hiirte puhul hästi tuntud mudel, mille esinemine sõltub nii immuunvastusest kui põletikvastusest. Immuunvastus sisaldab B rakkude ja CD4+ T rakkude interaktsiooni vastusena kollageenile, mis on antud antigeenina, ja viib kollageenivastaste antikehade tootmiseni. Põletikuline faas on tulemuseks põletikuvahendajate koevastustele, mis järgneb mõnede antud antikehade vastastikusele reageerimisele hiire loomuliku kollageeniga ja täiendava jada aktiveerimisele. CIA mudeli kasutamise eeliseks on, et patogeeni põhimehhanismid on teada. Vastavad T raku ja B raku epitoobid tüüp II kollageenil on tuvastatud ja erinevad immunoloogilised (st hilist tüüpi hüpertundlikkus ja kollageenivastane antikeha) ja põletikulised (st tsütokiinid, kemokiinid ja maatrikskõdunevad ensüümid) parameetrid, mis seostuvad immuunvahendatud artriidiga, on määratud ja neid võib seega kasutada katsealuste komponentide efektiivsuse hindamiseks CIA mudelil (Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3: , 1999; Williams et al., Immunol. 89: , 1992; Myers et al., Life Sci. 61_ , 1997; ja Wang et al., Immunol. 92: , 1995).

58 EE - EP B1 Üks uurimisrühm on näidanud, et hiirevastane IL-17 antikeha vähendab sümptomeid hiire CIA-mudelis võrrelduna kontrollhiirtega, mis tõestab, et antud leiutise lahustuvad polüpeptiidid võivad olla kasulikud inimhaiguse raviks. Üksiku hiire-il-17-spetsiifilise roti antiseerumi manustamine vähendas artriidi sümptomeid loomadel, kui seda sisestati profülaktiliselt või pärast mudel-artriidi sümptomite ilmnemist (Lubberts et al., Arthritis Rheum. 50: , 2004). Seega võib IL- 17RC/IL-17RA-Fc kasutada IL-17RA ja/või IL-17F neutraliseerimiseks spetsiifiliste inimhaiguste, näiteks artriidi, psoriaasi, põletikulise soolehaiguse (IBD), IBS ja teiste siinkirjeldatud põletikuliste haiguste raviks. Leiutise lahustuva polüpeptiidi manustamist antud mudel-cia hiirtele kasutati IL- 17F ja IL-17A antagonistina, et ravida sümptomeid ja muuta haiguse kulgu. Lisaks tõestavad leiutise lahustuva polüpeptiidi abil IL-17F ja/või IL-17A inhibeerimise või neutraliseerimise tulemused ka seda, et sümptomite ravimiseks ja haiguse kulu muutmiseks võib kasutada ka teisi IL-17A või IL-17F antagoniste. Kuna IL-17A ja/või IL-17F algatab IL-16 ja TNF-a tootmist, mis on mõlemad kaasatud reumatoidartriidi patogeneesis ja arengus, võib antud lahustuvate polüpeptiidide süsteemne või kohalik manustamine tõenäoliselt alla suruda RA põletikulist vastust. Näitena ja ilma piiranguid esitamata võib tuua µg IL-17RC-Fc süstimist hiire kohta (üks kuni seitse korda nädalas kuni 4 nädala jooksul, kuigi kestus ei ole piiratud, s.c., i.p. või i.m manustamistee kaudu), mis võib oluliselt vähendada haiguse skoori (käpa skoor, põletiku esinemine või haigus). Sõltuvalt IL-17RC-Fc manustamise algusest (st kas enne kollageeni immuniseerimist või selle ajal või mis tahes kollageeni immuniseerimisele järgneval ajahetkel, kaasaarvatud aeg, mil haigus on juba arenenud) IL-17RC või olla efektiivne reumatoidartriidi ennetamisel ning selle arengu ärahoidmisel. Teised võimalikud ravimeetodid kaasavad IL-17RC/IL-17RA jt polüpeptiide. 2. Põletikuline soolehaigus IBD 30 Ameerika Ühendriikides kannatab ligikaudu inimest põletikulise soolehaiguse (IBD) käes, mis võib mõjutada kas käärsoolt või pärasoolt (haavandiline koliit) või mõlemat neist, peen- või jämesoolt (Crohni tõbi). Nende haiguste patogenees on ebaselge, kuid nendega kaasneb mõjutatud kudede krooniline põletik. Leiutise lahustuvaid polüpeptiide võib kasutada väärtusliku

59 58 EE - EP B1 ravimina IBD, haavandilise koliidi, ja teiste seotud haiguste põletiku ja patoloogiliste vähendamiseks Haavandiline koliit on jämesoole ehk teise nimega käärsoole põletikuline haigus, mille tunnusteks on põletik ja soole limaskesta või sisima vooderdise haavandumine. See põletik põhjustab käärsoole sagedast tühjenemist, mille tulemuseks on kõhulahtisus. Sümptomite hulka kuuluvad väljaheidete vedeldumine ja seonduvad kõhukrambid, palavik ja kaalus allavõtmine. Ehkki haavandilise koliidi täpset põhjust ei ole teada, pakuvad hiljutised uuringud, et keha loomulikud kaitsjad töötavad keha valkude vastu, mida keha peab võõrasteks (nn autoimmuunreaktsioon). Võimalik, et kuna antud valgud sarnanevad bakteriaalsete valkudega sooles, võivad nad kas ajendada või stimuleerida põletikulist protsessi, mis hakkab hävitama käärsoole vooderdist. Kuna soole vooderdis hävineb, moodustuvad haavandid, millest väljub lima, mäda ja verd. Haigus algab enamasti pärasoole piirkonnast ja võib levida kogu jämesoole pikkuses. Korduvad põletikujuhud viivad sooleseina paksenemiseni ja pärasoole armistumiseni. Tõsisele haigusele võib järgneda soole koe hävinemine või sepsis. Haavandilise koliidi sümptomid erinevad tõsiduse astmelt ja nende ilmnemine võib olla kas järkjärguline või äkiline. Atakke võivad põhjustada mitmed mõjurid, sealhulgas hingamisteede nakkused või stress. Ehkki praegusel hetkel ei ole haavandilise koliidi vastu ravi, keskenduvad ravimid soole voodri ebanormaalse põletikuprotsessi allasurumises. Haiguse käsitlemiseks on olemas ravimid, millede hulka kuuluvad immunosupressiivsed kortikosteroidid (asatiopriin, merkaptopuriin ja metotrekstaat) ja aminosalitsülaadid. Pikaajaline immunisupressiivide, näiteks kortikosteroididi ja asatiopriini kasutamine võib viia tõsiste kõrvalnähtudeni, millede hulka kuuluvad luude hõrenemine, katarakt, nakkus ja maksa ning luuüdi kahjustused. Patsientidel, kelle ravi ei ole olnud edukas, võib kasutada ka kirurgiat. Kirurgiline sekkumine tähendab kogu jäme- ja pärasoole eemaldamist. On olemas mitmeid loomseid mudeleid, mis võivad osaliselt mimikeerida kroonilist haavandilist koliiti. Kõige laialdasemalt kasutatakse selleks 2,4,6-trinitrobenseen sulfoonhapet/etanooli (TNBS), mida sisestatakse koliidimudelisse, mis indutseerib kroonilist põletikku ja haavandumist käärsooles. Kui TNBS on pärakusisese

60 EE - EP B1 instilleerimise teel sisestatud uuritava hiire käärsoolde, algatab see käärsoole limaskestas T raku vahendatud immuunvastuse, mis viib massilise limaskestapõletikuni, mille omadusteks on tihe T rakkude ja makrofaagide infiltreerumine kogu jämesoole seina ulatuses. Lisaks kaasneb selle histopatologilise pildiga kliiniline pilt areneva kaalukaotuse (kärbumine), verise kõhulahtisuse, pärasoole prolapsi ja jämesoole seina paksenemisega (Neurath et al., Intern. Rev. Immunol. 19:51-62, 2000). Teine koliidi mudel kasutab dekstraan sulfaat naatriumi (DSS), mis indutseerib neutrofiili infiltreerimisega akuutse koliidi, mis avaldub verise kõhulahtisuse, kaalu alanemise soole lühenemise ja limaskesta haavandumise. DSS-indutseeritud koliidi histoloogilisteks omadusteks on põletikuliste rakkude infiltreerumine sidekoekihti, lümfoidi hüperplaasia, fokaalse krüpti kahjustuse ja epiteeli haavandumisega. Arvatakse, et nimetatud muutused arenevad DSSi toksilise mõju tõttu epiteelis ja sidekoekihi rakkude fagotsütoosi ning TNF-alfa ja IFN-gamma tootmise tõttu. Vaatamata sagedasele kasutusele on lahendamata paljud DSS mehhanismide teemad selle mudeli relevantsuse kohta inimhaiguse suhtes. DSSi peetakse T rakust sõltumatuks mudeliks, kuna seda vaadeldakse T rakupuudulikkusega loomadel, näiteks SCID hiired. Käesoleva leiutise lahustuva polüpeptiidi manustamist antud TNBS või DSS mudelitele võib kasutada sümptomite parendamiseks ja haiguse kulu muutmiseks. Lisaks tõestavad IL-17F ja/või IL-17A inhibitsiooni või neutraliseerimist näidanud tulemused ka seda, et neid (või teisi sarnaseid) molekule võib samuti kasutada koliidi/ibd mudelite sümptomite parendamiseks ja haiguse kulu muutmiseks. 3. Psoriaas Psoriaas on krooniline nahahaigus, mida põevad enam kui seitse miljonit ameeriklast. Psoriaas tekib, kui uued naharakud kasvavad ebanormaalselt, mille tulemuseks on põletikulised, paistes ja kestendavad nahalaigud, kus vana nahk ei ole piisavalt kiiresti taandunud. Kõige levinumaks vormiks on naastuline psoriaas, mille tunnuseks on hõbevalgete soomustega kaetud põletikulised nahalaigud ( lesioonid ). Psoriaas võib piirduda mõne laiguga või hõlmata keskmisi või ulatuslikke nahapiirkondi ja see esineb kõige sagedamini peanahal, põlvedel,

61 EE - EP B1 küünarnukkidel ja kerel. Kuigi psoriaas on äärmiselt nähtav haigus, ei ole see nakkav. Haiguse patogeneesi kuulub haigete kudede krooniline põletik. Leiutise lahustuvaid polüpeptiide saaks kasutada väärtusliku ravina psoriaasi ja teiste põletikuliste nahahaiguste, naha ja limaskesta allergiate ja teiste seotud haiguste puhul põletiku ja patoloogiliste nähtuste vähendamiseks. Psoriaas on T raku vahendatud põletikuline häire nahal, mis võib põhjustada võrdlemisi suurt ebamugavust. See on haigus, millele ei ole ravi ja mis puudutab igas vanuses inimesi. Psoriaas puudutab ligikaudu kahte protsenti Euroopa ja Põhja-Ameerika elanikkonnast. Kuigi kergema haigusvormi puhul suudavad inimesed sageli oma haigust kontrollida kohalike mõjuritega, vajavad enam kui kaks miljonit patsienti üle maailma ultraviolett või süsteemset immunosupressiivset ravi. Kahjuks piiravad ultraviolettkiirituse ebamugavus ja ohtlikkus ja paljude teiste teraapiate toksilisus nende pikaajalist kasutamist. Lisaks kordub psoriaas paljude patsientide juures ja mõnedel juhtudel tuleb tagasi varsti pärast immunosupressiivse ravi lõpetamist. Leiutise lahustuvat polüpeptiidi võib kasutada ka diagnoosimismeetodites IL-17F või IL-17A tsirkuleerivate tasemete tuvastamiseks ja akuutse faasi põletikulise vastusega seotud IL-17F või IL-17A tuvastamiseks. Ühes kasutuskujus võib leiutise lahustuvat polüpeptiidi kasutada ringleva või kohalikult toimiva IL-17F või IL-17A polüpeptiidide tuvastamiseks. Ligand või retseptor polüpeptiidide kõrgendatud või langetatud tasemed võivad olla märgiks patoloogiast, sealhulgas põletikust või vähist. On teada, et IL-17F indutseerib seotud akuutse faasi põletikulist vastust. Lisaks võib akuutse faasi valkude või molekulide, näiteks IL- 17A või IL-17F leidmine näidata mõnedes haigusjärkudes (nt astma, psoriaas, reumatoidartriit, IBD, IBS) kroonilist põletikku. Selliste tingimuste avastamist saab kasutada haiguse diagnoosile kaasaaitamiseks ja sobiva ravimeetodi valimiseks. Lisaks teistele siinkirjeldatud haigusmudelitele võib leiutise lahustuva polüpeptiidi aktiivsust inimese psoriaatilistest lesioonidest pärinevas põletikulises koes mõõta in vivo, kasutades tõsise kombineeritud immuunpuudulikkusega (SCID) hiirte mudelit. On välja töötatud mitmeid hiirte haigusmudelid, kus inimrakud on istutatud immuunpuudulikesse hiirtesse (mida nimetatakse kokkulepitult ksenograftmudeliteks); vt nt Cattan AR, Douglas E, Leuk. Res 18:513-22, 1994 ja Flavell, DJ,

62 EE - EP B1 Hematological Oncology 14:67-82, Psoriaasi In vivo ksenograft-mudelina istutatakse inimpsoriaasi nahakude SCID hiirte mudelitesse ja viiakse kontakti sobiva antagonistiga. Lisaks võib kasutada teisi tuntud psoriaasi loom-mudeleid, et hinnata IL-17A ja IL-17F antagoniste, näiteks AGR129 hiire mudelisse istutatud inimese psoriaalse naha grafte ja viia need kontakti sobiva antagonistiga (vt Boyman, O, et al., J. Exp. med., internetiversioon # , 2004). Leiutise lahustuvat polüpeptiidi, mis seob, blokeerib, inhibeerib, vähendab, antagoniseerib või neutraliseerib nii IL-17A kui IL-17F aktiivsust, võib kasutada antud mudelis. Sarnaselt võib kasutada IBD, IBS, artriidi või teiste põletikuliste lesioonide kudesid SCID mudelis, et hinnata siin kirjeldatud IL-17A ja IL-17F antagonistide põletikuvastaseid omadusi. Põletiku vähendamiseks kavandatud teraapiad, mis leiutise lahustuvat polüpeptiidi kasutades hävitaksid, pidurdaksid või vähendaksid põletikku, võib testida selle manustamisel inimese põletikulisi kudesid (st psoriaasi lesioone ja teisi sarnaseid kudesid) kandvatele SCID hiirtele. Ravi tõhusust mõõdetakse ja hinnatakse statistiliselt põletikuvastast toimet kasvatavana ravitaval populatsioonil aja jooksul, kasutades eriala valdkonnas tuntud meetodeid. Mõnede näitlike, kuid mitte piiravate meetodite hulka kuuluvad psoriaasimudelis epidermiline paksus, põletikuliste rakkude hulk ülemises dermas ja parakeratoosi järgud. Selliseid meetodeid tuntakse eriala valdkonnas ja kirjeldatakse ka siin. Näiteks vt Veigler, M. et al., Lab Invest 81:1253, 2001; Zollner, T. M. et al., J. Clin. Invest. 109:671, 2002; Yamanaka, N. et al., Microbiol. Immunol. 45:507, 2001; Raychaudhuri, S. P. et al., Br. J. Dermatol. 144:931, 2001 Boehncke, W. H. et al., Arch. Dermatol. Res. 291:104, 1999; Boehncke, W. H. et al., J. Invest. Dermatol. 116:596, 2001; Nickoloff, B. J. et al., Am. J. Pathol. 146:580, 1995; Boehncke, W. H. et al., J. Cutan. Pathol. 24:1, 1997; Sugai, J., M. et al., J. Dermatol. Sci. 17:85, 1998; ja Villadsen L. S. et al., J. Clin. Invest. 112:1571, Põletikku võib ka jälgida aja jooksul, kasutades tuntud meetodeid nagu voolutsütomeetria (või PCR), et mõõta põletikuliste lesionaalsete rakkude hulka, skoori (kaalust alla võtmist, kõhulahtisust, rektaalset veritsemist, käärsoole pikkust) IBD, käpa haigusskoori ja põletikuskoori kohta CIA RA mudelil. Näiteks kuuluvad selliste mudelite testimiseks sobivate ravistrateegiate hulka otsene ravi lahustuvat IL-17RC või IL-17RC/IL- 17RA kasutades või mõne teise IL-17A ja IL-17F (ühise või eraldi) antagonistiga

63 62 EE - EP B1 või seotud konjugaatide või antagonistidega, mis põhinevad IL-17RC ja/või IL- 17RA interaktsiooni katkestamisel nende vastavate liganditega Psoriaas on krooniline põletikuhaigus, mis on seotud hüperplastilise epidermilise keratinotsüütidega ja infiltreerivate mononukleaarsete rakkudega, millede hulka kuuluvad CD4+ mälu T rakud, neutrofiilid ja makrofaagid (Christopers, Int. Arch. Allergy Immunol., 110:199, 1996). Hetkel arvatakse, et keskkonna antigeenid mängivad olulist rolli selle haiguse patoloogia algatamises. Siiski peetakse tolerantsusekadumist iseenda antigeenide vastu psoriaasi patoloogia vahendajaks. Dendriitilised rakke ja CD4+ T rakke peetakse oluliseks antigeenide esinemisel ja äratundmisel, mis vahendab patoloogiani viivat immuunvastust. Oleme hiljuti välja töötanud psoriaasi mudeli, mis põhineb CD4+CD45RB ülekandemudelil (Davenport et al., Internat. Immunpharmacol., 2: ). Leiutise lahustuvat polüpeptiidi manustatakse hiirtele. Haigusskoori inhibitsioon (nahalesioonid, põletikulised tsütokiinid) osutab nimetatud lahustuvate polüpeptiidide tõhususele psoriaasi puhul. 4. Astma IL-17 mängib olulist rolli allergeen-indutseeritud T raku aktiveerimisel ja neturofiilide sissevoolul õhuteede kaudu. IL-17 retseptor avaldub õhuteedes (Yao et al., Immuunsus 3:811 (1995)) ja IL-17 vahendatud neutrofiil hõivamine allergilise astma puhul on suuresti indutseeritud kemoatraktand IL-8, Gro-β ja makrofaag IL- 17 stimuleeritud inim-bronhiaalsetes epiteelrakkudes (HBEC'des) ja inimbronhiaalsetes fibroplastides toodetud põletikulise proteiin-2 (MIP-2) poolt (Yao et al., J Immunol 155:5483 (1995)); Molet et al., J Allergy Clin Immunol 108:430 (2001)). IL-17 stimuleerib ka HBEC'sid vabastama IL-6, neutrofiili aktiveerivat faktorit (Fossiez et al. J Exp Med 183:2593 (1996), ja Linden et al., Int Arch Allergy Immunol 126:179 (2001)) ja on näidatud, et see sünergeerub TNF-α'ga, pikendamaks inimese neutrofiilide eluiga in vitro (Laan et al., Eur Respir J 21:387 (2003)). Lisaks on IL-17 suurendab põletikulisi vastuseid astma puhul, sest võimendab õhuteede ümberkujundamisel kaasatud tsütokiinide, näiteks profibrootiliste tsütokiinide, IL-6 ja IL-11 ja põletikuliste vahendajate granulotsüüt kolooniate kasvu stimuleeriva faktori (G-CSF) ja granülotsüüt makrofaagi kolooniate kasvu stimuleeriva faktori (GM-CSF) ekspressiooni (Molet et al., J

64 Allergy Clin Immunol 108:430 (2001)). 63 EE - EP B Kliiniliselt on tõestatud, et astma akuutsed, tõsised raskenemised on seotud õhuteede neutrofiilide hõivamise ja aktiveerimisega, seega on tõenäoline, et IL-17 mängib astma puhul olulist rolli. Kerge astmaga patsientide juures esineb tuvastatav kasv vaba lahustuva IL-17A valgu kohalikus kontsentratsioonis (Molet et al., J Allergy Clin Immunol 108:430 (2001)), kuid tervetel vabatahtlikel inimestele, kellel oli sigalaga kokkupuutumisest indutseeritud, tõsine õhuteede põletik, esines bronhiaal-alveoolses ruumis nähtav kasv vaba lahustuva IL-17A valgu kontsentratsioonis (Fossiez et al., J Exp Med 183:2593 (1996), ja Lindend et al, Int Arch Allergy Immunol 126:179 (2001)). Lisaks on IL-17 tasemed rögas korrelatsioonis isikutega, kellel on kõrgenenud õhuteede hüperreaktiivsus (Barczyk et al., Respir Med 97:726 (2003)). Õhuteede ülitundlikkuse loom-mudelite puhul viis krooniline ovaalbumiini sissehingamine tundlikuks muudetud hiirtel bronhiaalse neutrofiiliani. (Hellings et al., Am J Respir Cell Mol Biol 28:42 (2003).) Anit-IL-17 monoklonaalsed antikehad vähendasid tugevalt bronhiaalset neutrofiilset sissevoolu, kuid võimendasid oluliselt IL-5 tasemeid nii bronhialveoolses loputusvedelikus kui seerumis ja raskendasid allergeen-indutseeritud bronhiaalset eosinofiilset sissevoolu, mis võimaldab oletada, et IL-17A võib olla kaasatud neutrofiili ja eosinofiili kuhjumise vahelise tasakaalu määratlemisega pärast antigeeni kahjustust (ld.) IL-17 perekonna liikmete seas on kõige lähedasemalt seotud IL-17F ja IL-17A. IL- 17F poolt vahendatavad bioloogilised tegevused on sarnased IL-17Aga, kus IL- 17F stimuleerib IL-6, IL-8 ja G-CSF tootmist (Hurst et al., J Immunol 169:443 (2002)). IL-17F indutseerib ka IL-2 tootmist ja kasvufaktori (TGF)-β ja monotsüüt kemoatraktant valgu (MCP) muutmist endoteelsetes rakkudes (Starnes et al., J Immunol. 167:4137 (2201)). Sarnaselt võib ka allergeen kasvatada kohalikku IL- 17F allergilise astma patsientidel. (Kawaguchi et al., J Immunol 167:4430 (2001)). IL-17F geeni sisestamine hiire kopsu kasvatab neutrofiilide hulka bronhiaalalveoolses ruumis, kus IL-17 geeni limaskesta ülekandmine võimendab Ag-indutseeritud kopsu neutrofiilia tasemeid ja õhutee tundlikkust metakoliinile (Oda et al., Am J Respir Crit Care Med 171:12 (2005)).

65 EE - EP B1 Lisaks astmale on mitme tõsise põletikulise õhuteede haiguse omadusteks neutrofiili hõivamine õhuteedes ja on teatatud, et IL-17 mängib olulist osa hingamisteede haiguste, näiteks kroonilise obstruktiivse kopsuhaiguse (KOK) ja tsüstilise fibroosi patogeneesis (Linden et al., Eur Respir J 15:973 (2000); Ye et al., Am J Respir Cell Mol Biol 25:335 (2001), Rahman et al., Clin Immunol 115:268 (2205)). Anti-IL-17A ja/või anti-il-17f ravimi molekuli puhul võib näidata selle tõhusust kroonilise põletikulise õhuteede haiguse suhtes põletiku in vitro mudelil. IL-17F ja/või IL-17A aktiivsuse antagonistide, näiteks IL-17RC lahustuvad retseptorid ja selle antikehad, millede hulka kuuluvad anti-inim-il-17rc monoklonaalsed ja neutraliseerivad antikehad käesoleva leiutise järgi, võime inhibeerida IL-17A ja/või IL-17F-indutseeritud tsütokiini ja kemokiini tootmist kasvatatud HBECist või bronhiaalsest fibroplastist võib kasutada selleks, et mõõta antud antagonistide efektiivsust ennetada otseselt IL-17A ja/või F stimuleerimisest tulenevate põletikuliste vahendajate tootmist. Kui antagonistide, näiteks leiutise lahustuva polüpeptiidi lisamine IL-17F ja/või IL-17Aaktiivsusele vähendab märgatavalt põletikuliste vahendajate tootmist ja avaldumist, on see ootuspäraselt efektiivne põletikuliste aspektide suhtes, mis on seotud kroonilise õhuteede põletikuga. 5. Ärritunud soole sündroom (IBS) Ärritunud soole sündroom on haigus, mille omadusteks on kõhuvalu või ebamugavus ja korrapäratu sooletalitus: peamiselt sageda ja vedela väljaheitega, peamiselt kõva ja harva väljaheitega ja vahelduva või normaalse väljaheitega patsiendid (Talley et al., 2002). Muutunud soole liikumine, häired epiteelses funktsioonis, häired gaaside ja väljaheitega ning stress võivad sümptomitele kaasa aidata, sisikonna ülitundlikkus on aga peamine, enamikul patsientidel esinev omadus. Geneetilised valu-signaalülekannet ja häireid mõjutavad faktorid aferentsete signaalide keskses töötluses põhjustavad inimestel IBSi, mis järgneb teatud keskkonnaga kokkupuutumisele. Uuringud on samuti näidanud, et põletikulised vastused käärsooles võivad aidata kaasa silelihase ja seedetrakti närvide kõrgenenud tundlikkusele ja häirivad seega sensomotoorseid funktsioone soolestikus (Collins et al., 2001). IBS ja IBD vahel on kliiniline kattuvus, kus enne IBD diagnoosimist on täheldatud patsientidel IBS-sarnaseid sümptomeid ja

66 EE - EP B1 ootuspärasest kõrgemaid IBS sümptomeid korduva IBDga patsientidel. Seega võivad nimetatud tingimused esineda koos ootuspärasest kõrgema sagedusega või võivad esineda järjestikku IBS ja IBD sama spektrumi erinevad otsad. Siiski mõjutab IBS oluliselt väga suurt osa inimkonnast (Ameerika Ühendriikides arvatavalt 2000 a. ligikaudu 16 miljonit inimest), mis viib kulukoormuse kogumahus 1,7 miljardi dollarini (2000 a.). Seega jääb IBS kõige valdavamate ja kulukamate seedekulgla haiguste ja ärrituste seas alla ainult gastroösofageaalsest reflukshaigusest (GERD). Siiski, erinevalt GERDist ei ole IBS ravi rahuldav (Talley et al., 2002; Farhadi et al.,2001; Collins et al., 2001), mis näitab IBS puhul selgelt täitmata meditsiinilist vajadust. On pakutud ühtelangevaid haigusmudeleid, mis esitavad närvi-, immuun, või närviimmuunringluste võimendatud tundlikkust kesknärvisüsteemis või sisikonnas keskseid (psühhosotsiaalne) või perifeerseid (koe ärritus, põletik, nakkus) häireid normaalses homöostaasis (Talley et al., 2002). Selline võimendatud tundlikkus viib soolestiku liikumise häirete, epiteelse funktsiooni (immuunsus, läbilaskvus) ja sisikonna ülitundlikkuseni, mis omakorda viib IBS sümptomiteni. IBS patogeneesis võib olla osa paljudel erinevatel molekulidel, muu hulgas neuronite stimuleerimisega ja põletikuprotsessi algatamisega seotud molekulidel. Paljude meie pakutavatest molekulidest on tuntud selle poolest, et seostuvad võimaliku neuronite aktiivsusega, mis tuleneb nende otsesest avaldumisest neuronitena või nende retseptorite ekspressioonist neuronitele, kaasa arvatud IL- 17D, IL-17B ja IL-31. Lisaks on hulka IL-17 perekonna liikmeid ja seotud molekule seostatud põletikuga sisikonnas, sealhulgas IL-17A, IL-17F, IL-23 ja IL-31. Nende molekulid inhibiitorite efektiivsust võib testida in vivo haiguse loommudelitel. Pakutud on mitmeid loom-mudeleid, mis mimikeerivad IBS peamisi omadusi ja mille juurde kuulub keskselt suunatud stiimuleid (stressi) või perifeerselt suunatud stiimuleid (nakkus, põletik). Näitena võib tuua kahte tüüpi in vivo loom-mudelitest, mida võib kasutada IBS ravis inhibiitorite efektiivsuse määramiseks: (i) mudelid, mis keskenduvad IBS peamisele, kesknärvisüsteemi juhitavale patogeneesile (stressimudelid) ja (ii) mudelid, mis keskenduvad sisikonnast juhitavale stressi tekitajatele (nt soolestiku põletik, nakkus või füüsiline stress). Tuleb siiski märkida, et sündmused kesknärvisüsteemis või seedekulglas

67 66 EE - EP B1 ei esine eraldatuses ja IBS sümptomid tulenevad kõige tõenäolisemalt kesknärvisüsteemi ja seedekulgla vahelisest signaalide interaktsioonikompleksist. J) Farmatseutilised formulatsioonid Farmatseutiliseks kasutuseks on antud leiutise lahustuv polüpeptiid moodustatud süstitavatena, täpsemalt veenisiseseks või nahaaluseks sisestamiseks vastavalt konventsionaalsetele meetoditele. Veenisisene manustamine teostatakse süvainjektsioonina, kontrollitud vabanemisena, st kasutades minipumpasid või teisi sobivaid tehnoloogiaid, või infusiooniga tavalise perioodiga ühest mitme tunnini. Üldiselt hõlmavad farmatseutilised formulatsioonid vereloomevalku koos farmatseutiliselt vastuvõetava tugiainega, näiteks füsioloogilist lahust, puhverdatud füsioloogilise lahust, 5% dekstroosiga vees vms. Formlatsioonid võivad sisaldada ka ühte või mitut abiainet, säilitusainet, lahjendusvedelikku, puhverainet, albumiini valkude kao ennetamiseks ravimipudeli pinnal jne. Kui kasutatakse sellist kombinatoorset ravi, võib tsütokiine ühitada üksikus formulatsioonis või manustada eraldi formulatsioonidena. Formuleerimismeetodid on valdkonnas hästi teada ja on avaldatud näiteks töös Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, toim., Mack Publishing Co., Easton PA, Ravidoosid jäävad enamasti vahemikku 0,1 kuni 100 mg/kg patsiendi kaalust päevas, eelistatavalt 0,5-20 mg/kg päevas, kusjuures täpse doosi määrab arst vastavalt rõhutatud standardile, mis arvestab ravitava haiguse loomust ja tõsidust, patsiendi omadusi jne. Doosi määramine kuulub eriala spetsialisti kompetentsi. Valgud manustatakse tavaliselt kemoteraapiale või luuüdi siirdamisele järgneva 28 päeva jooksul või kuni saavutatakse vereliistakute hulk >20 000/mm 3, eelistatavalt >50 000/mm 3. Tavaliselt manustatakse valkusid nädala jooksul või vähem, sageli ühe kuni kolme päeva jooksul. Üldiselt on raviks vajalik kogus leiutise lahustuvat polüpeptiidi hulk piisav, et põhjustada kliiniliselt olulisel määral lümfoid või müeloid eellasrakkude paljunemist ja/või eristumist, mis aaldub täiskasvanud rakkude (st vereliistakute või neutrofiilide) ringlustasemete kasvus. Vereliistakute häirete ravi jätkub seega kuni vereliistakute hulgaks saavutatakse vähemalt /mm 3, eelistatavalt /mm 3. Leiutise lahustuvat polüpeptiidi võib manustada ka ühenduses teiste tsütokiinidega, näiteks IL-3, -6 ja -11; tüviraku faktoriga, erütropoetiiniga, G-CSF ja GM-CSF'ga. Kombinatoorse ravi režiimis on teiste tsütokiinide päevased doosid

68 67 EE - EP B1 enamasti: EPO, 150 U/kg; GM-CSF, g/kg: IL-3,1-5 1g/kg; ja G-CSF, g/kg. Madala EPO tasemetega aneemsetele patsientidele määratakse kombinatoorne ravi näiteks EPOga Üldiselt sõltub manustatava lahustuva polüpeptiidi doseerimine patsiendi vanusest, kaalust, pikkusest, soost, üldisest tervislikust seisundist ja eelnevast terviseloost. Tüüpiliselt on soovitav anda selline doos nimetatud lahustuvat polüpeptiidi, mis jääb vahemikku 1mg/kg kuni 10mg/kg (aine suhe patsiendi kehakaalu), kuigi võimalikud on ka madalamad või kõrgemad doosid, kui olukord seda nõuab. Leiutise lahustuva polüpeptiidi manustamine subjektile võib olla veenisisene, arterisisene, kõhukelmesisene, lihasesisene, nahaalune, kopsukelmesisene, kõrvakestaalune, see võib toimuda ka voolutades läbi piirkondliku õõnessondi või otseselt lesioonisisese süstina. Raviotstarbeliste valkude manustamisel süstina võib manustamine olla kas pideva sisendamisega või ühe- või mitmekordse boolina. Lisaks kuuluvad manustamisvõimaluste hulka suukaudne, limaskestamembraani, kopsu ja nahakaudne manustamine. Suukaudne sisestamine on sobilik polüester mikrokuulide, maisivalgu mikrokuulide, proteinoid-mikrokuulide, polütsüaanakrülaat-mikrokuulide ja lipiididel põhinevate süsteemide puhul (vt nt DiBase ja Morrel, Oral Delivery of Microencapsulated Proteins - Protein Delivery:Physical Systems, Sanders and Hendren (toim.), lk (Penum Press 1997)). Ninasisese sisestamise võimalust näitlikustab selline insuliini manustamine (vt nt Hinchcliffe ja Illum, Adv Drug Deliv. Rev. 35:199 (1999)). Lahustuvat polüpeptiidi sisaldavaid kuivi või vedelaid osakesi võib valmistada ja sisse hingata kuivpulbri pihusti, vedela aerosoolpihusti või pulverisaatori abil (nt Pettit ja Gombotz, TIBTECH 16:343 (1998); Patton et al.,adv. Drug Deliv. Rev. 35:235 (1999)). Antud lähenemist illustreerib AERX diabeedi hooldussüsteem, mis on käeshoitav elektrooniline sissehingamisaparaat, mis manustab kopsudesse aerosoolset insuliini. Uuringud on näidanud, et kda suurusi valke on sisestatud läbi naha ravikontsentraatides madalasagedusliku ultraheli abil, mis illustreerib nahakaudse manustamise võimalust (Mitragotri et al., Science 269:850 (1995)). veel üks võimalus leiutise lahustuva polüpeptiidi manustamiseks on

69 68 EE - EP B1 nahakaudne sisestamine elektroportatsiooni abil (Potts et al., Pharm. Biotechnol. 10:213 (1997)) Farmatseutilist kompositsiooni leiutise lahustuva polüpeptiidiga võib moodustada vastavalt tundud meetoditele farmatseutiliselt kasulike kompositsioonide valmistamiseks, kus ravivalke kombineeritakse farmatseutiliselt vastuvõetavate kandjatega. Kompositsiooni nimetatakse farmatseutiliselt vastuvõetavaks kandjaks, kui vastuvõttev patsient talub selle manustamist. Üheks näiteks farmatseutiliselt vastuvõetavatest kandjatest on steriilne fosfaat-puhverdatud füsioloogiline lahus. Tuntakse ka teisi sobilikke kandjaid. Vt nt Gennaro (toim.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19. trükk (Mack Publishing Company 1995). Ravieesmärgil manustatakse leiutise lahustuvat polüpeptiidi ja farmatseutiliselt vastuvõetavat kandjat patsiendile raviks tõhusal hulgal. Kombinatsiooni leiutise ravimolekulist ja farmatseutiliselt vastuvõetavast kandjast nimetatakse teraapiliselt tõhusaks hulgaks, kui manustatav hulk on füsioloogiliselt oluline. Aine on füsioloogiliselt oluline, kui selle manulus tulemuseks on tuvastatav muutus vastuvõtva patsiendi füsioloogias. Näiteks on põletikuravis kasutatav aine füsioloogiliselt oluline juhul, kui selle manulus leevendab põletikulist vastust. Leiutise lahustuvat polüpeptiidi sisaldavat farmatseutilist kompositsiooni võib pakkuda vedelal kujul, aerosoolina või tahkel kujul. Vedelaid kujusid näitlikustavad süstitavad lahused ja suukaudselt pihustatavad vormid. Tahkete kujude näidete hulka kuuluvad kapslid, tabletid ja kontrollitud vabanemisega vormid. Viimast kuju illustreerivad miniosmoospumbad ja siirded (Bremer et al., Pharm. Biotechnol. 10:239 (1997); ranade, Implants in Drug Delivery - Drug Delivery Systems, Ranade ja Hollinger (toim.), lk (CRC Press 1995); Bremer et al., Protein Delivery ith Infusion Pumps - Protein Delivery: Physical Systems, Sanders ja Hendren (toim.), lk (Plenum Pres 1997); Yewey et al., Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant - Protein Delivery: Physical Systems, Sanders ja Hendren (toim.), lk (Plenum Press 1997)). Liposoomid pakuvad samuti ühte võimalust ravimi polüpeptiidide manustamiseks subjektile veenisiseselt, kõhukelmesiseselt, kõrvakestaaluselt, lihasesiseselt,

70 EE - EP B1 nahaaluselt või suukaudselt, ninasiseselt või sissehingamise teel. Liposoomid on mikroskoopilised vesiikulid, mis sisaldavad ühte või mitut lipiidi kaksikkihti, mis ümbritsevad veekambreid (vt üldiselt Bakker-Woudenberg et al., Eur. J. clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Lisa 1):S61 (1993), Kim, Drugs 46:618 (1993) ja Ranade, Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers - Drug Delivery Systems, Ranade ja Hollinger (toim.), lk 3-24 (CRC Press 1995)). Liposoomid on kompositsioonilt sarnased rakumembraanidega ja selle tõttu on liposoomide manustamine turvaline ja nad on biolagunevad. Sõltuvalt valmistusmeetodist võivad liposoomid olla ühe või mitme kaksikkihiga, nad võivad erineda suuruses, diameetriga 0,02 µm kuni üle 10 µm. Liposoomidesse võib kapseldada mitut liiki aineid: hüdrofoobseid aineid kaksikkihtide sees ja hürdofiilseid aineid veesises(t)es ruumi(de)s (vt nt Machy et al., Liposomes in Cell Biology and Parmacology (John Libbey 1987), ja Ostro et al., American J. Hosp. Pharm. 46:1576 (1989)). Lisaks on võimalik kontrollida kapseldatud ainete ravivõimalusi, muutes liposoomi suurust, kaksikkihtide arvu, lipiidi kompositsiooni või liposoomi kandami ja pinnaomadusi. Liposoomid võivad adsorbeeruda pea igat tüüpi rakkudesse ja seejärel aeglaselt vabastada kapseldatud ained. Teise võimalusena võib adsorbeerunud liposoomi endotsütoosida fagotsüütiliste rakkude poolt. Endotsütoosile järgneb liposoomi lipiidide lüsosoomisisene kõdunemine ja kapseldatud ainete vabastamine (Scherphof et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 446:368 (1985)). Pärast veenisisest manustamist võetakse väikesed liposoomid (0,1 kuni 1,0 µm) enamasti üle retikulaar-endoteelsüsteemi poolt, mis paikneb peamiselt maksas ja põrnas, suuremad kui 3,0 µm liposoomid paiknevad aga kopsus. Antud eelistatavat väikeste liposoomide ülevõtmist retikulaar-endoteelsüsteemi rakkude poolt kasutatakse kemoteraapiliste ainete sisestamiseks makrofaagidesse ja maksakasvajatesse. Retikulaar-endoteelsüsteemi võib vältida mitmete meetoditega, mille hulka kuuluvad küllastamine liposoomiosakeste suurte doosidega või selektiivsete makrofaagide deaktiveerimisega farmakoloogiliste vahendite abil (Claassen et al., Biochim. Biophys. Acta 802:428 (1984)). Lisaks on näidatud, et glokülipoodist või polüetüleenglükoolist derivatiseeritud fosfolipiidide kaasamine liposoomi

71 70 EE - EP B1 membraanis vähendab olulisel määral ülevõtmist retikulaar-endoteelsüsteemi poolt (Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1068:133 (1991); Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)) Liposoome võib valmistada ka spetsiaalsete rakkude või organite jaoks, varieerides fosfolipiid-kompositsiooni või sisestades liposoomi retseptoreid või ligandeid. Näiteks on kasutatud kõrge mitte-ioonse pindaktiivse ainega valmistatud liposoome, mis on maksale suunatud (Hayakawa et al., Japanese Patent ,018; Kato et al., Biol. Pharm. Bull 16:960 (1993)). Antud formulatsioone valmistatakse segades sojaoa fospatidüülkoliini, α-tokoferooli ja etoksüleeritud hüdrogenereeritud kastorõli (HCO-60) metanoolis, kontsentreerides segu vaakumis ja seejärel rekonstrueerides segu veega. Liposoomi dipalmitoüülfosfatidüülkoliin (DPPC) formulatsiooni sojaoast tuletatud sterüülglükosiid-segu (SG) ja kolesterooliga (Ch) on samuti näidatud maksale suunatuna (Shimizu et al., Biol. Pharm. Bull. 20:881 (1997)). Teise võimalusena võib siduda liposoomi pinnale erinevaid sihtmärk-ligandeid, näiteks antikehasid, antikeha fragmente, süsivesikuid, vitamiine ja kandjavalke. Näiteks võib liposoome muuta haru-tüüpi galaktosüüllipiidi derivatiividega, et suunata asialoglükovalgu (galaktoosi) retseptoreid, mis avalduvad ainult maksarakkude pinnal (Kato ja Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14:287 (1997); Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull. 20:259 (1997)). Sarnaselt on Wu et al., Hepatology 27:772 (1998) näidanud, et liposoomide märgistamine asialofetiiniga viis lühendas liposoomi plasma eluiga poole võrra ja võimendas oluliselt asialofetiin-märgistatud liposoomi ülevõtmist hepatotsüütide poolt. Teisest küljest võib haru-tüüpi galaktosüüllipiidi derivatiive sisaldavate liposoomide kuhjumist maksas inhibeerida eelnevalt asialofetiini süstides (Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull. 20:259 (1997)). Polüakonitüleeritud inimseerumi albumiin liposoomid pakuvad veel ühte lähenemist liposoomide suunamiseks maksa rakkudele (Kamps et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:11681 (1997)). Lisaks kirjeldavad Geho et al., U.S. patendis nr ,044 hepatotsüüdi poolt juhitud liposoomi vesiikuli sisestamise süsteemi, millel on spetsiifilisus hepatobiliaarsete retseptorite suhtes, mis on seotud maksa spetsialiseerunud ainevahetusrakkudega.

72 EE - EP B1 Üldisema lähenemise kohaselt koesuunamisele on sihtmärkrakud eelnevalt märgistatud biotinüleeritud antikehadega, mis on spetsiifilised sihtmärkrakus avalduvale ligandile (Harasym et al., Adv. Drub Deliv. Rev. 32:99 (1998)). Pärast plasma eemaldamist vabast antikehast manustatakse streptavidiin-konjugeeritud liposoomid. Teises lähenemises kinnitatakse sihtmärk-antikehad otse liposoomidele (Harasym et al., Adv Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998)). Polüpeptiide ja antikehasid võib kapseldada liposoomidesse, kasutades valgu mikrokapselduse tavapäraseid tehnoloogiaid (vt nt Anderson et al., Infect. Immun. 31:1099 (1981), Anderson et al., Cancer Res. 50:1853 (1990) ja Cohen et al., Biochim. Biophys. Acta 1063:95 (1991), Alving et al., Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies - Liposome Technology, 2. trükk, III kd, Gregoriadis (toim), lk 317 (CRC Press 1993), Wassef et al., Meth. Enzymol. 49:124 (1987)). Nagu ülalpool märgitud, võivad ravieesmärgiks kasulikud liposoomid sisaldada erinevaid komponente. Näiteks võib liposoomides sisalduda polü(etüleenglükooli) lipiidderivatiive (Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)). Kõdunevaid polümeer mikrokuule võib kavandada ravivalkude kõrgete süsteemsete tasemete hoidmiseks. Mikrokuulid on valmistatud kõdunevast polümeerist, näiteks polü(laktiid-ko-glükoliid) (PLG), polüanhüdriidid, polü(ortoestrid), mittebiolagunevad etüülvinüül atsetaat polümeerid, milles valgud on haaratud polümeeri (Gombotz ja Pettit, Bioconjugate Chem. 6:332 (1995); Ranade, Role of Polymers in Drug Delivery - Drug Delivery Systems, Ranade ja Hollinger (toim.), lk (CRC Press (1995); Roskos ja Maskiewicz, Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery - Protein Delivery: Physical Systems, Sanders ja Hendren (toim.), lk (Plenium Press 1997); Bartus et al., Science 281:1161 (1998); Putney ja Burke, Nature Biotechnology 16:153 (1998); Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548 (1998)). Polüetüleenglükool (PEG)-kaetud nanosfäärid võivad samuti pakkuda kandjaid ravivalkude veenisiseseks manustamiseks (vt nt Gref et al, Pharm. Biotechnol. 10:167 (1997)). Võib kavandada ka teisi valdkonnas tuntud doseerimisvorme, nagu kirjeldavad näiteks Ansel ja Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5. trükk (Lea&Fegiber 1990), Gennaro (toim.), Remington's

73 72 EE - EP B1 Pharmaceutical Sciences, 19. trükk (Mack Publishing Company 1995) ja Ranade ja Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996) Näitena võivad farmatseutilisi kompositsioone pakkuda komplektina, millesse kuulub leiutise lahustuvat polüpeptiidi sisaldav konteiner. Teraapilist polüpeptiidid võib pakkuda süstitava lahuse kujul ühe või mitme doosina või steriilse puudrina, mis moodustatakse uuesti enne süstimist. Teise võimalusena võib sellisse komplekti kuuluda kuivpulbri pihusti, vedela aerosooli generaator või pulverisaator teraapilise polüpeptiidi manustamiseks. Antud komplekti võib lisaks kuuluda ka infoleht kasutusjuhistega farmatseutilise kompositsiooni kasutamiseks. Lisaks võib antud infoleht sisaldada teadet selle kohta, et kompositsioon vastunäidustatud patsientidele, kellel on ülitundlikkus kas IL-17RC või IL-17RA suhtes. Käesolev leiutis vaatleb leiutise lahustuva polüpeptiidi kompositsioone ja meetodeid ning teraapilisi kasutusi, millede juurde kuulub sama siinkirjeldatud polüpeptiid. Selliste kompositsioonide juurde võib lisaks kuuluda ka kandja. Kandjaks võib olla konventsionaalne orgaaniline või anorgaaniline kandja. Kandja näidete hulka kuuluvad vesi, puhverlahus, alkohol, propüleenglükool, makrogool, seesamiõli, maisiõli ja teised sarnased ained. K) Transgeensete hiirte valmistamine Transgeenseid hiiri võib valmistada kas IL-17F, IL-17A, IL-17RA või IL-17RC geeni ületootmiseks kõigis kudedes koespetsiifilise või koe-eelistusega reguleeriva elemendi kontrolli all. Antud ületootmist võib kasutada fenotüübi kirjeldamiseks, mis on ületootmise tulemuseks, ja transgeensid loomi võib kasutada IL-17F, IL- 17A, IL-17RA või IL-17RC ülemäärasusest põhjustatud inimhaiguste mudelitena. Transgeensed hiired, mis toodavad üle mis tahes nimetatud ainet võivad olla bioreatori mudeliks IL-17RA või IL-17RC tootmisel, näiteks käesoleva leiutise mis tahes lahustuva polüpeptiidi tootmisel suuremate loomade piimas või veres. Transgeensete hiirte valmistamismeetodid on eriala spetsialistidele hästi tuntud (vt nt Jacob, Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice - Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob (toim.), lk (Academic Press, Ltd. 1994), Monastersky ja Rob (toim.), Strategies in Transgenic Animal (ASM Press 1995), ja Abbud ja Nilson, Recombinant Protein

74 73 EE - EP B1 Expression in Transgenic Mice - Gene Expression Systems: Using Nature for the Art of Expression, Fernandez ja Hoeffler (toim.), lk (Academic Press, Inc. 1999)) Näiteks võib transgeensete hiirte valmistamismeetod, mis avaldab IL-17RC geeni, alata täiskasvanud fertiilsest isashiirest (tõuisased) (B6C3f1, 2-8 kuu vanused (Taconic Farms, Germantown, NY)), vasektoomsetest hiirtest (viljatud isased) (B6D2f1, 2-8 kuu vanused, Taconif Farms)), puberteedieelsed fertiilsed emashiired (doonorid) (B5C3f1, 4-5 nädala vanused (Taconic Farms)) ja täiskasvanud fertiilsed emashiired (vastuvõtjad) (B6d2f1, 2-4 kuu vanused, Taconic Farms)). Doonorid aklimatiseeritakse ühe nädala jooksul, mille järel neile süstitakse ligikaudu 8 IU/hiire kohta Pregnant Mare' Serum gonadotrofiini (Sigma Chemical Company; St. Louis, MO) I.P., ja tunni järel süstitakse 8 IU/hiire kohta inimese Chorionic Gonadotropin'i (hcg) (Sigma)) I.P., et algatada superovulatsiooni. Doonoreid paaritatakse tõuisastega pärast hormoonide süstimist. Ovulatsioon toimub enamasti 13 tunni jooksul pärast hcg süstimist. Paaritumist tuvastatakse vaginaalse sulgumise esinemisega paaritumisele järgneval hommikul. Viljastatud munarakud kogutakse kokku kirurgilise mikroskoobi alla. Munajuhad kogutakse kokku ja munarakud vabastatakse uriinianalüüsi slaididesse, mis sisaldavad hüaluronidaasi (Sigma). Munarakke pestakse korra hüaluronidaasis ja kaks korda Whitteni W640 söötes (mida kirjeldavad näiteks Menino ja O'Claray, Biol. Reprod. 77:159 (1986) ja Dienhart ja Downs, Zygote 4:129 (1996)), mida on inkubeeritud 37 ºC juures 5% CO2, 5% O2 ja 90% N2. Seejärel säilitatakse munarakke 27 ºC/5% CO2 inkubaatoris kuni mikrosüstimiseni. Kümme kuni kakskümmend mikrogrammi IL-17RC kodeerivat järjestust sisaldavat plasmiid DNAd lineariseeritakse, geel-puhastatakse ja suspendeeritakse uuesti 10mM Tris-HCI (ph 7,4), 0,25 mm EDTA (ph 8,0) lõpliku kontsentratsiooniga 5-10 nanogrammi mikrofiltri kohta mikrosüstimiseks. Näiteks võivad IL-17RC kodeerivad järjestused kodeerida polüpeptiidi, mis sisaldab aminohappejääke 21 kuni 452 järjestusest SEQ ID nr:2. Plasmiid DNA mikrosüstitakse kogutud munarakkudesse tilgas W640 söötmes,

75 74 EE - EP B1 mis on kaetud sooja CO2-tasakaalustatud mineraalõliga. DNA tõmmatakse süstla nõela (tõmmatud 0,75 mm, 1mm OD boorsilikaat klaaskapillaarilt) ja süstitakse igasse munarakku. Igasse munarakku sisestatakse süstlanõel, kas ühte või mõlemasse haploidsetest eeltuumadest Pikoliitrid DNAd süstitakse eeltuumadesse ja süstlanõel tõmmatakse tagasi ilma tuumadega kokku puutumata. Protseduuri korratakse, kuni kõik munarakud on süstitud. Edukalt mikrosüstitud munarakud kantakse üle organi koekultuuri alusele, mis on eelnevalt gaseeritud W640 söötmega üle öö säilitamiseks 37 ºC/5% CO2 inkubaatoris. Järgmisel päeval siirdatakse kahe-rakulised embrüod pseudotiinetesse vastuvõtjatesse. Vastuvõtjad tuntakse ära paaritumissulgurite esinemise järgi pärast nende paaritumist viljatute isastega. Vastuvõtjad tuimestatakse ja raseeritakse vasakult seljapoolelt ning viiakse kirurgilise mikroskoobi alla. Nende nahale läbi lihasseina kõhupiirkonna keskel, mis on piiritletud rinnakorvi, ristluu ja tagajalaga, poolel teel põlvest põrnani, tehakse väike sisselõige. Paljunemisorganid tuuakse välja väiksele kirurgilisele kangale. Rasvapadjand sirutatakse välja üle kirurgilise kanga ja beebi serefiin (Roboz, Rockville, MD) kinnitatakse rasvapadjandile ning jäetakse rippuma hiire seljale, et organid ei libiseks sisse tagasi. Peene ülekandepipetiga, mis sisaldab W640 ja õhumullide muundamise järgset mineraalõli, kantakse eelmisel päeval süstitud kaherakulised embrüod vastuvõtjasse. Paisunud ampullid lokaliseeritakse ja munajuha ampulli ja pauna vahel hoides tehakse munajuhasse 28 g nõelaga pauna lähedale sälk, rebestamata ampulli või pauna. Pipett viiakse munajuha sälku ja embrüod puhutakse sisse, lastes esimesel õhumullil pipetist väljuda. Rasvapadjand lükatakse õrnalt kõhukelmesse ja paljunemisorganid lastakse tagasi libiseda. Kõhukelme sein suletakse ühe õmblusega ja nahk suletakse haavaklambriga. Hiired taastuvad 37 ºC soojendis vähemalt neli tundi. Vastuvõtjad viiakse tagasi puuridesse kahekaupa, tiinuse aeg on päeva.

76 75 EE - EP B1 Pärast sünnitust jäetakse päeva sünnitusjärgset aega enne võõrutamist. Võõrutatud poegadel tuvastatakse sugu ja nad paigutatakse soo järgi eraldi puuridesse ning nende saba otsast lõigatakse kääridega 0,5 cm koeproov (genotüübi määramiseks) Sabaotstest valmistatakse genoomne DNA, kasutades näiteks Qiagen Dneasy komplekti ja järgides tootja juhiseid. Genoomset DNAd analüüsitakse PCRga, kasutades IL-17RC geeni võimendamiseks kavandatud alguslõike või selektiivset markergeeni, mis sisestati samasse plasmiidi. Pärast loomade transgeensuse kinnitamist ristatakse neid puhtasse liini, paigutades transgeense emaslooma kokku loodusliku isasloomaga või transgeense isaslooma ühe või kahe loodusliku emasloomaga. Pärast poegade sündimist ja nende soo määramist nad eraldatakse üksteisest soo alusel ja nende sabaotsad lõigatakse genotüübi määramiseks. Transgeeni avaldumise kontrollimiseks elus loomal viiakse läbi osaline hepatektoomia. Kõhu ülemine, otse rinnakuluu alla jääv osa valmistatakse ette lõikuseks. Steriilset meetodit kasutades tehakse väike, 1,5-2 cm lõige rinnaku alla ja vasak külgmine sagar maksast tuuakse välja. 4-0 siidiga tehakse sõlm alumise sagara ümber, et kinnitada see väljapoole kehaõõnsust. Sõlm kinnitatakse atraumaatilise klambriga ja selle lähedusse paigutatakse imevast Dexonist (American Cyanamid; Wane, N.J.) teine silmus. Dexon sõlmest tehakse distaalne lõige ja ligikaudu 100 mg ekstsineeritud maksa koest paigutatakse steriilsesse Petri nõusse. Ekstsineeritud maksa lõik viiakse 14 ml polüpropüleeni ümmarguse põhjaga torusse ja külmutatakse vedelas nitrogeenis ning säilitatakse kuivas jääs. Lõikuskoht suletakse õmbluse ja haavaklambritega ja looma puur viiakse operatsioonijärgselt 24 tunniks 37 ºC soojenduspadjale. Looma jälgitakse operatsioonijärgselt iga päev ja haavaklambrid eemaldatakse 7-10 päeva möödudes lõikusest. IL-17RC mrna avaldumist uuritakse iga transgeense hiire puhul, kasutades RNA lahuse hübridiseerimise katset või polümeraasi ahelreaktsiooni. Lisaks IL-17F, IL-17A, IL-17RA või IL-17RC ületootvate transgeensete hiirte valmistamisele on kasulik luua nende geenide kas ebanormaalselt madala ekspressiooniga või üldse ilma ekspressioonita transgeenseid hiiri. Sellised

77 EE - EP B1 transgeensed hiired pakuvad kasulikke mudeleid IL-17F, IL-17A, IL-17RA või IL- 17RC puudulikkusega seotud haigustele. Nagu ülal kirjeldatud, võib IL-17RC geeni avaldumist inhibeerida antisenss geenidega, ribosüümgeenidega või välise juhtjärjestuse geenidega. Näiteks IL-17RC geene alatootvate transgeensete hiirte valmistamiseks võib selliseid inhibeerivaid järjestusi suunata IL-17RC mrnale. Eriala spetsialistidele on tuntud meetodid teatud geeni ebanormaalselt madala ekspressiooniga transgeensete hiirte valmistamiseks (vt nt Wu et al., Gene Underexpression in Cultured Cells and Animals by Antisense DNA and RNA Strategies - Methods in Gene Biotechnology, lk (CRC Press 1997)). Alternatiivne võimalus transgeensete hiirte valmistamiseks, kellel on vähe IL-17RC geeni või kellel see puudub üldse, on luua hiiri, kellel on vähemalt üks normaalne IL-17RC alleel asendatud mittetoimiva IL-17RC geeniga. Üks meetod mittetoimiva IL-17RC geeni kavandamiseks on sisestada teine geen, näiteks selektiivne markergeen nukleiinhappe molekuli mis kodeerib IL-17RC. Tavapärased meetodi nende nii-nimetatud väljalülitatud hiirte valmistamiseks on eriala spetsialistidele tuntud (vt nt Jacob, Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice - Over-expression and Knockout of Cytokindes in Transgenic Mice, Jacob (toim.), lk (Academic Press, Ltd. 1994) ja Wu et al., New Strategies for Gene Knockout - Methods in Gene Biotechnology, lk (CRC Press 1997)). Leiutist illustreerivad järgnevad mittepiiravad näited. NÄITED NÄIDE 1 IL-17RC geeni ekspressioon inimese mitme koe laigutust kasutades viidi läbi Northern analüüsid (Human Multiple Tissue Blot, Clontech Laboratories, Inc. Palo Alto, CA). Genereeriti kaks sondi PCR toodetest puhastatud geelist. Esimene sond tehti kasutades alguslõikudena C21798 (5'CGG CGT GGT GGT CTT GCT CTT 3'; SEQ ID nr:8) ja ZC21808 (5' TCC CGT CCC CCG CCC CAG GTC 3': SEQ ID nr:31). Sond sildistati radioaktiivselt, kasutades Multiprime märgistuskomplekti Amershamilt (Arlington Heights, IL), järgides tootja protokolli. Sond puhastati, kasutades

78 EE - EP B1 NucTrap tõukekolonni (Stratagene, La Jolla, CA). ExpressHyb (Clonotech) lahust kasutati prehübridiseerimiseks ja hübridiseerimislahuseks northern blotis. Hübridiseerumine toimus üle öö 65 ºC juures. Pärast hübridiseerimist pesti igat sondi 30 minutit lahuses, mis sisaldasid 0,1% SDS ja SSC järgnevalt: kaks korda 2xSSC's toatemperatuuril, kolm korda 0,1xSSC's 50 ºC juures, ühe korra 0,1xSSC's 55 ºC juures ja ühe korra 0,1xSSC's 65 ºC juures. Tulemused tõestasid, et IL-17RC geen on tugevasti avaldunud kilpnäärme, neerupealse näärme, eesnäärme ja maksa kudedes ja väiksemat ekspressiooni südame, peensoole, mao ja hingetoru kudedes. Seevastu on ekspressioon väga väike või olematu ajus, platsentas, kopsus, skeletilihastes, neerus, kõhunäärmes, põrnas, tüümuses, munandis, munasarja rakus, käärsooles, perifeerse vere leukotsüütides, selgroos, lümfisõlmes ja luuüdis. NÄIDE 2 mrna jaotus rakuliini paneelil, kasutades PCRi Totaalne RNA puhastati jääkidest ja stimuleeriti laboris kasvanud rakuliine ning puhastati kasutades Qiagen (Valencia, CA) RNeasy komplekti, järgides tootja juhiseid, või fenoolhappe puhastusprotokolli (Chomczynski ja Sacchi, Analytical Biochemistry, 162: , 1987). RNA kvaliteeti hinnati alikvoodiga Agilent Bioanalyzer'il. Kui RNA oli oluliselt lagunenud, ei kasutatud seda järgnevas esimese cdna ahela loomiseks. Saastava genoomi esinemist DNAs hinnati PCR katsega RNA alikvoodil zc41011 (5'CTCTCCATCCTTATCTTTCATCAAC 3'; SEQ ID nr:32) ja zc41012 (5'CTCTCTGCTGGCTAAACAAAACAC 3'; SEQ ID nr:33), alguslõigud, mis võimendasid geenidevahelise genoomse DNA ühte saiti. PCR tingimused saastava genoomse DNA katseks olid järgmised: 2,5 µl 10X puhver ja 0,5 µl Advantage 2 DNA polümeraasi segu (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), 2 µl 2,5 mm dntp segu (Applied Biosystems, Foster City, CA), 2,5 µl 10x Rediload (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja 0,5 µl 20 um zc41011 ja zc41012, mis kokku on 25 µl. Tsükleerimise parameetrid oli 94 ºC 20, 40 tsüklit 94 ºC ºC 1'20 ja üks tsükkel 72 ºC 7'. 10µl iga reaktorile tehti agaroos-geel-elektroforees ja geele uuriti PCR toote esinemise suhtes saastavast genoomsest DNAst. Kui leiti saastavat genoomset DNAd, DNAeeriti totaalne RNA, kasutades DNA-vabasid reagente (Ambion, Inc, Austin, TX), järgides tootja juhiseid, ja seejärel testiti

79 78 EE - EP B1 uuesti, nagu ülal kirjeldatud. Ainult saastavast genoomsest DNAst vabasid RNAsid kasutati järgnevalt cdna esimese ahela loomiseks µg totaalne RNAd 82 inimese rakuliinist viidi 98 µl H2O'ga, seejärel lahutati kaheks 49 µl alikvoodiks, millest kumbki sisaldas 10 µg totaalne RNAd, ja paigutati kahte 96-augulisele PCR plaadile. Igale alikvoodile lisati esimese ahela cdna sünteesi reagendid (Invitrogen First Strand cdna Synthesis System, Carlsbad, CA): 20 µl 25 mm MgCI2, 10 µl 10X RT puhver, 10 µl 0,1 M DTT, 2 µl oligo dt, 2 µl RNAseOut. Seejärel lisati iga rakuliini alikvoodile 2 µl Superscript II Reverse Transcriptase'i ja vastavale rakuliini alikvoodile lisati 2 µl H2O, et viia läbi miinus Reverse Transkriptase negatiivne kontroll. Kõiki proove inkubeeriti järgnevalt: 25 ºC 10', 42 ºC 50', 70 ºC 15'. Proovid paigutati süvaaukudega plaadile ja lahjendati 1,7 ml H2O's. Multipette (Saigan) robotit kasutati mitmekordselt 16,5 µl alikvoodi sisestamiseks igasse auku 96-augulisel PCR plaadil, mis tekitas mitmeid rakuliinide ühekordse kasutusega PCR paneele, mis seejärel suleti ja säilitati -20 ºC juures. Iga auk nendes paneelides esindab esimese ahela cdna-d ligikaudu 100 ng totaalsest RNAst. 82 rakuliini jaotatakse kahele paneelile, katse nr 118A ja nr 118B. Esimese ahela cdna kvaliteeti nendel paneelidel hinnati multiplex PCR katsega ühel paneelil, kasutades kahe laialdaselt avaldunud, kuid keskmise kogusega geenide alguslõike, CLTC (klatriin) ja TFRC (transferriin retseptor C). 0,5 µl igast kiratriin alguslõigust zc42901 (5'CTCATATTGCTCAACTGTGTGAAAAG3'; SEQ ID nr:34), zc42902 (5'ATGTTGCGTTGTATGTTGAAAATCAATT3'; SEQ ID nr:35), ja TFRC alguslõike zc42599 (5'ATGTTGCGTTGTATGTTGAAAATCAATT3'); SEQ ID nr:36), zc42600 (5'TTCTCCACGAGGTAAACAAGTCTAC3'; SEQ ID nr:37) segati 2,5 µl 10X puhvriga ja 0,5 µl Advantage 2 cdna polümeraasi seguga (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), 2µl 2,5 mm dntp segu (Applied Biosystems, Foster City, CA), 2,5 µl 10X Rediload (Invitrogen, Carlsbad, CA), ja lisati katsete nr 118A ja nr 118B paneelide igasse auku. Tsükleerimise parameetrid olid järgnevad: 94 ºC 20, 35 tsüklit 94 ºC 20, 67 ºC 80 ja üks tsükkel 72 ºC 7'. 10 µl igale reaktorile tehti agaroos-geel-elektroforees ja geele skooriti robustse PCR toote esinemise suhtes iga rakuliini igale +RT augule spetsiifilises geenis. mrna ekspressiooni inimese esimese ahela cdna paneelides IL-17RC suhtes

80 EE - EP B1 testiti PCRga senss oligo ZC42756'ga (5'ctctccaggcccaagtcgtgctct3'; SEQ ID nr:38) ja antisenss oligo ZC42757 (5'ttgtcctgggggcctcgtgtctcc3'; SEQ ID nr:39) järgmistel PCR tingimustel iga proovi kohta: 2,5 µl 10X puhver ja 0,5 µl eelis 2 cdna polümeraasi segu (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), 2 µl 2,5 mm dntp segu (Applied Biosystems, Foster City, CA), 2,5 µl 10X Rediload (Invitrogen, Carlsbad, CA), ja 0,5 µl 20 um iga senss ja antisenss alguslõiku. Tsükleerimistingimused olid 94 ºC 2', 35 tsüklit 94 ºC 1', 66 ºC 30, 72 ºC 1,5' ja üks tsükkel 72 ºC 7'. 10 µl igale reaktorile tehti agaroos-geel-elektroforees ja geele skooriti IL-17RC positiivse või negatiivse ekspressiooni suhtes. IL-17RC mrna on laialt avaldunud paljudes rakuliinides, mis väljendab laia koe- ja rakutüüpide spektrit. Täpsemalt on IL-17RC pidevalt avaldunud mitte-t rakkude perifeerse vere rakuliinides, sealhulgas monotsüütides, B rakkudes ja müeloid liini rakkudes. Samuti on IL-17RC mrna usaldusväärselt avaldunud nahast tuletatud rakuliinides. Teisteks rakuliinideks, milles IL-17RC avaldub, on kõik 5 katses uuritud jämesoole rakuliini. NÄIDE 3 mrna jaotus hiire rakuliinide paneelides, kasutades RT PCR Totaalne RNA puhastati laboris kasvatatud ja puhastatud 60 puhkavast ja stimuleeritud rakuliinidest, kasutades Qiagen (Valencia, CA) RNeasy komplekti, järgides tootja juhiseid, fenoolhappe puhastusprotokolli (Chomczynski ja Sacchi, Analytical Biochemistry, 162: , 1987) või Trizoli regendiprotokolli (Invitrogen, Carlsbad, CA). 5 µg totaalset RNAd igast rakuliinist paigutati süvaaukudega 96-augulisele plaadile, 125 µl 3M NaOAc ja 100 µl Pellet Painti (Novagen, Madison, WI) lisati igasse auku, seejärel lõplikku kogust kohandati 1,25 ml H2Oga. Multipette (Saigan) robotit kasutati 2 µl RNA segu alikvootimiseks, millele järgnes mitmekordselt 75 µl EtOH igasse auku 96-augusel PCR plaadil, tekitades mitmeid rakuliinide ühekordse kasutusega RT PCR paneele, mis seejärel suleti ja säilitati 20ºC juures. Seejärel viidi läbi RT PCR skriinimine esmalt paneeli tsentrifuugimise läbi Qiagen (Valencia, CA)96-auguse tsentirfuugiga 10' 6000 pöördel minutis

81 80 EE - EP B1 (RPM). Supernatant eemaldati plaadi ümberkeeramisega absorbeerivale paberile. RNA kuulikesed pesti 100 µl 705 EtOH's, millele järgnes 5' tsentrifuugimist 6000 RPM juures. Supernatant eemaldati jällegi ja plaatidel lasti õhu käes kuivada, kuni allesjäänud EtOH oli aurustunud. RNA kuulikesed resuspendeeriti 15 ml H2Os IL-17RC mrna ekspressiooni hiire rakuliinide RNA paneelides uuriti RT PCRiga zc38910 (5'acgaagcccaggtaccagaaagag3'; SEQ ID nr:40) ja zc38679 (5'aaaagcgccgcagccaagagtagg3'; SEQ ID nr:41) järgmistel RT PCR tingimustel proovi kohta: Superscript One-Step PCR Platinum Taq komplektiga (Invitrogen, Carlsbad, CA). Tsükleerimise tingimused olid: 1 tsükkel 48 ºC juures 30', 94 ºC 2', 35 tsüklit 94 ºC 15, 55 ºC 30, 72 ºC 1,5', seejärel 1 tsükkel 72 ºC 7'. 10 µl igale reaktorile tehti agaroos-geel-elektroforees ja geele skooriti IL-17RC positiivse või negatiivse ekspressiooni suhtes. Hiire IL-17RCmRNA avaldub mitmes hiire rakuliinis, eriti luuüdist tuletatud rakuliinides, sealhulgas osteoblasti, adipotsüüdi ja preadipotsüüdi rakuliinides. Samuti on hiire IL-17RC mrna esindatud mitmetes endokriinsüsteemist võetud proovides, näiteks kõhunäärme stromaalrakuliinidest, kõhunäärme saarekese rakuliinidest, hüpotaalamuse rakuliinidest ning süljenäärmete ja munandite rakuliinidest. NÄIDE 4 20 E. coli's toodetud pil-17f ümbervoltimine ja puhastamine A) Sisestuskeha isoleerimine ja pil-17f eraldamine 25 Pärast valguekspressiooni indutseerimist kas partii kääritamises või loksutuskolbi kultuuris tsentrifuugitakse E.coli vedelikku 1 liitristes pudelites 3000 RPM Sorvalli kiikrootoriga. Rakupasta pesemine kogu saastava bakterivedeliku eemaldamiseks viiakse läbi 50 mm Tris ph 8,0, mis sisaldab 200 mm NaCl ja 5 mm EDTA-d, kuni supernatant on puhas. Seejärel rakukuulikesed suspendeeritakse jääkülmas lagunemispuhvris (50 mm Tris ph 8,0; 5mM EDTA; 200 mm NaCl, 10% sukroosi (w/v); 5 mm DTT; 5 mm Bensamidiini) optilise tiheduse üksusteni 600 nm. Antud poolvedel segu

82 81 EE - EP B1 läbib seejärel 3 korda psi jahutatud APV 2000 labori homogenaatoris, mis tekitab häiritud rakulüsaadi. Lahustumatu osa (sisestuskehad) taastatakse rakulüsaadi tsentrifuugimisega XG ühe tunni vältel 4 ºC juures Sisestuskehakuulike, mis tekib X G pöörde tsentrifuugimisest, kaalutakse ja suspendeeritakse uuesti pesupuhvris (50 mm Tris ph 8, mis sisaldab 200 mm NaCl, 5 mm EDTA; 5 mm DTT; 5 mm bensamidiini) 10 ml pesupuhvris sisestuskeha grammi kohta. Terviklik hajutamine saavutatakse homogeniseerides OMNI rahvusvahelise rootor-staator generaatoriga. Suspensiooni tsentrifuugitakse X G 30 minuti jooksul 4 ºC juures. Pesutsüklit korratakse 3-5 korda, kuni supernatant on puhas. Lõplik, pestud kuulike lahjendatakse 7M guanidiin HCl-is 40 mm Tris puhvris ph 8- ga, mis sisaldab 0,1 M naatriumsulfiiti ja 0,02 M naatriumtetrationaati. Eraldamine ja sulfitolüüs lastakse kergelt segades toimida üle öö 4 ºC juures. Tulemuseks on roosakas lahus, mida seejärel tsentrifuugitakse X G ühe tunni jooksul 4ºC juures ja lahustuvat pil-17f sisaldav selginenud supernatant filtreeritakse. B) pil-17f ümbervoltimise protseduur 20 Lahjendatud sulfitolüüsitud pil-17f volditakse ümber tilklahjendusega jääkülma ümbervoltimispuhvrisse, mis sisaldab 55 mm MES, 10,56 mm NaCl, 0,44 mm KCl, 0,055% PEG (3400 K), 1,1 mm EDTA, 20% glütserooli, 0,5 M guanidiini HCl, 0,75 M arginiini ja glutatioonredoks paari suhtega 1:1 (1 mm GSH : 1 mm GSSG). Ümbervoltimispuhvri ph kohandatakse 6,5 HCl-ga ja pil-17f lisatakse lõplikule, 100 µg/ml kontsentratsioonile. Kord juba lahjendatud, võib segu aeglaselt segada külmas ruumis 72 tundi. C) Toote taastamine ja puhastamine Ümbervolditud pil-17f kontsentreeritakse 10X vs. 10kD läbilaskvuse piiriga membraaniga laboriskaala TFF süsteemis. Edasi see filtreeritakse, kasutades 0,45 mikronilist membraani ja ph kohandatakse 5,1'le, lisades äädikhapet. Kohandatud ph materjal kogutakse katioonvahetuskromatograafiaga Pharmacia SP Fast Flow kolonni, mida tasakaalustatakse 50 mm atsetaatpuhvris, ph 5,1. pil-17f laetakse siseliini doseerimisega 1:5 tasakaalustuspuhvriga voolutasemel 190 cm/h. See

83 EE - EP B1 lahjendus alandab ioonitugevust, mis võimaldab sihtmärgi efektiivset sidumist maatriksile. Kui proovi laadimine on lõppenud, pestakse kolonn nulltaseme absorbeerimisega tasakaalupuhvri abil. Kolonn pestakse 0,4 M NaCl 50 mm atsetaatpuhvris ph 5,1 ja siis voolutatakse seotud valku 5 CV gradiendiga 0,4 M kuni 1,5 M NaCl 50 mm atsetaatpuhvris ph 5,1. Valk voolutub umbes 1 M NaCl juures ja on ligikaudu 85% dimeerne SDS PAGE voolutusfraktsioonide analüüsi järgi. IL-17F sisaldavad fraktsioonid pannakse alusvanni ja kontsentreeritakse 10 kda piiriga ultrafiltreeriva membraani vastu, kasutades Amicon segatud rakku, et valmistada seda lõpliku puhastamise ja puhvervahetuse jaoks suuruskromatograafiaga. D) Suuruspuhvervahetus ja formuleerimine Kontsentreeritud katioontiik (suurusega 3-4% CVst) süstitakse voolutasemel 30 cm/h Pharmacia Suerdex 75 suuruskolumnisse, mis on tasakaalustatud 50 mm naatriumfosfaatpuhvriga, mis sisaldab 109 mm NaCl, ph 7,2. 15 Sümmeetriline eluaattipp, mis sisalda toodet, lahjendatakse 1mg/ml kontsentratsiooniks 50 mm naatriumfosfaatpuhvris, mis sisaldab 109 mm NaCl, ph 7,2. Lõpuks filtreeritakse pil-17f steriilselt 0,2 mikronil, alikvooditakse ja säilitatakse -80 ºC juures. Lõplik protseduuri saagis on 20%. NÄIDE Imetaja lahustuva IL-17RC ekspresioonikonstrukti moodustamine Ekspressioonikonstrukt, mis sisaldab inimese IL-17RC [L21-K451]-mFc1 (hiire BALB/c µ2afc) moodustatakse PCR kattuvuse ja homoloogilise rekombineerimise teel, kasutades DNA fragmenti (SEQ ID nr:42), mis kodeerib IL-17RC polüpeptiidi (SEQ ID nr:43), DNA fragmenti, mis kodeerib mfc1 (SEQ ID nr:44) ja ekspressioonivektorir pzmp20. Fragmendid genereeritakse PCR võimendusega. PCR fragment, mis kodeerib IL-17RC [L21-K451], sisaldab 5' kattuvust pzmp20 vektorjärjestusega optimeeritud koe plasminogeen aktivaatoris pre-pro sektretsiooni juhtivat järjestust kodeerivat piirkonda IL-17RC rakuväline domeeniga, mis kodeerib [L21-K451], ja 3' kattuvust mfc1 kodeeriva piirkonnaga.

84 EE - EP B1 PCR võimendusreaktsioon kasutab 5' oligonukleotiidi [GTTTCGCTCAGCCAGGAAATCCATGCCGAGTTGAGACGCTTCCGTAGACTGG AGAGGCT TGTGGGGCCT; SEQ ID nr:46], 3' oligonukleotiidi [TGTGGCCCTCTGGGCTCCTTGTGGATGTATTTGTC; SEQ ID nr.47] ja matriitsina varem loodud DNA klooni IL-17RCst. PCR fragment, mis kodeerib mfc1, sisaldab 5' kattuvust IL-17RC järjestusega, mfc1 kodeeriva piirkonnaga, ja 3' kattuvust mzmp20 vektoriga polioviiruse sisemise ribosoomi sisendsaidi piirkonnaga. PCR võimendusreaktsioon kasutab 5' oligonukleotiidi [GACAAATACATCCACAAGGAGCCCAGAGGGCCCACA; SEQ ID nr.48], 3' oligonukleotiidi [CAACCCCAGAGCTGTTTTAAGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGTCCG GGA; SEQ ID nr:49] ja matriitsina varem loodud DNA klooni mfc1'st. PCR võimendusreaktsiooni tingimused on: 1 tsükkel, 94 ºC 5 minutit; 35 tsüklit, 94 ºC, 1 minut, millele järgneb 55 ºC, 2 minutit, millele järgneb 72 ºC, 3 minutit; 1 tsükkel, 72 ºC, 10 minutit. PCR reaktsioon segud lastakse läbi 1% agaroosgeeli ja DNA fragmendid, mis on ootuspärase suurusega, eraldatakse geelist, kasutades QLAquick geelieralduskomplekti (Qiagen, kat. nr ). Kaks PCR fragmenti ühendatakse kattuva PCRga. Ligikaudu 1 µl kumbagi geelis eraldatud fragmenti kombineeritakse PCR võimendusreaktsioonis, kasutades 5' oligonukleotiidi [GTTTCGCTCAGCCAGGAAATCCATGCCGAGTTGAGACGCTTCCGTAGACTGG AGAGGCT; SEQ ID nr:46] ja 3' oligonukleotiidi [CAACCCCAGAGCTGTTTTAAGGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGTCCGGG A; SEQ ID nr:49]. PCR tingimused on järgmised: 1 tsükkel, 94 ºC, 5 min; 35 tsüklit, 94 ºC, 1 min; millele järgneb 55 ºC, 2 min, millele järgneb 72 ºC, 3 min; 1 tsükkel, 72 ºC, 10 min. PCR reaktsiooni segu lastakse läbi 1% agaroosgeeli ja DNA fragmendid, mis on ootuspärase suurusega, eraldatakse geelist, kasutades QLAquick geelieralduskomplekti (Qiagen, kat. nr ). Plasmiid pzmp20 on imetaja ekspressioonivektor, mis sisaldab ekspressioonikassetti, millel on MPSV promootor, algussait lineariseerimiseks enne pärmi kombineerimist, otpa signaalpeptiidjärjestus, sisemine riosoomi

85 EE - EP B1 sisestuselement polioviirusest, rakuväline domeen CD8 tüvega transmembraani domeeni C-otsas; E.coli replikatsiooni alguspunkt; imetaja selektsioonimakeri ekspressiooniüksus, millesse kuulub SV40 promootor, võimendaja ja replikatsiooni alguspunkt, DHFR geen ja SV40 lõpetaja; ja URA3 ning CEN-ARS järjestused, mis on vajalikud S. cervisiae selektsiooniks ja replikatsiooniks. Plasmiid pzmp20 lahustatakse BgIII-ga, enne taasmoodustumist pärmis, geelis eraldatud IL-17RC[L21-K451]-mFc1 PCR fragmendiga. 100 µl kompetentse pärmi (S. cerevisiae) rakke kombineeritakse 10 µl IL-17RC[L21-K451]-mFc1 sisestatud DNA ja 10 ng BgIII lahustatud pzmp20 vektoriga, seejärel viiakse segu üle 0,2 cm elektorporatsiooni küvetti. Pärm/DNA segu elektropulseeritakse, kasutades toiteallika (BioRad Laboratories, Hercules, CA) sätteid 0,75 kv (5kV/cm), oomi ja 25 µf. Kuussada µl 1,2 M sorbitooli lisatakse küvetti ja pärm plaaditakse 100 µl ja 300 µl alikvootides kahele URA-D plaadile ja inkubeeritakse 30 ºC juures. 72 tundi hiljem suspendeeritakse Ura+ pärmi muundajad üksikult plaadilt uuesti 1 ml H2O's ja tsentrifuugitakse lühidalt, et pärmi rakud kuulistuksid. Raku kuul suspendeeritakse uuesti 0,5 ml lagunemispuhvris (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mm NaCl, 10 mm Tris, ph 8,0, 1 mm EDTA). Viissada µl lagunemissegu lisatakse Eppendorfi tuubi, mis sisaldab 250 µl happes pestud klaashelmeid ja 300 µl fenoolkloroformi, keeristatakse 3 minutit ja spinnitakse 5 minutit Eppendorfi tsentrifuugis suurimal kiirusel. Kolmsada µl veefaasi kantase üle puhtasse tuubi ja sadestatakse DNAd 600 µl etanoolis, mille järel seda tsentrifuugitakse 30 minutit suurimal kiirusel. Tuub dekanteeritakse ja DNA kuulike suspendeeritakse uuesti 30 µl 10 mm Tris, ph 8,0, 1 mm EDTA. Elektrokompetentse E. coli peremeesrakkude (DH12S) muundamine toimub kasutades 5µl pärm DNA preparaati ja 50 µl E. colise rakke. Rakkude elektropulseeritakse 2,0 kv, 25 µf, 400 oomi. Pärast elektropulseerimist 1 ml SOC (2% Bacto Trüptoon (Difco, Detroit, MI), 0,5% pärmiekstrakti (Difco), 10 mm NaCl, 2,5 mm KCl, 10 mm MgCl2, 10 mm MgSO4, 20 mm glükoosi) lisatakse ja seejärel rakud plaaditakse 50 µl ja 200 µl alikvootides kahel LB AMPplaadile (LB vedelik (Lennox), 1,8% Bacto Agar (Difco), 100 mg/l ampitsilliini). Moodustamiseks vajalikul kolme DNA klooni sisestustel viiakse läbi järjestusanalüüs ja valitakse välja üks kloon, mis sisaldab õiget järjestust. Laia

86 85 EE - EP B1 ulatusega plasmiid DNA isoleeritakse, kasutades kaubanduslikult saadavat komplekti (QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA), järgides tootja juhiseid. NÄIDE Imetaja lahustuva IL-17RC ekspressioonikonstrukti moodustamine, mis avaldab IL-17RC-CCE, IL-17RC-CHIS ja IL-17RC-CFLAGi Ekspressioonikonstrukt, mis sisaldab inimese IL-17RC [L21-K451] koos C-otsa märgisega, milleks on kas Glu-Glu (CEE), kuus His (CHIS) või FLAG (CFLAG), moodustatakse PCR ja homoloogilise rekombineerimise teel, kasutades DNA fragmenti, mis kodeerib IL-17RC[L21-K451] (SEQ ID nr:42) ja ekspressioonivektorit pzmp20. IL-17RCCEEd kodeeriv PCR fragment sisaldab 5' kattuvust pzmp20 vektorjärjestusega optimeeritud koe plasminogeen aktivaatoris pre-pro sektretsiooni juhtivat järjestust kodeerivat piirkonda, IL-17RC rakuvälist domeeni, mis kodeerib [L21-K451], Glu-Glu märgise järjestust (Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu; SEQ ID nr:53), ja 3' kattuvust pzmp20 vektoriga polioviiruse sisese ribosoomi sisestussaidi piirkonnas. PCR võimendusreaktsioon kasutab 5' oligonukleotiidi [GTTTCGCTCAGCCAGGAAATCCATGCCGAGTTGAGACGCTTCCGTAGACTGG AGAGGCT; SEQ ID nr:46], 3' oligonukleotiidi [CAACCCCAGAGCTGTTTTAAGGCGCCTCTAGATTATTCCATGGGGATGTATTC TTCCTTGTGGATGTATTTGTC; SEQ ID nr:50] ja matriitsina eelnevalt loodud IL- 17RC DNA klooni. PCR võimendusreaktsiooni tingimused on järgmised: 1 tsükkel, 94 ºC, 5 min; 35 tsüklit, 94 ºC, 1 min, millele järgneb 55 ºC, 2 min, millele järgneb 72 ºC, 3 min; 1 tsükkel, 72 ºC, 10 min. PCR reaktsiooni segu lastakse läbi 1% agaroosgeeli ja DNA fragmendid, mis on ootuspärase suurusega, eraldatakse geelist, kasutades QLAquick geelieralduskomplekti (Qiagen, kat. nr ). Plasmiid PZMP20 lahustatakse BgIII, enne taasmoodustumist pärmis, geelis eraldatud IL-17RCCEE PCR fragmendiga. Sada µl kompetentse pärmi (S. cerevisiae) rakke kombineeritakse 10 µl IL-17RCCEE sisestatud DNA ja 100 ng

87 EE - EP B1 BgIII lahustatud pzmp20 vektoriga, seejärel viiakse segu üle 0,2 cm elektorporatsiooni küvetti. Pärm/DNA segu elektropulseeritakse, kasutades toiteallika (BioRad Laboratories, Hercules, CA) sätteid 0,75 kv (5kV/cm), oomi ja 25 µf. Kuussada µl 1,2 M sorbitooli lisatakse küvetti ja pärm plaaditakse 100 µl ja 300 µl alikvootides kahele URA-D plaadile ja inkubeeritakse 30ºC juures. 72 tundi hiljem suspendeeritakse Ura+ pärmi muundajad üksikult plaadilt uuesti 1 ml H2O's ja tsentrifuugitakse lühidalt, et pärmi rakud kuulistuksid. Raku kuul suspendeeritakse uuesti 0,5 ml lagunemispuhvris (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mm NaCl, 10 mm Tris, ph 8,0, 1 mm EDTA). Viissada µl lagunemissegu lisatakse Eppendorfi tuubi, mis sisaldab 250 µl happes pestud klaashelmeid ja 300 µl fenoolkloroformi, keeristatakse 3 minutit ja spinnitakse 5 minutit Eppendorfi tsentrifuugis suurimal kiirusel. Kolmsada µl veefaasi kantase üle puhtasse tuubi ja sadestatakse DNAd 600 µl etanoolis, mille järel seda tsentrifuugitakse 30 minutit suurimal kiirusel. Tuub dekanteeritakse ja DNA kuulike suspendeeritakse uuesti 30 µl 10 mm Tris, ph 8,0, 1 mm EDTA. Elektrokompetentse E. coli peremeesrakkude (DH12S) muundamine toimub kasutades 5µl pärm DNA preparaati ja 50 µl E. colise rakke. Rakkude elektropulseeritakse 2,0 kv, 25 µf, 400 oomi. Pärast elektropulseerimist 1 ml SOC (2% Bacto Trüptoon (Difco, Detroit, MI), 0,5% pärmiekstrakti (Difco), 10 mm NaCl, 2,5 mm KCl, 10 mm MgCl2, 10 mm MgSO4, 20 mm glükoosi) lisatakse ja seejärel rakud plaaditakse 50 µl ja 200 µl alikvootides kahel LB AMPplaadile (LB vedelik (Lennox), 1,8% Bacto Agar (Difco), 100 mg/l ampitsilliini). Kolme DNA klooni sisestustel viiakse läbi järjestusanalüüs ja valitakse välja üks kloon, mis sisaldab õiget järjestust. Laia ulatusega plasmiid DNA isoleeritakse, kasutades kaubanduslikult saadavat komplekti (QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA), järgides tootja juhiseid. Sama protseduuri kasutatakse IL-RC valmistamiseks C-otsa his-märgisega, mille moodustavad Gly Ser Gly gly His His His His His His (IL-17RCCHIS; SEQ ID nr:51) või C-otsa FLAG-märgisega, mille moodustavad Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys (IL-17RCCFLAG; SEQ ID nr:52). Nende konstruktide valmistamiseks SEQ ID nr:50 3' oligonukleotiidide asemel; 3' oligonukleotiidi [CAACCCCAGAGCTGTTTAAGGCGCGCCTCTAGATTAGTGATGGTGATGGTGA

88 5 87 EE - EP B1 TGTCCA CCAGATCCCTTGTGGATGTATTTGTC; SEQ ID nr:54] kasutatakse IL- 17RCCHIS'i loomiseks või 3' oligonukleotiidi [CAACCCCAGAGCTGTTTAAGGCGCGCCTCTAGATTACTTATCATCATCATCCTT ATAAT CGGATCCCTTGTGGATGTATTTGTC; SEQ ID nr:55] kasutatakse IL- 17RCCFLAGi loomiseks. NÄIDE 7 IL-17RC-mFc1 liitvalku, IL-17RC-CEE, IL-17RC-CHIS ja IL-17RC-CFLAG C- otsa märgistatud valke tootva lahustuva IL-17RC retseptori ekspressioonikonstruktide sisestus ja avaldumine Kolm 200µg komplekti igast lahustuvast IL-17RC liitvalgust või märgistatud ekspressioonikonstruktist lahustatakse eraldi 200 ühiku Pvul'iga 37 ºC juures kolm tundi, sadestatakse isopropüülalkoholiga ja tsentrifuugitakse 1,5 ml mikrofuugi tuubis. Supernatant dekanteeritakse kuulikeselt ära ja kuulike pestakse 1 ml 70% etanooliga ja lastakse inkubeerida 5 minutit toatemperatuuril. Tuubi spinnitakse mikrofuugis 10 minutit kiirusega PRM ja supernatant dekanteeritakse kuulikeselt ära. Seejärel kuulike suspendeeritakse uuesti 750 µl CHO raku koekultuuri söödas, steriilses keskkonnas, lastakse inkubeerida 60ºC 30 minutit ja lastakse jahtuda toatemperatuurini. Ligikaudu 5 x 106 CHO rakku muudetakse kuulikesteks kõigis kolmes tuubis ja suspendeeritakse uuesti, kasutades DNAsöötme lahust. DNA/raku segud paigutatakse seejärel 0,4 cm sügavusse küvetti ja elektroporeeritakse, kasutades järgmisi parameetreid: 950 µf, kõrge mahtuvus, 300 V. Seejärel küveti sisu eemaldatakse tassidele ja lahjendatakse 25 ml'ni CHO raku koekultuuri söödaga ning asetatakse 125 ml loksutuskolbi. Kolb pannakse inkubaatorisse loksutajale 37 ºC, 6% CO2 ja loksutatakse 120 RPM. CHO rakkudega tehakse toitaineselektsioon, millele järgneb astmeline võimendamine kuni 200 nm metotrekstaati (MTX), seejärel kuni 1 µm MTX. Liitvalgu või märgistatud valgu ekspressioonile rakendatakse Western bloti ja CHO raku tiiki suurendatakse, et saada saaki valgu puhastamiseks. NÄIDE 8 30 Lahustuva IL-17RC ekspressioon

89 88 EE - EP B1 Ekspressiooniplasmiid, mis sisaldab IL-17RC-Tbx-C(Fc9) (SEQ ID nr:64) moodustati homoloogilise rekombineerimise teel, kasutades IL-17RC_Tbx DNA fragmenti ja ekspressioonivektorit pzmp40. Fragment loodi PCR võimendusega, kasutades alguslõike zc44531 ja zc PCR fragment IL-17RC_Tbx sisaldab osalist IL-17RC rakuvälist domeeni kodeerivat piirkonda, mis valmistati kasutades matriitsina eelnevalt loodud IL- 17RC klooni. Fragment sisaldab 5' kattuvust pzmp40 vektorjärjestusega otpa'd kodeerivas piirkonnas, IL-17RC lõiku (aminohappejäägid 21 kuni 451 järjestusest SEQ ID nr:2), siduvat järjestust, trombiinlõike saiti ja 3' kattuvust pzmp40 vektoriga Fc9 kodeerivas piirkonnas. PCR tingimustena kasutati järgmisi näitajaid: 1 tsükkel, 94 ºC, 5 min; 35 tsüklit, 94 ºC, 1 min, millele järgneb 55 ºC, 2 min, millele järgneb 72 ºC, 3 min; 1 tsükkel, 72 ºC, 10 min. PCR reaktsiooni segu lastakse läbi 1% agaroosgeeli ja DNA fragmendid, mis on ootuspärase suurusega, eraldatakse geelist, kasutades QLAquick geelieralduskomplekti (Qiagen, kat. nr ). Plasmiid pzmp40 on imetaja ekspressioonivektor, mis sisaldab ekspressioonikasseti, milles on MPSV promootor, mitu piirangusaiti kodeerivate järjestuste sisestamiseks, otpa signaalpeptiidijärjestus ja järjestus Fc9 jaoks; sisemine ribosoomi sisestussaidi (IRES) element polioviirusest ja rakuväline domeen CD8, mis tüvineb transmembraani domeeni C-otsa poolses otsas; E.coli replikatsiooni alguspunkt; imetaja selektsioonimarker ekspressiooniühik, mis sisaldab SV40 promootorit, võimendajat ja replikaatorit, DHFR geeni ja SV40 lõpetajat; URA3 ja CEN-ARS järjestusi, mis on vajalikud S. cerevisiae selektsiooniks ja replikatsiooniks. See moodustati pzmp21'st (avald. patent nr. US 2003/ A1; hoiustatud Ameerika kultuuride kollektsioonis (American Type Culture Collection (ATCC)) viitega ATCC# PTA-5266). Plasmiid pzmp40 lõigati BgIII'ga, enne taasmoodustumist pärmis PCR fragmendiga. 100 µl kompetentse pärmi (S. cerevisiae) rakke kombineeritakse individuaalselt 10 µl sisestatud DNAga (SEQ ID nr:66) ja 100 ng BgIII lõigatud pzmp40 vektoriga, seejärel viiakse segu üle 0,2 cm elektorporatsiooni küvetti. Pärmi/DNA segu elektropulseeritakse, kasutades toiteallika (BioRad Laboratories,

90 EE - EP B1 Hercules, CA) sätteid 0,75 kv (5kV/cm), oomi ja 25 µf. Kuussada µl 1,2 M sorbitooli lisatakse küvetti ja pärm plaaditakse 100 µl ja 300 µl alikvootides kahele URA-D plaadile ja inkubeeritakse 30 ºC juures. Ligikaudu 72 tundi hiljem suspendeeritakse Ura+ pärmi muundajad üksikult plaadilt uuesti 1 ml H2O's ja spinnitakse lühidalt, et pärmi rakud kuulistuksid. Raku kuul suspendeeritakse uuesti 0,5 ml lagunemispuhvris (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mm NaCl, 10 mm Tris, ph 8,0, 1 mm EDTA). Viissada µl lagunemissegu lisatakse Eppendorfi tuubi, mis sisaldab 250 µl happes pestud klaashelmeid ja 300 µl fenoolkloroformi, keeristatakse 3 minutit ja spinnitakse 5 minutit Eppendorfi tsentrifuugis suurimal kiirusel. Kolmsada µl veefaasi kantase üle puhtasse tuubi ja sadestatakse DNAd 600 µl etanoolis (EtOH), mille järel seda tsentrifuugitakse 30 minutit suurimal kiirusel. Tuub dekanteeritakse ja kuulike pestakse 1 ml 70% etanoolis. Tuub dekanteeritakse ja DNA kuulike suspendeeritakse uuesti 30 µl TE's. Elektorkompetentse E.coli peremeesrakkude (DH12S) muundamine toimus kasutades 5 µl pärm DNA preparaati ja 50 µl rakke. Rakud elektropulseeritakse 2,0 kv, 25 µf ja 400 oomiga. Pärast elektropulseerimist 1 ml SOC (2% Bacto Trüptoon (Difco, Detroit, MI), 0,5% pärmiekstrakti (Difco), 10 mm NaCl, 2,5 mm KCl, 10 mm MgCl2, 10 mm MgSO4, 20 mm glükoosi) lisatakse ja seejärel rakud plaaditakse 50 µl ja 200 µl alikvootides kahel LB AMPplaadile (LB vedelik (Lennox), 1,8% Bacto Agar (Difco), 100 mg/l ampitsilliini). Kolme klooni sisestustel konstrukti jaoks viiakse läbi järjestusanalüüs ja valitakse välja üks kloon, mis sisaldab õiget järjestust. Laia ulatusega plasmiid DNA isoleeritakse, kasutades kaubanduslikult saadavat komplekti (QIAGEN Plasmid Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA), järgides tootja juhiseid Kolm komplekti 200 µl IL-17RC[L21-K451]_Tbx_C(Fc9) konstrukti lahjendati seejärel ükshaaval 200 ühikus Pvu I 37 ºC juures kolm tundi, sadestatakse isopropüülalkoholiga (IPA) ja tsentrifuugitakse 1,5 ml mikrofuugi tuubis. Supernatant dekanteeritakse kuulikeselt ära ja kuulike pestakse 1 ml 70% etanooliga ja lastakse inkubeerida 5 minutit toatemperatuuril. Tuubi spinnitakse mikrofuugis 10 minutit kiirusega PRM ja supernatant dekanteeritakse kuulikeselt ära. Seejärel kuulike suspendeeritakse uuesti 750 µl PF-CHO söödas steriilses keskkonnas, lastakse inkubeerida 60 ºC juures 30 minutit ja lastakse

91 EE - EP B1 jahtuda toatemperatuurini. 5E6 APFDXB11 rakud muudetakse kuulikesteks kõigis kolmes tuubis ja suspendeeritakse uuesti, kasutades DNA-söötme lahust. DNA/raku segud paigutatakse seejärel 0,4 cm sügavusse küvetti ja elektroporeeritakse, kasutades järgmisi parameetreid: 950 µf, kõrge mahtuvus, 300 V. Seejärel küvettide sisu eemaldatakse tassidele ja lahjendatakse 25 ml'ni PF-CHO raku söödaga ning asetatakse 125 ml loksutuskolbi. Kolb pannakse inkubaatorisse loksutajale 37 ºC, 6% CO2 ja loksutatakse 120 RPM. Rakuliinile tehakse toitaineselektsioon, millele järgneb astmeline võimendamine kuni 200 nm metotrekstaati (MTX), seejärel kuni 1 µm MTX. Ekspressiooni kinnitatakse western blotiga ja rakuliini suurendatakse, millele järgneb valgu puhastamine. NÄIDE 9 Lahustuva IL-17RC puhastamine CHP rakkudest CHO rakkudest konditsioneeritud sööde, milles avaldub IL-17RC-TbX-Fc9 (SEQ ID nr:64) kontsentreeriti ligikaudu 10 voldini Pellicon-II ristvoolu süsteemis vastu kahe Biomax 0,1 m3 30kD molekulikaalu piiriga membraanikassetti (Millipore, Bedford, MA). Kontsentreeritud sööte ph kohandati jäise äädikhappega 5,5'le, steriilfiltreeriti 0,2 µm ja seejärel laeti Protein G sefaroos kiirvoolu vaigule (Pharmacia, Piscataway, NJ) jaotuskromatograafia kaudu üle öö 4 ºC juures. Enne kohandatud ph'ga konditsioneeritud söötme laadimist eeltasakaalustati Protein G vaik 5 kolonni ruumalaga (ligikaudu 150 ml) 25 mm naatriumatsetaadiga, 150 mm NaCl, ph 5,5. Filtreeritud, kohandatud ph'ga konditsioneeritud söötme suhe vaiguga oli 33:1 (v/v). Jaotuskromatograafia protseduur viidi läbi toatemperatuuril (ligikaudu 21 ºC). Jaotatud, ph kohandatud, 0,22 µm filtreeritud konditsioneeritud sööde pooriti tühja 5,5 x 20,5 cm klaaskolonni (BioRad, Hercules, CA) ja pakiti gravitatsiooni teel. Kolonni pesti 10 kolonni suuruses (ligikaudu 300 ml) 25 mm naatriumatsetaadis, 150 mm NaCl, ph 5,5. Seotud valk ph-voolutati seejärel 100 mm glütiinis, ph 2,7. 9,0 ml fraktsioonid koguti ja neutraliseeriti kohe 1,0 ml 2,0 M Tris, ph 8,0. Kogutud fraktsioone analüüsiti SDS-PAGE Coomassie värvimisega. Fraktsioonid, mis

92 91 EE - EP B1 sisaldasid IL-17RC-Tbx-Fc9 asetati tassidele ja kontsentreeriti ligikaudu 6 voldini, kasutades 5kD molekulikaalu piiriga Biomax membraani spinn kontsentraatorit (Millipore, Bedford, MA), järgides tootja juhiseid. 5 Kontsentreeritud fraktsioonid dialüüsiti seejärel 4 ºC juures vastu 1X fosfaatpuhverdatud füsioloogilist lahust, ph 7,3 (Sigma, St. Louis, MO), kasutades 7kD molekulikaalu piiriga membraani Slide-A-Lyzer (Pierce, Rckford, IL). 1 x fosfaatpuhverdatud füsioloogilises lahuses, ph 7,3 formuleeritud IL-17RC-Tbx-Fc9 steriilfiltreeriti µm 0,22 enne alikvootimist ja säilitamist -80 ºC juures. NÄIDE IL-17A ja IL-17F sidumine inimese IL-17RCga A) Biotinüleeritud tsütokiinide sidumine sisestatud rakkudega Beebihamstri neerurakud (BHK), mida oli sisestatud IL-17 retseptori (SEQ ID nr:21), inimese IL-17RC (SEQ ID nr:2) või mõlemat antud retseptorit kodeerivate ekspressioonivektoritega, hinnatakse nende võimes siduda biotinüleeritud inim-il- 17A ja inim-il-17f. Rakud kogutakse versene'iga, loendatakse ja lahjendatakse 107 rakuni/ml värvimissöötmes (SM), mis on HBSS pluss 1 mg/ml veise seerumi albumiin (BSA), 10 mm Hepes ja 0,1% naatrium asiid (w/v). Biotinüleeritud inim-il- 17A (SEQ ID nr:14) ja inim-il-17f (SEQ ID nr:16) inkubeeritakse rakkudega jääl 30 minutit erinevates kontsentratsioonides. 30 minuti järel pestakse liigne tsütokiin välja värvimissöötmega ja rakud inkubeeritakse 30 minutit jääl 1:100 streptavidiini lahjenduses, mis on konjugeeritud fükerütriiniks (SA-PE). Liigne SA-PE pestakse välja ja rakud analüüsitakse voolutsütomeetriga. Tsütokiini sidumise hulk mõõdetakse tsütokiini värvimise keskmisest flurestsentsintensiivsusest. Sellest analüüsist saame teada, et inimese IL-17A seob nii inimese IL-17R kui IL-17RC võrdsel määral. Ka IL-17F seob inimese IL-17RC sarnasel tasemel, kuid IL-17R seob see küll tuvastatavalt, kuid oluliselt väiksemal määral kui IL-17A puhul. B) Biotinüleeritud tsütokiinide sidumine inimese perifeerse vere mononukleaarsete rakkudega Inimese perifeerse vere mononukleaarseid rakke (PBMC) valmistati terviklikust

93 EE - EP B1 verest ficoll tihedusgradient tsentrifuugimise teel. PBMC 107 rakku/ml inkubeeriti samaaegselt biotinüleeritud IL-17A või IL-17Fga 1 µg/ml ja florokroomkonjugeeritud, spetsiifiliste rakupinna valkude antikehadega, mida kavandati eristama erinevaid valge verelible rakuliine. Antud markerite hulka kuuluvad CD4,CD8,CD19,CD11b, CD56 ja CD16. Liigsed antikehad ja tsütokiinid pestakse välja ja spetsiifilised tsütokiiniseosed tuvastatakse SA-PEga inkubeerimise teel, nagu kirjeldatud ülal. Proove analüüsiti voolutsütomeetriga ja sellest analüüsist saame teada, et inimese IL-17A seob pea kõiki uuritud PBMC populatsioone, kuid inimese IL-17F ei seo tuvastatavalt ühtegi nimetatud populatsioonidest. C) Biotinüleeritud inim-il-17a ja IL-17F spetsiifilise sidumise inhibeerimine märgistamata tsütokiiniga Sidumise uuringuid viidi läbi ülalkirjeldatud viisil, kuid liigine märgistamata inimese IL-17A ja IL-17F kaasatakse sidumisreaktsiooni. BHK rakkudega teostatud uuringutes varieeriti märgistamata tsütokiinide hulka üle kontsentratsioonide valiku ja me leidsime, et märgistamata IL-17A lisamine teostas nii IL-17A kui IL-17F sidumise nii IL-17RC kui IL-17R. Kuid vaatamata sellele, et märgistamata IL-17F teostas nii IL-17A kui IL-17F sidumise IL-17RCga, ei teosta ta efektiivselt sidumist IL-17Rga. See näitab, et nii IL-17A kui IL-17F seovad spetsiifiliselt IL-17RC ja et nad seovad saidis, mis ei ole ei oluliselt identne ega kattuv, kuna nad võistlevad sidumises. Samuti teostab IL-17A küllaltki nõrgalt IL-17F sidumist IL-17Rga, näidates, et need kaks tsütokiini seovad ka samasid IL-17R piirkondasid, kuid IL- 17F seob IL-17R palju väiksema afiinsusega, võrreldes IL-17RCga. D) Biotinüleeritud inim-il-17a ja IL-17F spetsiifilise sidumise inhibeerimine lahustuva IL-17RC ja IL-17Rga Sidumise uuringuid viidi läbi ülalkirjeldatud viisil, kuid sidumisreaktsioonis kaasati lahustuv vorm IL-17RC või IL-17R. Antud lahustuvad retseptorid on liitvalgud, mis on tuletatud iga inimese lgg1 konstant (Fc) piirkonnaga liitunud retseptori rakuvälisest domeenist. Me leidsime, et lahustuv IL-17RC inhibeerib nii inimese IL- 17A kui IL-17F sidumist IL-17R ja IL-17RC seotud BHK rakkudega. Kuid vaatamata sellele, et lahustuv IL-17R inhibeerib IL-17A sidumist mõlema retseptoriga, ei takista see efektiivselt IL-17F sidumist IL-17RCga, mis on

94 93 kooskõlaline vähese IL-17F sidumisega IL-17Rga. EE - EP B1 NÄIDE 11 IL-17A ja IL-17F sidumine IL-17RCga A) Sidumise inhibeerimine külma ligandiga hil-17rc (SEQ ID nr:2) ja IL-17R (SEQ ID nr:21) sisestatud BHK rakud plaaditi rakku/auk 24-augulisele alusele (Costar 3527) kaks päeva enne katse sooritamist. IL-17A (SEQ ID nr:14) ja IL-17F (SEQ ID nr:16), mis olid radiomärgistatud joodtera meetodil, lisati ükshaaval aukudesse kolmekordselt 10 ng/ml, koguhulgaga 250 ul/auk sidumispuhvris (RPMI 1640 sööde (JRA M) 10mg/ml veiseseerumi albumiinis (Gibco )). Külmad võistlejad lisati 100-voldisesse mooli ülejääki. Testitud võistlejate hulka kuulusid IL-17A, IL- 17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E, IL-17F ja IL-21. Auke inkubeeriti jääl ühe tunni jooksul, misjärel neid pesti kaks korda PBSga (Invitrogen ) ja ühel korral kõrge soolalahusega (1,5 M NaCl, 50 mm HEPES ph7,4). Augud ekstraheeriti 500 ul 0,8 M NaOHga 30 minutit toatemperatuuril ja gammaloenduriga (Packard Cobra II A5005) loendati ühikuid minutis. Tulemused näitasid, et 100 x mooli külma IL-17A ja IL-17F suutsid vähendada 125l IL-17A sidumist BHK hil-17rc ligikaudu 7 volti, kuid IL-17B, C, D, E ja IL-21 ei omanud mingit mõju sidumisele. 100 x mooli külma IL-17A vähendas 125l IL-17A sidumist BHK IL-17Rga ligikaudu 4 volti, kuid IL-17B, C, D, E ja IL-21 ei omanud mingit mõju sidumisele. 100 x mooli külma IL-17F vähendas 125l IL-17F sidumist BHK IL-17RCga ligikaudu 4 volti, kuid IL-17B, C, D, E ja IL-21 ei omanud mingit mõju sidumisele. B) Sidumise inhibeerimine lahustuva retseptoriga 25 hzytor4 (SEQ ID nr:2) ja IL-17R (SEQ ID nr:21) sidumine sisestatud BHK rakkudega viidi läbi sarnaselt ülalkirjeldatuga, kuid külma ligandi asemel kasutati võrdluses 100 volti mooli ülejääki lahustuvat hil-17rcx1/fc9 (näide 8) ja lahustuvat IL-17R/FC (saadud R&D; Ref. 177-IR) kasutati võrdluses külma ligandi asemel. Rakud pesti, eraldati ja loendati, nagu A) osas kirjeldatud.

95 C) Sidumise küllastamine 94 EE - EP B Sisestatud BHK rakud plaaditi 24-augulisele alusele, nagu esimeses osas kirjeldatud. Radiomärgistatud IL-17A ja IL-17F lisati alguses kontsentratsiooniga 4 nm kaheksas 1:3 lahjenduses (1,83 pm kontsentratsiooniga) kolmekordselt, koguhulgaga 50 µl/auk sidumispuhvris. Eraldi lisati 100 volti mooli ülejääki külma ligandit igale lahjenduspunktile. Rakud pesti, eraldati ja loendati, nagu ülal kirjeldatud. Spetsiifilisi loendusi minutis toodi välja radiomärgistatud ligandi kontsentratsiooni vastu, mida lisati 100 voldi ülejäägi loenduste lahutamisel mitte võistelnud loendustest igas lahjendamispunktis. Need normaliseeritud andmed joonistati välja, et tekitada küllastunud sidumise kõverad iga radiomärgistatud ligandi ja sisestatud BHK rakkude kombinatsiooni jaoks. Tabel 7 näitab kõigist kolmest katsest arvutatud afiinsusväärtusi. Tabel 7 15 Ühe-saidiline sidumiskõver on kõige lähedasem IL-17A & IL-17F puhul, mis seovad IL-17R. Kahe-saidiline sidumiskõver on kõige lähedasem IL-17A ja IL-17F puhul, mis seovad hil-17rc. Madala afiinsuse sidumissaidil oli väga madal afiinsus ja muutus kolme katse jooksul oluliselt. NÄIDE Hiire Nih3t3 rakkude vastus inimese IL-17A ja IL-17Fle A) Raku plaatimine ja kz142 adenoviirus reporteri nakkus Nih3t3 rakud, mis on tuletatud hiire fibroplasti (kirjeldatud ATCCs) Nih3t3'st, plaaditi 5000 rakku/auk tahkele valgele, rakukultuuriga kaetud 96-augulisele plaadile, (kat. nr Costar) kasutades DMEM/10% FBS, plaatimissööt

96 95 EE - EP B1 eemaldati ja kz142 adenoviiruse osakesed nakatuskordsusega 5000 osakest/rakk valmistati DMEM/1% FBSis, mis sisaldab glutamiini, ja parandati püruvaadiga ja kasvatati üle öö 37ºC ja 5% CO2 juures B) Lutsiferaas katse IL-17A ja F aktiivsuse mõõtmiseks kz142 adenoviiruse reporteriga nakatatud nih3t3 rakkude suhtes Pärast öö jooksul inkubeerimist adenoviiruse osakeste reporteriga valmistati inimese IL-17A ja IL-17F ligandravimid seerumivabas söötmes (parandatud 0,28% BSA). Adenoviiruse osakesed ja sööde eemaldati ja sobivad ligandi doosid anti kolmekordsetena. Inkubeerimist 37ºC juures 5% CO2 juures jätkati 4 tundi ning seejärel sööde eemaldati, rakud lagundati 15 minutit ja mõõdeti keskmine fluorestsentsi intensiivsust (MFI), kasutades lutsiferaas katse süsteemi ja reagente (kat. nr. e1531 Promega. Madison, WI) ja mikroplaat luminomeetrit. Tuvastati aktiivsus inimese IL-17A ja IL-17F kontsentratsioonides 0,1 kuni 1000 ng/ml, mis annab EC50 väärtusi ligikaudu 50 ng/ml mõlema ligandi kohta. Need andmed võimaldavad oletada, et nih3t3 rakud kannavad retseptoreid neile liganditele ja et IL-17A ja IL-17F aktiveerivad NfKb/Ap-1 transkriptsioonifaktori. NÄIDE 13 Hiire nih3t3 rakkude ekspressioon nii IL-17RAs kui IL-17RCs 20 nih3t3 RNA RTPCR-analüüs tõestas, et need rakud on positiivsed nii IL-17RA kui IL-17RC suhtes, mis on kooskõlas nende nfkb/ap1 vastusega inimese IL-17A kui IL-17F suhtes, mida vahendatakse läbi ühe või mõlema antud retseptori. RTPCR DETAILID: A) Hiire IL-RC PCR 25 Esimese ahela cdna valmistati totaalsest RNAst, mis oli isoleeritud nih3t3 rakkudest, kasutades tavapäraseid meetodeid. PCR rakendati hot star polümeraasi ja tootja soovitusi (Qiagen, Valencia, CA), kasutades senss alguslõiku zc38910, 5' ACGAAGCCCAGGTACCAGAAAGAG 3' (SEQ ID nr:56) ja antisenss alguslõiku zc38679, 5' AAAAGCGCCGCAGCCAAGAGTAGG 3' (SEQ ID nr: 57) ja 35 tsüklit võimendust. Agaroos geel-elektroforees tõi välja ootuspärase 850 bp

97 suurusega üksiku robustse amplikoni. 96 EE - EP B1 B) Hiire IL-17RA PCR 5 10 Esimese ahela cdna valmistati nih3t3 rakkudest isoleeritud totaalsest RNAst, kasutades tavapäraseid meetodeid. PCR rakendati kasutades hot star polümeraasi ja tootja soovitusi (Qiagen, Valencia, CA), kasutades senss alguslõiku zc38520, 5' CGTAAGCGGTGGCGGTTTTC 3' (SEQ ID nr:58) ja antisenss alguslõiku zc38521, 5' TGGGCAGGGCACAGTCCAG 3' (SEQ ID nr:59) ja 35 tsüklit võimendust. Agaroos geel-elektroforees tõi välja ootuspärase 498 bp suurusega üksiku robustse amplikoni. NÄIDE 14 Ap1/nfkb transkriptsioonifaktorit väljendava stabiilse nih3t3 katseklooni loomine Ülalkirjeldatud hiire nih3t3 rakuliin sisestati stabiilselt koos kz142 ap1/nfkb reporteri konstruktiga, mis sisaldab neomütsiin-selektsioonimarkerit. Neo resistantne sisestustass plaaditi klonaaltihedusel. Kloonid isoleeriti, kasutades kloonimisringe, ja skriiniti lutsiferaas katsega, kasutades indutseerijana inimese IL-17A ligandit. Valiti välja kõrgeima keskmise fluorestsentsintensiivsusega (MFI) (ap1/nflcb lutsiferaasi kaudu) ja madalaima taustaga kloonid. Valiti stabiilne sisestusrakuliin ja nimetati nih3t3/kz NÄIDE 15 aktivatsiooni inhibeerimine inimese IL-17A ja IL-17F abil hiire nih3t3 rakkudes, kasutades lahustuvat IL-17RC ja IL-17RA/FC kimääre 25 IL-17RC või IL-17RA lahustuvaid vorme kasutati antagonistidena inimese IL-17A ja IL-17F ap1/nfkb elementide aktiveerimiseks lutsiferaas katses. Antud lahustuvad retseptorid on liitvalgud, mis on tuletatud iga retseptori rakuvälisest domeenist, mis on liidetud inimese lgg konstant (Fc) piirkonnaga. Osteti lahustuv inimese IL-17R FC liitvalk (rekombinantne inimese IL-17R/FC kimäär, kat. nr. 177-IR-100, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN). Lahustuv IL-17R/FC kimäär (IL-17RCsR/FC9) moodustati ülalkirjeldatud viisil. Me leidsime, et liigne IL-17RCsR/FC9 ja inimese

98 97 EE - EP B1 IL-17R/FC kimäär inhibeerivad EC50 tasemeid nii inimese IL-17A kui IL-17F vahendamist ap1/nfkb aktiveerimist hiire nih3t3/kz142.8 katserakuliinis. 5 IL-17RCsR/FC9 valk näitas suurimat potentsiaali IL-17F aktiveerimise antagoniseerimisel ja IL-17RsR/FC kimäär näitas suurimat potentsiaali IL-17A aktiveerimise antagoniseerimisel. NÄIDE 16 IL-17F mrna kasvatatakse astma hiiremudelis IL-17F mrna tasemeid mõõdeti tundlikustamisel ja õhutee nakatumise esilekutsumise mudelis hiirte puhul. 8 kuni 10 nädala vanuste hiirte rühmad tundlikustati, süstides kõhukelmesiseselt 10 µg rekombinanti Dermatophagoid pteronüssinus allergeen 1 (DerP1) (Indoor biotechnologies, Cardiff, UK) 50% Imject Alum (Pierce) päevadel 0 ja 7. Seitse päeva hiljem hiiri nakatati 3 järjestikusel päeval (päevad 14, 15 ja 16) 20 µg DerP1, 50 ul PBS. Neli hiirt esindasid seda gruppi. Negatiivsesse kontrolli kuulus 5 hiirt, kellele tehti fosfaatpuhverdatud füsioloogilist lahusega (PBS) tundlikustamine, millele järgnes PBS nakatamine. Lisaks 3 hiirele tehti DerP1 tundlikustamine, millele järgnes PBS nakatamine. 48 tunni pärast allergeeni või kontrollnakatamist koguti saak kogu kopsu koest ja RNA isoleeriti. Esimese ahela cdna valmistati kasutades võrdset hulka RNA-d iga subjekti jaoks. IL-17F PCR rakendati kasutades Qiagen hotstar polümeraasi (Qiagen, Valencia, CA), järgides tootja soovitusi. IL-17F PCR kasutati 35 tsüklit võimendamist senss alguslõiguga zc46098, 5' ACTTGCCATTCTGAGGGAGGTAGC 3' (SEQ ID nr:60) ja antisenss alguslõiku 46099, 5' CACAGGTGCAGCCAACTTTTAGGA 3' (SEQ ID nr:61). Näitamaks, et matriitsi kvaliteet on ühtne kõigi subjektide puhul, rakendati Beta Aktiin PCR samale hulgale igast matriitsist, mida kasutati IL-17F võimenduses. B aktiin PCR sisaldas 25 tsüklit PCR senss alguslõiguga zc44779, 5' GTGGGCCGCTCTAGGCACCA 3' (SEQ ID nr:62) ja antisenss alguslõiguga zcc44776, 5' CGGTTGGCCTTAGGGTTCAGGGGGG 3' (SEQ ID nr:63). Kõik neli hiirt DerP1 tundlikustatud ja DerP1 nakkuse ravi grupist (astma simulatsioon) näitasid robustse IL-17F võimendumist. Seevastu negatiivsel

99 5 98 EE - EP B1 kontrollil täheldati nõrka IL-17F võimendust, sealhulgas 3 kolmest subjektist esindasid DerP1 tundlikustatud/pbs nakkuse ravi gruppi ja 5 viiest subjektist PBS tundlikustatud/pbs nakkuse ravi gruppi. B aktiin võimendus oli vähemalt sama robustne negatiivsetel kontrollidel kui simuleeritud astmaga subjektidel, mis tõestas, et nõrk negatiivne IL-17F võimenduse kontroll ei tulene probleemidest matriitsiga. NÄIDE 17 COS raku sisestamine ja sekretsioonilõks A) Cos raku sisestamine ja sekretsioonilõksu katsed näitavad, et IL-17RCsR/Fc9 ja IL-17F on retseptor/ligand paar Sekretsioonilõksu katset kastutati inimese IL-17RC (SEQ ID nr:2) kõrvutamiseks inimese IL-17Fga (SEQ ID nr:16). Lahustuvat IL-17RCsR/Fc9 liitvalku (näide 8) kasutati sekretsioonikatses sidumise reagendina. SV40 ori, mis sisaldab ekspressioonivektoreid, mis sisaldavad inimese IL-17B, C, D, E ja F cdna-d, sisestati ajutiselt COS rakkudesse. IL-17RCsR/Fc9 sidumine sisestatud COS rakkudesse viidi läbi kasutades sekretsioonilõksu katset, mida kirjeldatakse allpool. Positiivset sidumist IL-17RCsR/Fc9 täheldati ainult inimese IL-17Fga. Need tulemused näitavad uudset leidu, et inimese IL-17RC ja IL-17F on retseptor/ligand paar. B) COS raku sisestamised COS raku sisestamist teostati järgmiselt: 92 ul seerumivabasse DMEM söötmesse (55 mg naatriumpüruvaati, 146 mg L-glutamiini, 5 mg transferriini, 2,5 mg insuliini, 1µg seleeniumi ja 5 mg fetuiini 500 ml DMEMis) tassidele asetatud 3ul DNA ja 5 ul Lipofectamine segu inkubeeriti toatemperatuuril 30 minutit ja lisati seejärel 400 ul seerumivaba DMEM söödet. See 500 ml segu lisati 1,5 x 105 COS rakku/auk, mis plaaditi 12-augusele koekultuuri plaadile ja inkubeeriti 5 tundi 37ºC juures. Lisati 500 ul 20% FBS DMEM söödet (100 ml FBS, 55 mg naatriumpüruvaati ja 146 mg L-glutamiini 500 ml DMEMis) ja inkubeeriti ühe öö jooksul.

100 C) Sekretsioonilõksu katse 99 EE - EP B Sekretsioonilõks teostati järgmiselt: sööde loputati maha PBSga rakkudelt ja kinnitati 15 minutiks 1,8% formaalaldehüüdiga PBSis. Seejärel rakud pesti TNTga (0,1 M Tris-HCL, 0,15 M NaCl, ja 0,05% Tween20 vees) ja immutati 0,1% Triton- X'ga PBS'is 15 minutit ja seejärel pesti uuesti TNTga. Rakud blokeeriti 1 tunniks TNBga (0,1 M Tris-HCL, 0,15 M NaCl ja 0,5% Blocking Reagenti (NEN Renaissace TSA-Direct komplekt) vees) ja pesti uuesti TNTga. Rakke inkubeeriti tund aega 1µg/ml inimese IL-17RCxlsr/FC9 lahustuvas retseptori liitvalgus. Rakud pesti seejärel TNTga. Rakke inkubeeriti veel tund aega 1:200 lahjenduses kitse inimesevastase lg-hrp (Fc spetsiifiline). Uuesti pesti rakke TNTga. Positiivset sidumist tuvastati fluorestseiin türamiidi reagendiga, mida oli lahjendatud 1:50 lahjenduspuhvris (NEN komplekt) ja inkubeeritud 4-6 minutit ja pestud TNTga. Rakud säilitati Vectashield Mounting söötmes (Vector Labs Burlingame, CA) lahjendatud 1:5 TNTs. Rakke visualiseeriti FITC filtriga fluorestseerivas mikrosoobis. NÄIDE 18 Hiire inimesevastase IL-17RC monoklonaalse antikeha loomine A. Immuniseerimine anti-il-17rc antikehade loomiseks 1. Lahustuv IL-17RC-muFc Kuue kuni kaheteistkümne nädala vanused muutmata või IL-17RC väljalülitusega hiired immuniseeritakse kõhukelmesisese süstiga µg lahustuva inim-il- 17RC mufc valguga (näide 23), segatud suhtel 1:1 (v:v) Ribi adjuvandiga (Sigma), kahenädalase tsükliga. Seitse kuni kümme päeva pärast kolmandat immuniseerimist võetakse vereproovid retroorbitaalsest veritsemisest, kogutakse seerumit ja hinnatakse selle võimet inhibeerida IL-17 või IL-17F sidumist IL- 17RCga neutraliseerimistestis (nagu käesolevas töös kirjeldatud) ja värvitakse FACS värvimistestiga IL-17RC versus sisestamata 293 rakud. Hiirte immuniseerimist ja vereproovide võtmist ning hindamist jätkatakse ülalkirjeldatud viisil, kuni neutraliseerimistiitrid jõuavad teatud tasemele. Sel ajal süstitakse

101 5 100 EE - EP B1 kõrgeima neutraliseerimistasemega hiirtele soonesiseselt µg lahustuvat IL- 17RC-Fc valku PBSis. Kolm päeva hiljem kogutakse saaki nende hiirte põrnalt ja lümfisõlmedelt ja kasutatakse hübridoomi loomiseks, kasutades näiteks hiire müeloomi (P3-X63-Ag ) rakke või teisi meetodi sobilikke rakuliine, kasutades tavapäraseid tuntud meetodeid (vt nt Kearney, J.F. et al., J. Immunol. 123: , 1979; ja Lane, R.D. J Immunol Methods 81: , 1985). 2. Lahustuvad IL-17RC, IL-17RC-CEE, IL-17RC-CHIS, IL-17RC-CFLAG Kuue kuni kaheteistkümne nädala vanused muutmata või IL-17RC väljalülitusega hiired immuniseeritakse kõhukelmesisese süstiga µg lahustuvat inimese IL- 17RC-CEE, IL-17RC-CHIS või IL-17RC-CFLAG, segatud suhtel 1:1 (v:v) Ribi adjuvandiga (Sigma), kahenädalase tsükliga. Seitse kuni kümme päeva pärast kolmandat immuniseerimist võetakse vereproovid retroorbitaalsest veritsemisest, kogutakse seerumit ja hinnatakse selle võimet inhibeerida IL-17 või IL-17F sidumist IL-17RCga neutraliseerimistestis (nagu käesolevas töös kirjeldatud) ja värvitakse FACS värvimistestiga IL-17RC versus sisestamata 293 rakud. Hiirte immuniseerimist ja vereproovide võtmist ning hindamist jätkatakse ülalkirjeldatud viisil, kuni neutraliseerimistiitrid jõuavad teatud tasemele. Sel ajal süstitakse kõrgeima neutraliseerimistasemega hiirtele soonesiseselt µg lahustuvat IL- 17RC-CEE, IL-17RC-CHIS või IL-17RC-CFLAG antigeen valku PBSis. Kolm päeva hiljem kogutakse saaki nende hiirte põrnalt ja lümfisõlmedelt ja kasutatakse hübridoomi loomiseks, kasutades näiteks hiire müeloomi (P3-X63- Ag ) rakke või teisi meetodi sobilikke rakuliine, kasutades tavapäraseid tuntud meetodeid (vt nt Kearney, J.F. et al., J. Immunol. 123: , 1979; ja Lane, R.D. J Immunol Methods 81: , 1985). 3. P815 sisestajad, mis avaldavad IL-17RC Kuue kuni kaheteistkümne nädala vanused emased DBA/2 hiired immuniseeritakse kõhukelmesisese süstiga 1x 105 elus sisestatud P815 rakke, näiteks P815/IL-17RC rakke (nt 0,5 ml rakutihedusega 2 x 105 rakku/ml). Enne süstimist hoitakse rakke eksponentsiaalses kasvufaasis. Süstimiseks korjatakse rakkudelt saaki, pestakse kolm korda PBSga tihedusega 2 x 105 rakku/ml. Selles mudelis tekkis hiirtel astsiit kasvaja 2-3 nädala jooksul ja jõudsid surmani 4-6

102 EE - EP B1 nädalaga, kui immuunvastust sisestatud sihtmärk-antigeeni ei aktiveeritud. Kolme nädala pärast immuniseeriti hiiri, kellel ei esinenud kõhupaisumist (astsiidi tunnus), nagu ülal kirjeldatud, 2-3 nädalaste vahedega. Seitse kuni kümme päeva pärast teist immuniseerimist võetakse vereproovid retroorbitaalsest veritsemisest, kogutakse seerumit ja hinnatakse selle võimet inhibeerida IL-17 või IL-17F sidumist IL-17 või IL-17RCga neutraliseerimistestis (nagu käesolevas töös kirjeldatud) ja värvitakse FACS värvimistestiga IL-17RC versus sisestamata 293 rakud. Hiirte immuniseerimist ja vereproovide võtmist ning hindamist jätkatakse ülalkirjeldatud viisil, kuni neutraliseerimistiitrid jõuavad teatud tasemele. Sel ajal süstitakse kõrgeima neutraliseerimistasemega hiirtele kõhukelmesiselt 1 x 105 elus sisestatud P815 rakke. Neli päeva hiljem kogutakse saaki nende hiirte põrnalt ja lümfisõlmedelt ja kasutatakse hübridoomi loomiseks, kasutades näiteks hiire müeloomi (P3-X63-Ag ) rakke või teisi meetodi sobilikke rakuliine, kasutades tavapäraseid tuntud meetodeid (vt nt Kearney, J.F. et al., J. Immunol. 123: , 1979; ja Lane, R.D. J Immunol Methods 81: , 1985). Teise võimalusena kirjeldatud immuniseerimise skeemile elus sisestatud P815 rakkudega on 1,5 x 106 ärritatud sisestatud rakkude kõhukelmesisene süstimine iga 2-3 nädala tagant. See lähenemine ei põhjusta loomadel astsiiti ega surma. Selle asemel jälgitakse loomadel immuunvastuse neutraliseerimst IL-17RC'le nende seerumis, nagu ülal kirjeldatud, alates veritsusega pärast teist immuniseerimist. Kui neutraliseerimistiitrid on jõudnud maksimumtasemeni, süstitakse kõrgeima neutraliseerimistasemega hiirtele enne sulandamiseelselt, kõhukelmesiseselt 5 x 106 ärritatud rakku ja neli päeva hiljem kogutakse saaki nende hiirte põrnalt ja lümfisõlmedelt ja kasutatakse hübridoomi loomiseks, kasutades näiteks hiire müeloomi (P3-X63-Ag ) rakke või teisi meetodi sobilikke rakuliine, kasutades tavapäraseid tuntud meetodeid (vt nt Kearney, J.F., supra; ja Lane, R.D., supra). B) Hübridoomi ühenduste skriinimine antikehade kohta, mis seovad IL-17RC ja inhibeerivad IL-17 või IL-17F sidumist IL-17RCga 30 Kolm erinevat esmast skriinimist viiakse läbi hübridoomi supernatantidega 8-10 päeva pärast sulandamist. Esimese katse jaoks testiti supernatantide antikehade võimet siduda plaaditud lahustuvat inimese IL-17RC, IL-17RC-muFc, IL-17RC-

103 EE - EP B1 CEE, IL-17RC-CHIS või IL-17RC-CFLAG valku ELISAga, kasutades HRPkonjugeeritud kitse hiirevastast kappa ja anti-lambda kerge ahela teise astme reagenti, et tuvastada seotud hiire-antikehasid. Tõestamaks IL-17RC portsjoni spetsiifilisust IL-17RC liitvalkudega, hinnati esimese katse positiivseid supernatante irrelevantse valguga, mis oli ühendatud sama hiire Fc piirkonnaga (mg2a), EE järjestuse, HIS järjestuse või FLAG järjestusega. Antikeha nendes supernatantides, mis sidusid IL-17RC liitvalke ja mitte irrelevantse mufc või teiste liitvalgu järjestust sisaldavate valkudega, peeti IL-17RC-spetsiifilisteks. Teise katse jaoks hinnati kõigist hübridoomi supernatantidest pärit antikehade puhul ELISAga nende võimet inhibeerida biotinüleeritud inim-il-17 või biotinüleeritud inim-il-17f sidumist plaaditud IL-17RC-muFc või IL-17RC-liitvalkudega. Kõiki supernatantide puhul, mis sisaldasid spetsiifiliselt IL-17RC siduvaid antikehasid, sõltumata sellest, kas nad inhibeerisid IL-17 või IL-17F sidumist IL- 17RC või mitte ELISA katses, testiti nende võimet inhibeerida IL-17 või IL-17F sidumist IL-17RC sisestatud Baf3 või BHK rakke või normaalseid inimese bronhi epiteelrakke. Kõik supernatandid, mis olid positiivse neutraliseerimisega kas IL-17 või IL-17F inhibeerimise katses või nii IL-17 kui IL-17F inhibeerimise katses, oli tõepoolest tingitud antikehast, mis spetsiifiliselt seob IL-17RC retseptorit. Lisaks, kuigi FACS analüüs viidi läbi anti-lgg teise astme reagendiga, näitasid spetsiifilise FACS positiivsed tulemused, et antikeha neutraliseerimine tulenes tõenäoliselt lgg klassist. Nende vahenditega tuvastati üldine auk, mis sidus IL-17RC plaaditud ELISAga, inhibeeris IL-17 või IL-17F sidumist IL-17RCga ELISAl põhinevas inhibeerimiskatses, blokeeris IL-27 ja IL-17F interaktsiooni IL-17RC-sisestatud vastavalt Baf3 või BHK rakkudega ja oli tugevalt positiivne IL-17RC-sisestatud Baf3 või BHK rakkude värvimisel hiirevastase lgg teise astme reagendiga. Kolmas katse seisnes esmaste inimese bronhi epiteelrakkude, mis avaldavad IL- 17RC ja mida võib indutseerida IL-8 või IL-6 sekretsiooniks vastusena IL-17F ravile. Spetsiifilist monoklonaalset antikeha testitakse vastusena IL-17 või IL-17F, nagu käesolevas töös kirjeldatud. 30 Teise võimalusena võib kasutada monoklonaalse antikeha anti-il-17rc, vahendatud IL-17 või IL-17F, inhibeerimist indutseeritud lutsiferaas-tootmises nih3t3 või mõnel teisel IL-17RC sisaldavatel rakkudel, kasutada koos ühega

104 103 EE - EP B1 ülalkirjeldatud bioaktiivsetest neutraliseerimiskatsetest või selle asemel. Käesolevas töös kirjeldatakse nfkb-vahendatud lutsiferaas katset nih3t3 rakkudes. C) Hübridoome tootva anti-il-17rc spetsiifilise antikeha kloonimine Hübridoomi rakuliine, mis toodavad spetsiifilist anti-il-17rc mab, mis neutraliseerib IL-17 ja IL-17F sidumist sobivalt sisestatud BaF3 või BHK rakkudega, kloonitakse tavapärases madala tihedusega lahjendusvedelikus (vähem kui 1 rakk augu kohta). Ligikaudu 5-7 päeva pärast plaatimist kloonid skriinitakse ELISAga näiteks plaaditud inimese IL-17RC-muFc'ga, millele järgneb positiivsete aukude uus testimine ELISAga irrelevantsele mufc sisaldavat liitvalku, nagu ülal kirjeldatud. Valitud kloone, kelle supernatandid seovad IL-17RCmuFc'ga ja mitte irrelevantse mufc sisaldava liitvalguga, kinnitatakse spetsiifiline antikeha aktiivsuse suhtes, korrates mõlemat neutraliseerimiskatset ning FACS analüüsi. Kõiki valitud IL-17RC antikeha positiivseid kloone kloonitakse vähemalt kaks korda, et tagada kloonitavust ja hinnata antikeha tootmise stabiilsust. Lisakloonimised viiakse läbi ja skriinitakse, nagu ülal kirjeldatud, kuni eelistatavalt vähemalt 95% saadud kloonidest on positiivsed anti-il-17rc antikeha tootmise neutraliseerimises. D) Anti-IL-17RC mabs äratundva molekuli biokeemiline kirjeldus Biokeemiline kinnitus, et sihtmärk-molekul IL-17RC tuntakse tõepoolest ära oletatava anti-il-17rc mabs poolt, leitakse standardse immuunsadestamise teel, millele järgneb SDS-PAGE analüüs või western blot protseduur, mis mõlemad kasutavad lahustuvat membraanpreparaate IL-17RC sisestatud versus mittesisestatud Baf3 või BHK rakkudest. Lisaks näitavad lahustuvad membraanpreparaadid mittesisestatud rakuliinidest, mis avaldavad IL-17RC, et mabs tunneb ära nii loodusliku retseptorahela kui sisestatud ahela. Alternatiivina testitakse mabs võimet spetsiifiliselt immuunsadestada või western blotida lahustuvat IL-17RC-muFc valku. NÄIDE inimese IL-17RC neutraliseerimine seerumitega hiirtelt, kellele süstiti inimese IL-17RC sisestatud P815 rakke

105 EE - EP B1 Kasutades rakupõhist neutraliseerimiskatset, lisatakse seerumit, mis pärineb elus inim-il-17rc sisestatud p815 rakkudega (näide 17) süstitud hiirtelt, seriaalse lahjendusena 1%, 0,5%, 0,25%, 0,13%, 0,06%, 0,03%, 0,02% ja 0%. Katseplaadid inkubeeritakse 37ºC, 5% CO2 juures 4 päeva, mille jooksul Alamari sinist (Accumed, Chicago, IL) lisatakse 20 µl/auk. Plaate inkubeeritakse uuesti 37ºC, 5% CO2 juures 16 tundi. Tulemused näitasid, et neljalt loomalt pärinev seerum võis neutraliseerida signaalülekandmist nii huil-17 kui huil-17f läbi inimese IL- 17RC. Sellised tulemused pakuvad lisatõestust sellele, et tõhus IL-17RC blokeerimine kas IL-17 või IL-17F (kas koos või eraldi) aktiivsuse sidumise, blokeerimise, inhibeerimise, vähendamise, antagoniseerimise või neutraliseerimisega, näiteks neutraliseerides käesoleva leiutise IL-17RC monoklonaalset antikeha, võib olla eeliseks IL-17 ja IL-17F (koos või eraldi) mõju vähendamiseks in vivo ja võib vähendada IL-17 ja/või IL-17F-indutseeritud põletikku, näiteks selliselt, nagu on näidatud psoriaasi, IBD, koliiti, kroonilist obstruktiivset kopsuhaigust, tsüstilist fibroosi või teisi põletikulisi IL-17 ja/või IL-17F algatatud haigusi, näiteks IBD, artriiti, astmat, psoriaatilist artriiti, koliiti, põletikulisi nahahaigusi ja atoopilist dermatiiti. NÄIDE Inimesevastase IL-17RC monoklonaalse antikeha farmakokinees Monoklonaalse antikeha testimiseks pakutakse inimesevastast IL-17RC mab näiteks 3 x 3 ml alikvootides kontsentratsiooniga ligikaudu 1mg/ml (määratud UV absorbeerimisega 280 nm) ja säilitati kuni kasutamiseni -80 ºC juures. Tugiaineks on 1X PBS (50 mm NaPO4, 109 mm NaCl), ph7,3. mab sulatatakse enne kasutamist toatemperatuurile ja alikvoote 1 ja 2 kasutatakse 100 µg vastavalt IV ja SC doseerimisgrupis. Pool alikvooti 3 lahjendatakse 1:2 1X PBS's 50µg SC doosigrupi kohta ja teine pool alikvoodist 3 lahjendatakse 1:10 1X PBS's 50µg SC doosigrupi kohta. Emased SCID hiired (n=96) saadakse Charles River laboratooriumist. Loomade tervist kontrollitakse saabumisel ja grupeerimisel (3 looma igasse puuri). Hiired on 12 nädala vanused ja nende keskmine kehakaal on uuringute alguseks ligikaudu 22 g.

106 A) Doseerimisprotokoll 105 EE - EP B1 5 Emased SCID hiired (n=24/doosigrupis) paigutatakse juhusliku valiku alusel nelja doseerimisgruppi (Tabel 8). Grupile 1 manustati inimesevastast IL-17RC mab ligikaudu 93 µl IV süstimise teel sabaveeni ja gruppidele 2, 3 ja 4 manustati mab ligikaudu 93 µl SC süstimise teel kaelavoltidesse. B) Proovi võtmine Enne vereproovi hiired tuimestati täielikult halotaani või isofluoraaniga. Vereproovid võeti südametorke teel kõigi ajapunktide kohta, väljaarvatud 168 h ajapunkt (mil vereproov võeti silma veritsusest ja samadel loomadel võeti vereproovi uuesti 504 h ajapunktil südametorke kaudu). veri koguti seerumi separaatortuubidesse ja lasti hüübida 15 minutit. Proove tsentrifuugiti seejärel 3 minutit kiirusel rpm. Pärast tsentrifuugimist jagati ul alikvoodid märgistatud Eppendorfi tuubidesse ja talletati kohe -80ºC juures kuni analüüsi alguseni. Tabel 8 C) Seerum inimesevastase IL-17RC mab kontsentratsioonide kvantifitseerimine ELISAga 20 Ensüüm-seotud immuunsorbant test (ELISA) arendatakse välja ja kirjeldatakse hiirte seerumiproovide analüüsimiseks, mis pärinevad loomadelt, kellele manustati farmakokineetiliste uuringute vältel IL-17RC mab. See test on kavandatud eelisena kaubanduslikult saadaoleva sekundaarse antikeha ja kolorimeetrilise tuvastamise testile, mis kasutab TMB. Standardkõvera jaoks kasutatavaid lahjendusvedelikke muudeti, et parandada standardkõvera lineaarse osa

107 106 EE - EP B1 tuvastamist. Standardkõver ulatuses 100 ng/ml kuni 0,231 ng/ml 2-voldilistes lahjendusvedelikes võimaldab kvantifitseerida hiire seerumiproove. QC proove lahjendati 1:100, 1:1000 ja 1: % SCID hiire seerumis ja arvutati tagasi standardkõverast. 5 D) Farmakokineetiline analüüs Seerumikontsentratsioon versus aeg andmed laetakse farmakokineetiliseks analüüsiks alla WinNonlin Professional 4.0 tarkvarasse (Pharsight, Inc., Cary, NC). Lahterdamata analüüsi kasutatakse iga ajapunkti keskmistel andmetel põhinevate farmakokineetiliste parameetrite määratlemiseks. 10 NÄIDE 21 IL-17A ja IL-17F aktiivsuse neutraliseerimine inimesevastase IL-17RC monoklonaalse antikehaga Kasutades rakupõhist neutraliseerimiskatset, lisatakse hiire inimesevastane puhastatud IL-17RC monoklonaalne antikeha näiteks 10µg/ml, 5 µg/ml, 2,5 µg/ml, 1,25 µg/ml, 625 ng/ml, 313 ng/ml, 156 ng/ml ja 78 ng/ml seriaalsesse lahjendusvedelikku. Katseplaadid inkubeeritakse 37ºC, 5% CO2 juures 4 päeva, mille jooksul Alamari sinist (Accumed, Chicago, IL) lisatakse 20 µl/auk. Plaate inkubeeritakse uuesti 37ºC, 5% CO2 juures 16 tundi. See katse võimaldab näidata, et inimesevastane puhastatud IL-17RC monoklonaalne antikeha suudab neutraliseerida nii huil-17 kui huil-17f signaalülekandeid inimese IL-17RC kaudu. Kõrge efektiivsusega antikehade suhtes, kui kasutati ligikaudu 10 µg/ml kontsentratsiooni, neutraliseeris antikeha täielikult huil-17 ja huil-17f algatatud vohamist, inhibeerides vohamise kasvu doseerimisest sõltuval viisil madalamate kontsentratsioonide puhul. Isotüübiga kattuv negatiivse kontrolli mab hiirel, keda testiti ülal kirjeldatud kontsentratsioonide suhtes, ei toimu ootuspäraselt kummagi tsütokiini vohamise inhibeerimist. Antud tulemused tõestavad veel, et IL-17RC monoklonaalsed antikehad võivad tõepoolest antagoniseerida põletikueelsete ligandite IL-17 ja IL-17F aktiivsust madalatel kontsentratsioonidel.

108 107 EE - EP B1 NÄIDE 22 IL-17A indutseerib IFN-gamma ja TNF-alfa kõrgendatud tasemeid inimese perifeerse vere mononukleaarsetes rakkudes Inimese perifeerse vere mononukleaarseid rakke (PBMC) puhastatakse ficoll tihedusgradient tsentrifuugimisega ja inkubeeritakse seejärel üle öö 37ºC juures kas ainult söötmes, koos 50 ng/ml inimesevastase CD3 antikehaga või 50 ng/ml inimesevastase CD3 antikeha ja 1 µg/ml inimesevastase CD28 antikeha kombinatsioonis. Iga nimetatud tingimuse kohta tehakse replikaatkultuurid, millele ei lisata tsütokiine või lisatakse 25 mg/ml inimesevastast IL-17A või 25 ng/ml inimese IL-17F. Pärast 24 tunnist inkubeerimist kogutakse igast kultuurist supernatantidelt saak tsütokiini sisalduse kohta, kasutades B-D Biosciense'i inimese Th1/Th2 Tsütomeetrilise tera katset (CBA). Leidsime, et kultuurid, mida stimuleeriti kas anti-cd3 või anti-cd3 ja anti-cd28'ga ja millele oli lisatud IL-17A, sisaldasid oluliselt kõrgemal määral IFN-gamma ja TNF-alfa (kumbki 3-5-volti kõrgemad) võrreldes kultuuridega, millele ei lisatud tsütokiine või nendega, mis said IL-17F. Kultuurid, millele ei olnud lisatud anti-cd3 stimuleerijat, ei näidanud olulisi muutusi tsütokiinide tasemetes. Lisaks ei algatanud IL-17A lisamine olulisi muutusi teistes CBAga uuritud tsütokiinides, millesse kuulusid IL-2, IL-4, IL-5 ja IL- 10. Need andmed näitavad, et IL-17A, kuid mitte IL-17F, võib suurendada IFNgamma ja TNF-alfa tootmist PBMC kultuurides, mida on stimuleeritud anti-cd3 või anti-cd3 ja anti-cd28'ga. NÄIDE 23 IL-17RC-Fc kasvatab haiguse esinemist ja arengut hiire kollageenindutseeritud artriidi (CIA) mudelis A) Hiire kollageen-indutseeritud artriidi (CIA) mudel Kümne nädala vanused isased DBA/1J hiired (Jackson Labs) jagatakse 3 gruppi 13 hiirt grupis. 21. päeval antakse loomadele sama nahasisese süsti teel µl 1 mg/ml tibu tüüp II kollageeni, mis on formuleeritud Complete Freund's Adjuvant'is (valmistaja Chondrex, Redmond, WA) ja kolm nädalat hiljem, 0-päeval antakse neile sama süst, mis on aga valmistatud Incomplete Freund's Adjuvant'is.

109 EE - EP B1 IL-17RC-Fc manustatakse kõhukelmesisese süstina 3 korda nädalas 4 nädala jooksul erinevatel ajapunktidel, mis jäävad vahemikku 0-päevast kuni päevani, mil enamik hiiri väljendavad mõõdukaid haigussümptomeid. Grupid saavad kas 10 või 100 µg IL-17RC-Fc looma kohta doosis ja kontrollgrupid saavad tugiaine kontrolli PBS (Life Technologies, Rockville, MD). Loomadel hakkavad pärast teist kollageeni süsti väljenduma artriidi sümptomid, mis enamiku loomade juures areneb põletikuks 1,5-3 nädalaga. Haiguse ulatust mõõdetakse igal käpal, kasutades kaliperi käpa paksuse mõõtmiseks ja määrates kliinilise skoori (0-3) iga käpa kohta: 0 = normaalne, 0,5 = varvas (varbad) põletikus, 1 = väheldane käpapõletik, 2 = mõõdukas käpapõletik ja 3 = tõsine käpapõletik, nagu täpsustatakse allpool. B) Haiguse kulu jälgimine Loomadel hakkasid avalduma käpapõletiku tunnused peatselt pärast teistkordset kollageeni süsti ja mõnedel loomadel avaldusid tunnused isegi enne teist kollageeni süsti. Enamikul loomade arenes artriit välja 1,5-3 nädalaga alates võimendavast süstimisest, kuid mõned vajasid selleks rohkem aega. Haiguse esinemine selle mudeli puhul on % ja tavaliselt leitakse 40 loomaga uuringus 0-2 mittevastajat (määratletakse pärast 6 nädalast vaatlust). Tuleb tähele panna, et põletiku alguses võib esineda tavaline mööduv madalatasemeline käpavõi varbapõletik. Seetõttu ei peeta looma haigustunnuseid väljendavaks, kuni on välja arenenud markeeritud pidev käpa paistetus. Kõiki loomi jälgitakse iga päev, et hinnata haiguse arengustaatust nende käppades, mida teostatakse kvalitatiivse kliinilise skoori määramisega igale käpale. Iga päev skooritakse iga looma kõik neli käppa, vastavalt tema haiguse kliinilisele staadiumile. Kliinilise skoori määramiseks võib käpa jagada mõtteliselt kolmeks osaks, varvasteks, käpaks (manus või pes) ja randmeks või hüppeliigeseks. Nende tsoonide suhtes märgitakse haiguse ulatust ja tõsidust, ja selleks kontrollitakse: iga varba paistetuse kohta; rebenenud küüsi või varvaste punetust; iga käppa mis tahes tursete või punetuse esinemise suhtes; luude või kõõluste anatoomilise normaalsuse mis tahes kadumist; tursete või punetuse esinemist randmetel ja hüppeliigestel; põletiku levikut jalga mööda üles. Käpa skoor 1, 2 või 3 põhineb esiteks üldisel hinnangul haiguse tõsidusele ja teiseks

110 109 EE - EP B1 põletikust haaratud tsoonide hulgal. Järgnevalt näidatakse kasutatavat kliinilist skoori. C) Kliiniline skoor = normaalne 0,5 = üks või mitu varbal esineb tunnuseid, kuid põletikus on ainult varbad 1 = väheldane käpapõletik, kus tunnuseid esineb käpas (1 tsoon) ja üks või mitu varvast võivad olla haaratud 2 = mõõdukas käpapõletik, millega võib kaasneda tunnuste esinemist mõnedel varvastel ja/või randmel/hüppeliigesel (2 tsooni) 3 = tõsine põletik käpas, randmes/hüppeliigeses ja mõnedes või kõigis varvastes (3 tsooni) Kindlana haigusena defineeritakse käpapõletikku kvalitatiivse skooriga 2 või rohkem, mis püsib kaks järjestikust päeva. Kui kindel haigus on tuvastatud, registreeritakse kuupäev ja määratakse see looma esimese kindla haiguse päevana. Kogu katse jooksul kogutakse vereproove, et jälgida seerumi anti-kollageeni antikehade tasemeid ja seerumi immunoglobuliini ja tsütokiinide tasemeid. Seerumi anti-kollageeni antikehad on tugevas korrelatsioonis haiguse tõsidusega. Loomad eutaniseeritakse 21. päeval ja kogutakse verd seerumiks ja CBC'deks. Igalt loomalt kogutakse histoloogiaks üks jalg 10% NBF's ja mrna analüüsimiseks teine, mis külmutatakse nitrogeenvedelikus ning säilitatakse -80ºC juures. Samuti kogutakse pool põrna, pool tüümust, pool mesenteerset lümfisõlme, üks maksasagar ja vasak neer hilisemaks RNA analüüsiks ja pool põrna, pool tüümust, pool mesenteerset lümfisõlme, ülejäänud maks ja parem neer kogutakse histoloogiaks 10% NBF's. Seerum kogutakse ja külmutatakse -80ºC immunoglobuliini ja tsütokiinide testimiseks. Hiirte gruppidel, kes said IL-17RC-Fc kõigis ajapunktides, kirjeldatakse käpapõletiku hilisemat algust ja/või arengut. Antud tulemused näitavad, et IL-17RC võib vähendada põletikku ja haiguse esinemist ning arengut seoses selle mudeliga. Neid tulemusi toetab ka tähelepanek, et IL-17RC-Fc tingis kasvanud

111 110 seerum TNFa, IL-1b ja anti-kollageeni antikehade tasemed. EE - EP B1 NÄIDE 24 Stabiilne IL-27RC ületootmine hiire katserakuliinis nih3t3/kz142.8, mis avaldab ap1/nfkb transkriptsioonifaktorit 5 10 Hiire nih3t3/kz142.8 katserakuliin sisestati inimese IL-17RCx1 (SEQ ID nr:2) ekspressioonivektoril metotrekstaat resistentse geeniga (dihudrofolaat reduktaas, DHFR). See sisestus viidi läbi kasutades kaubanduslikult saadavalolevat komplekti ja tootja juhiseid (Mirus, Madison, WI, kat. nr. MIR218). Rakud asetati 1 µm MTX parandatud kasvusöötmesse, et valida ekspressioonivektor, mis sisaldab inimese IL-17RCx1 transgeeni. Pärast IL-17RCx1 loodi sisestusalus ja nimetati nih3t3/kz142.8/hcytor14x1. A) Lutsiferaas katse, kasutades nih3t3/kz142.8 katserakuliini 15 Kuna nih3t3/kz142.8 omab stabiilset kz142 reporterit, ei ole vajadust adenoviiruse nakkuseks, et seda reporterit lisada. Seega lühendati Lutsiferaas katse protokoll ja see viidi läbi järgnevalt: 1. Raku plaatimine 20 nih3t3/kz142.8 rakud plaaditi 5000 rakku/auk tahketele valgetele rakukultuuriga kaetud 96-augustele plaatidele (kat. nr. 3917, Costar) kasutades DMEM/10% FBS, mis sisaldas glutamiini ja parandatud püruvaati, ning kasvatati üle öö 37ºC ja 5% CO2. Teisel päeval plaatimissööde eemaldati ja vahetati DMEM/1%/FBS vastu, mis sisaldas glutamiini ja parandatud püruvaati, ning kasvatati üle öö 37ºC ja 5% CO2. 2. Lutsiferaas katse stabiilse kz142 reporteri IL-17A ja F aktiivsuse mõõtmiseks 25 Järgmisel päeval pärast öist inkubeerimist 1% FBS, DMEM söötmes, tehti seerumivabas, BSAga 0,28% tasemeni parandatud söötmes inimese IL-17A ja IL- 17F ligandi lahjendused. Pärast ligandi lahjenduste lisamist inkubeeriti rakke 37ºC ja 5% CO2 neli tundi, misjärel sööde eemaldati, rakke lagundati 15 minuti jooksul ja mõõdeti keskmise fluorestsentsi indeks (MFI), kasutades Lutsiferaas katse

112 EE - EP B1 süsteemi ja reagente, (kat. nr 1531, Promega, Madison, WI) ja mikroplaatluminomeetrit. Aktiivsus tuvastati mõlema ligandi kohta kontsentratsioonidel vahemikus 0,1 kuni 1000 ng/ml. Nih3t3/kz142.8/hzytor14x1 sisestusalus näitas sarnast aktiivsust hiire IL-17A ligandil ja niisamuti näitas seda vanemlik rakuliin (näide 14). Siiski näitas cytor14x1 sisestusalus kõrgenenud vastust inimese IL-17A ja F ravile, isegi kui nende ligandite kontsentratsioonid olid madalad (20 femtogrammi). Asjaolu, et mil-17a signaalülekanne on võrreldav vanemliku rakuliiniga (näide 14), lubab oletada, et ei ole üldist, mittespetsiifilist probleemi inimese IL-17RC-väljendavate rakkudega ja et hiire IL-17A on tõenäoliselt signaalülekandes läbi endogeense hiire nih3t3 raku IL-17R või IL-17RC retseptori. Seega võib asjaolu, et inimese IL-17A ja IL-17F põhjustab MFI kõrgenemist nii madalal ligandi kontsentratsioonil, näidata rakkude spetsiifilist ülitundlikkust liganditele, mis vahendavad läbi inimese ületoodetud IL-17RC retseptori. See tulemus on oluline ja kasulik nii kliiniliselt kui bioloogiliselt. Näiteks võivad füsioloogilised olud põhjustada IL-17RC retseptorite kasvatamist, mis võib seejärel muuta need alad ülitundlikuks IL-17RC ületootmisele. Seega võib nende arvatavalt madalamate ligandi kontsentratsioonide antagoniseerimiseks piisata palju madalamatest lahustuva retseptori tasemetest, kui seda varem tunnistati. NÄIDE Antagonistid IL-17F ja IL-17A aktiivsuse kasvatavad haiguse esinemist ja arengut põletikulise soolehaiguse (IBD) mudelis See mudel on kavandatud näitama, et kasvatatud soolekude IBD patsientidelt toodab kõrgemaid põletikulise vahendaja tasemeid võrreldes kontrollgrupi terve koega. See põletikuliste vahendajate võimendatud tootmine (kaasa arvates, kuid mitte piirdudes IL-1B, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17A ja F, IL-18, IL-23, TNF-a, IFN-g, MIP perekonna liikmed, MCP-1, G- ja GM-CSF jne) aitab kaasa IBDga seonduvate sümptomitele ja patoloogiale, nagu näiteks Crohn'i tõbi (CD) ja haavandiline koliit (UC), nende mõju kaudu põletikuliste radade ja pärisuunaliste efektorrakkude aktiveerimisele. Antud rajad ja komponendid viivad seejärel in vivo täheldatud koe ja raku kahjustuse/hävinguni. Seega võib antud mudel simuleerida IBD sellist võimendatud põletikulise vahendamise aspekti.

113 112 EE - EP B1 Lisaks, kui tervete kontrollgrupist või inimese soole epiteelrakuliinidest (IEC) pärinevat soole kude kasvatatakse koos nende põletikuliste komponentidega, võib täheldada põletikulise raja signaalülekannet ning tunnistusi koe- ja rakukahjustusest Ravimid, mis oleksid tõhusad inimese IBD puhul in vivo, toimiksid ülalkirjeldatult ex vivo või IEC mudelitega, inhibeerides ja/või neutraliseerides põletikuliste vahendajate tootmist ja/või esinemist. Antud mudelis kogutakse koeproovi, soole osalise eemaldamise või post mortem koekogumise teel inimese soolekoest proov IBD patsientidelt või tervetelt kontrollgrupis ja töödeldakse kasutades muundamist, nagu kirjeldavad Alexakise et al. (Gut 53:85-90, 2004). Aseptilistel tingimustel puhastatakse proovid õrnalt suure hulga PBSiga, millele järgneb hakitud koesektsioonide kasvatamine tervikliku koekultuuri söödaga (lisaks antibiootikumid, et ära hoida bakterite ülekasvamist). Sama hakitud koekogu proove töödeldakse ühega järgnevatest: tugiaine (PBS); rekombinantne inimese (rh) IL-17A, rhil-17f; või rhil-17a+rhil- 17F. Lisaks töödeldakse neid kas IL-17 A või IL-17F antagonistiga või ilma antagonistita, eraldi või kombinatsioonis (näiteks lahustuv IL-17RC). Seda katseprotokolli järgitakse inimese IEC liinide uurimiseks, erandiks on vaid, et rakud käivad läbi olemasolevatest varudest. Pärast kultuuride aegade varieerimist (1 tunnilt mitmele päevale) supernatandid kogutakse ja analüüsitakse põletikuliste vahendajate tasemeid, sealhulgas ülalnimetatuid. IBD patsientide proovides või rhil-17a ja/või F töödeldud proovides on põletikuliste tsütokiinide ja kemokiinide tasemed kõrgemad võrreldes töötlemata tervete kontrollgrupi koeproovidega. IL-17 A või IL-17F aktiivsuse antagonistide lisamine, näiteks IL-17RC lahustuvate retseptorite ja vastavate antikehade, mis sisaldavad inimesevastast IL-17RC monoklonaalseid ja neutraliseerivaid antikehasid käesoleva leiutise järgi, vähendab tunduvalt põletikuliste vahendajate tootmist ja seega lubab oletada tõhusust inimese IBD puhul. NÄIDE IL-17F ja IL-17A aktiivsuse antagonistid vähendavad haiguse esinemist ja arengut hulgiskleroosi (MS) puhul

114 EE - EP B1 Hulgiskleroos (MS) on kompleksne haigus, millel usutakse olevat mitmeid vahendavaid faktoreid, näiteks lümfotsüütiliste ja mononukleaarsete rakkude põletikulised infiltreerijad ja demüelinatsioon läbi kogu kesknärvisüsteemi. Mikrogliiad on makrofaag-tüüpi rakud, mis asustavad kesknärvisüsteemi ja muutuvad aktiivseks vigastuse või nakkuse tõttu. Mikrogliiade rolli peetakse peamiseks mitmete kesknärvisüsteemihaiguste juures, nende hulgas ka MS, ja seda võib kasutada haiguse algatuse, arengu ja ravi mehhanismides (Nagal et al., Neurobiol Dis 8: , 2001; Olson et al., J Neurosci Methods 128:33-43, 2003). Immortaliseeritud inimese mikrogliia rakuliinid ja/või tuntud inim-astroglia rakuliinid sobivad seetõttu kasutuseks mõningate põletikuliste vahendajate mõjude ja nende neutraliseerimisvõimaluste uuringutes antud rakutüüpide kohta. Põletikulised vahendajad (kaasates, IL-1B, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17A ja F, IL-18, IL-23, TNF-a, IFN-g, MIP perekonna liikmed, RANTES, IP-10, MCP-1, G- ja GM-CSF jt, kuid mitte piirdudes nendega) võivad kaasa aidata MS'iga seostatavate sümptomite ja patoloogiate esinemisele, kuna neil on mõju põletikuliste radade ja pärisuunaliste efektorrakkude aktiveerimisele. Selleks, et hinnata põletikueelset tegevust IL-17A ja IL-17F puhul ja IL-17A ja/või IL-17F, näiteks IL-17RC lahustuva retseptori ja vastavate antikehade, milleks on monoklonaalsed ja neutraliseerivad antikehad käesoleva leiutise järgi, antagonisti võimet neutraliseerida või vähendada seda toimet, töödeldakse kasvatatud gliiarakke ühega järgnevatest; tugiaine; rhil-17a, rhil-17f; või rhil-17a+rhil-17f. Lisaks töödeldakse neid kas IL-17 A või IL-17F antagonistiga või ilma antagonistita, eraldi või kombinatsioonis (näiteks lahustuv IL-17RC). Pärast kultuuride aegade varieerimist (1 tunnilt mitmele päevale) supernatandid kogutakse ja analüüsitakse põletikuliste vahendajate tasemeid, sealhulgas ülalnimetatuid. Põletikuliste tsütokiinide ja kemokiinide tase on kõrgenenud rhil- 17A või rhil-17f esinemise korral võrreldes kultuuridega, mida töödeldi ainult tugiainega. IL-17 A või IL-17F aktiivsuse antagonistide lisamine, näiteks IL-17RC lahustuvate retseptorite ja vastavate antikehade, mis sisaldavad inimesevastast IL- 17RC monoklonaalseid ja neutraliseerivaid antikehasid käesoleva leiutise järgi, vähendab tunduvalt põletikuliste vahendajate tootmist ja avaldumist ja on seega ootuspäraselt tõhus inimese MS'iga seostatavate põletikuliste aspektide puhul.

115 114 EE - EP B1 NÄIDE 27 IL-17F ja IL-17A aktiivsuse antagonistid vähendavad haiguse esinemist ja arengut reumatoid artriidi (RA) ja osteoartriidi (OA) mudelis Järgnev mudel on kavandatud näitama, et inimese sünoviaalsed kultuurid (sealhulgas sünoviaalsed makrofaagid, sünoviaalsed fibroblastid ja liigeste kondrotsüüdid) ja RA või OA patsientide eksplantaadid toodavad rohkem põletikulisi vahendajaid kui tervete inimeste kontrollgrupi kultuurid või eksplantaadid. See põletikuliste vahendajate võimendunud tootmine (kaasates, IL- 1B, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17A ja F, IL-18, IL-23, TNF-a, IFN-g, IP-10, RANTS, RANKL, MIP perekonna liikmed, MCP-1, G- ja GM-CSF, lämmastikoksiid jt, kuid mitte piirdudes nendega) aitab kaasa RA ja OAga seostatavatele sümptomitele ja patoloogiale, kuna avaldab mõju põletikuliste radade ja pärisuunaliste efektorrakkude aktiveerimisele. Nimetatud rajad ja komponendid viivad seejärel põletikuliste infiltreerijate, kõhre ja maatriksi kadumise/hävinemiseni, luu kadumise ja prostaglandiinide ning tsüklooksügenaaside kasvatamiseni. Seetõttu võib antud mudel simuleerida RA ja OA hävitavaid põletikulisi aspekte in vitro ja ex vivo katsetes. Lisaks võib jälgida põletikulise raja signaalülekannet, kui tervete kontrollgrupi eksplantaate ja sünoviaalsed kultuure kasvatatakse koos mitmete antud põletikuliste komponentidega (nt onkostatiin M, TNF-a, Il-1b, IL-6, IL-17A ja F, IL-15 jne). Raviained, mis oleks tõhusad inimese RA puhul in vivo, toimiksid ülalnimetatud in vitro ja ex vivo mudelites, inhibeerides ja/või neutraliseerides põletikuliste vahendajate tootmist ja/või esinemist. Antud mudelis kogutakse inimese sünoviaalsed eksplantaadid RA ja OA patsientidelt või tervete inimeste kontrollgrupilt, kellele teostatakse liigese vahetust, või post mortem koekogust, ja töödeldakse kasutades muundamist, mida kirjeldavad Wooley ja Tetlow (Arthritis Res 2:65-70; 2000) ja van 't Hof et al (Rheumatology 39: ; 2000). Uuritakse ka sünoviaalsete fibroblastide, sünoviaalsetest makrofaagide ja liigese kondrotsüütide kultuure. Replitseeritud proove töödeldakse ühega järgnevatest ainetest: tugiaine (PBS); rekombinantne inimese (rh) IL-17A, rhil-17f; või rhil-17a+rhil-17f, ning mõned proovid sisaldavad onkostatiin M, TNF-a, IL-1b, IL-6, IL-17A, IL-17F ja IL-15

116 EE - EP B1 kombinatsioone. Lisaks töödeldakse neid kas IL-17 A või IL-17F antagonistiga või ilma antagonistita, eraldi või kombinatsioonis, näiteks antud leiutise inimesevastane IL-17RC monoklonaalsed ja neutraliseerivad antikehad. Pärast kultuuride aegade varieerimist (1 tunnilt mitmele päevale) supernatandid kogutakse ja analüüsitakse põletikuliste vahendajate tasemeid, sealhulgas ülalnimetatuid. RA ja OA patsientide proovides või rhil-17a ja/või F (koos või eraldi) töödeldud proovides on põletikuliste tsütokiinide ja kemokiinide tasemed kõrgemad võrreldes töötlemata terve kontrollgrupi eksplantaatide või töötlemata rakukultuuridega. IL-17 A või IL-17F aktiivsuse antagonistide, näiteks IL-17RC lahustuvate retseptorite ja vastavate antikehade, mis sisaldavad inimesevastast IL- 17RC monoklonaalseid ja neutraliseerivaid antikehasid käesoleva leiutise järgi, lisamine vähendab tunduvalt põletikuliste vahendajate tootmist ja seega lubab oletada tõhusust inimese RA ja OA puhul. NÄIDE IL-17A ja IL-17F funktsionaalsed vastused NIH-3T3/KZ142 rakud sisestati stabiilselt inimese IL-17RCx1 (SEQ ID nr:1) ja hiire IL-17RCx1 (SEQ ID nr:25). Iga rakuliini töödeldi 7 ja 15 minutit IL-17A ja IL-17F ja hiire IL-17F ja sobivate kontrollainete doos-vastusega. Nii IL-17A kui IL-17F andsid doosist sõltuva vastuse fosforüülitud 1ĸB-α ja p38 MAPK transkriptsioonifaktorid, kui sisestati IL-17RCx1 (SEQ ID nr:1), mis oli ligikaudu 30% kõrgem kui kontrollliini algne signaalülekanne. IL-17A ja IL-17F ei tõstnud signaalülekannet, kui sisestati hiire IL-17RCx1 (SEQ ID nr:25). Hiire IL-17F ei tõstnud signaalülekannet ei inimese ega hiire IL-17RCx1 puhul. NÄIDE IL-17A, IL-17F. IL-17RA ja IL-17RC ekspressioon hiire haigusmudelites Nelja hiire haigusmudelit (astma, DSS koliit, atoopiline dermatiit ja katseline allergeene entsefalomüeliit) analüüsiti tuntud meetoditega IL-17A, IL-17F. IL-17RA ja IL-17RC ekspressiooni suhtes. Astma mudelis avaldusid IL-17A, IL-17F väga madalal või tuvastamatul tasemel nii

117 EE - EP B1 haigete kui mitte-haigete hiirte kopsus, põrnas, kopsu lümfisõlmes ja kopsu infiltreerivates rakkudes. IL-17RC sõnum leiti olevat kõrgemini avaldunud kopsudes kui põrnas ja lümfisõlmede, kuid ei olnud haigusega reguleeritud. IL-17R oli rohkem avaldunud põrnas ja kopsu lümfisõlmes kui kopsus, kuid ei olnud samuti haigusega reguleeritud. Vastupidiselt astma mudelile olid DSS-koliidi mudeli puhul IL-17A, IL-17F käärsoole proksimaalses ja distaalses osas haigetel hiirtel kõrgelt kasvanud, kuid normaalsetel hiirtel mitte. Kumbki tsütokiinidest ei olnud olulisel määral kasvanud kinnistilümfisõlmedes. Lisaks leiti, et mõlema tsütokiini kasvatamine toimus ägeda DSS-indutseeritud koliidi puhul, kuid mitte kroonilise DSS-indutseeritud koliidi puhul. Leiti ka, et IL-17R avaldus käärsoole proksimaalse ja distaalse osaga võrreldes tugevamalt kinnistilümfisõlmedes, kuid see ei olnud haigusega reguleeritud. Seevastu IL-17RC oli enam kui kõrgelt avaldunud proksimaalses ja distaalses käärsoolekoes, võrrelduna kinnistilümfisõlmedega. IL-17RC ekspressioon ei olnud samuti reguleeritud haigusega. Atoopilise dermatiidi puhul ei tuvastatud IL-17A mrnad. IL-17F avaldumist leiti nii naha kui naha-drenaaži lümfisõlmedes, võrrelduna nahaga, kuid see ei olnud reguleeritud haigusega. IL-17RC avaldus tugevamini nahas, võrrelduna nahadrenaaži lümfisõlmedes, kuid see ei olnud reguleeritud haigusega Katselise allergeense entsefalomüeliidi puhul olid nii IL-17A kui IL-17F kasvanud haigete hiirte selgroos, kuid tervete hiirte juures mitte. IL-17F võis olla kõrgemini avaldunud lümfisõlmedes, võrrelduna selgrooga, kuid lümfisõlmedes avaldumine ei olnud reguleeritud haigusest. Üldised avaldumise tasemed nendes kudedes olid aga üsna madalad. IL-17R oli kõrgemini avaldunud lümfisõlmekoes, võrrelduna aju ja selgrooga. IL-17RC ei uuritud. Kokkuvõtteks, IL-17A ja IL-17F avaldumine tundub olevat haiguse poolt reguleeritud DSS-indutseeritud koliidi ja katselise allergeense entsefalomüeliidi mudelites, kuid mitte astma või atoopilise dermatiidi puhul. IL-17R ja IL-17RC avaldumine ei tundu olevat reguleeritud haiguse poolt, kuid IL-17R avaldumine tundub olevat rikastunud lümfoidkoes, IL-17RC avaldumine tundub aga olevat rikastunud mitte-lümfoidkoes.

118 117 EE - EP B1 NÄIDE 30 IL-17RC on vahendajaks nii IL-17A kui IL-17F aktiveerimisele 5 10 Hiire nih3t3/kz142.8 katserakuliin sisestati koos inimese IL-17RCX (SEQ ID nr.2) ekspressioonivektorisse koos metotrekstaat resistantse geeniga (dihudrofolaat deduktaas, DHFR). Inimese IL-17RA (SEQ ID nr:21) sisestati samal viisil samasse rakuliini. Sisestused viidi läbi kasutades kaubanduslikult saadavalolevat komplekti ja tootja juhiseid (Mirus, Madison, WI, kat. nr. MIR218). Rakud paigutati 1 µm mtx parandatud kasvusöötmesse, et valida ekspressioonivektor, mis sisaldab ekspressiooni konstrukte. Valiku järel loodi sisestusanumad ja nimetati nih3t3/kz142.8/hcytor14xi ja nih3t3/kz142.8/il-17r. A) Lutsiferaas katse nih3t3/kz142.8 põhinevate rakuliinidega Kuna nih3t3/kz142.8 põhinevad rakuliinidel on stabiilsed apl/nfkb reporterit (kz142), ei ole tarvis adenoviiruse nakkusega seda reporterit lisada. Seetõttu lühendati Lutsiferaas katse protokolli ja see viidi läbi järgnevalt: Raku plaatimine Rakud plaaditi 5000 rakku/auk tahketele valgetele rakukultuuriga kaetud 96- augustele plaatidele (kat. nr. 3917, Costar) kasutades DMEM/10% FBS, mis sisaldas glutamiini ja parandatud püruvaati, ning kasvatati üle öö 37ºC ja 5% CO2. Teisel päeval plaatimissööde eemaldati ja vahetati DMEM/1%/FBS vastu, mis sisaldas glutamiini ja parandatud püruvaati, ning kasvatati üle öö 37ºC ja 5% CO2. 2. Lutsiferaas katse stabiilse kz142 reporteri IL-17A ja F aktiivsuse mõõtmiseks 25 Pärast üle öö inkubeerimist 1% FBS DMEM-söötmes tehti seerumivabas, BSAga 0,28% tasemeni parandatud söötmes inimese IL-17A ja IL-17F ligandi lahjendused. Pärast ligandi lahjenduste lisamist inkubeeriti rakke 37ºC ja 5% CO2 neli tundi, misjärel sööde eemaldati, rakke lagundati 15 minuti jooksul ja mõõdeti keskmise fluorestsentsi indeks (MFI), kasutades lutsiferaas katse süsteemi ja reagente, (kat. nr 1531, Promega, Madison, WI) ja mikroplaat luminomeetrit. Aktiivsus tuvastati mõlema ligandi kohta kontsentratsioonidel vahemikus 1 kuni

119 100 ng/ml. 118 EE - EP B EC50'd, mida kirjeldatakse allpool, on vähemalt nelja katse keskmised. Nih3t3/kz142.8/hzytor14x1 sisestusalus näitas sarnast aktiivsust hiire IL-17A ligandil ja niisamuti näitas seda vanemlik rakuliin (näide 14), EC50 oli ligikaudu 4 ng/ml (näide 14). Asjaolu, et mil-17a signaalülekanne on võrreldav vanemliku rakuliiniga (näide 14), lubab oletada, et hiire IL-17A on tõenäoliselt signaalülekandes läbi endogeense hiire-nih3t3 raku IL-17R või IL-17RC retseptori ja ei aktiveeri rakke läbi hcytor14x1. Sellele vaatamata näitas hil-17rcx1 sisestusalus kõrgenenud vastamisvõime inimese IL-17A ravile, kus EC50 oli 0,61 ng/ml rekombinantliinis versus 10 ng/ml (nelja katse keskmised) vanemlikus liinis (rekombinantliinis on EC50 6,8 volti potentsem). Lisaks hil-17rcc1 rekombinantliinil oli võimendunud vastamisvõime hil-17f, kus EC50 oli 0,61 ng/ml rekombinantliinis versus 10 ng/ml vanemlikus liinis (rekombinantliinis on EC50 17 volti potentsem). hil-17a ja F suurenenud potentsus hil-17rcx1 liinis on kooskõlaline sellega, et inimese IL-17RCx1 on kõrge afiinsusega retseptor nii inimese IL-17A kui IL-17F suhtes. Seevastu hil-17ra rekombinantliinil oli võimendunud tundlikkus ainult hil-17a suhtes, EC50 0,6 ng/ml versus 2,8 ng/ml vanemlikus liinis. hil-17f EC50 võimendumist hil-17ra rekombinantliinis ei esinenud, IL-17F EC50 oli 12,4 ng/ml versus 8,9 ng/ml vanemlikus liinis. See tulemus on oluline selle poolest, et see viitab spetsiifiliselt hil-17rcx1 vahendaja rollile nii hil-17a kui hil-17f juures ja lubab oletada, et hil-17ra vahendab signaalülekannet ainult hil-17a aktiveerimisel, mitte aga hil-17f puhul. NÄIDE 31 IL-17A ja IL-17F veenisisene manustamine Katse viidi läbi selleks, et määrata hiire või inimese IL-17A või IL-17F veenisisese sisestamise efekti täielikele vereanalüüsidele (CBC) ja seerumi tsütokiinidele/kemokiinidele BALB/c hiirtel erinevatel ajapunktidel. Veenisisene 1ug mil-17a manustamine andis tulemuseks ligikaudu 2-voldise tõusu tsirkuleerivates neutrofiilides (CBC järgi) ja ligikaudu 10-voldise tõusu seerum KC ja MCP-1 (Luminexi järgi) 1-2 tundi pärast manustamist; sarnaseid

120 5 119 EE - EP B1 tulemusi täheldati nendes kemokiinides 5 µg hil-17a puhul. Vere monotsüüdi tasemed olid samuti oluliselt tõusnud hiirtel, keda raviti 1 µg mil-17a (näitasid suurimat tõusu), 5 µg hil-17a või 5 µg hil-17f'ga 2 tunni ajapunktis. m ja hil-17f veenisisene sisestamine andis tulemuseks tuvastatavad tõusud seerumis IL-15 (Luminexi järgi) 1 ja 2 tunni ajapunktidel ja väiksemaid tõususid seerumis KC ja MCP-1 samadel ajapunktidel. NÄIDE 32 IL-17A ja IL-17F veenisisese manustamise neutraliseerimine Katse viidi läbi selleks, et neutraliseerida veenisisest IL-17A ja IL-17F-vahendatud tõususid tsütokiinides ja kemokiinides kõhukelmesiseste lahustuvate retseptoritega (mil-17fa:fc hiire ligandiks; lahustuv inimese IL-17RC inimese ligandiks). Emastele BALB/c hiirtele manustati kõhukelmesisese süstiga kas PBS, 100 µg mil-17ra:fc või 100 µg lahustuvat inimese IL-17RC kolm tundi enne veenisisese sabasüsti saamist: PBS, 2 µg kas mil-17a, mil-17f või 2 µg nii mil-17a kui mil- 17F (hiirtele, kes said mil-17fa:fc); või 2 µg kas hil-17a, hil-17f või 2 µg nii hil- 17A kui hil-17f (hiirtele, kes said lahustuvat inimese IL-17RC). Seerum koguti 1 tund pärast ligandi manustamist ja analüüsiti väikest hulka seerumi tsütokiine ja kemokiine. Eelnevalt veenisisese lahustuva retseptoriga töödeldud hiirtel esines markeeritud reduktsioone IL-17A-vahendatud tõusudes IL-17A ja KC seerumi kontsentratsioonidel, võrrelduna hiirtega, kelle puhul kasutati PBS ja IL-17A. NÄIDE 33 Plaadipõhised valgu sidumise katsed lahustuvate IL-17RC ja IL-17RC/IL- 17RA polüpeptiididega 25 Capture EIA formaat on järgmine: Katta ELISA plaat Goat inimesevastase lgg'ga 1 µg/ml ja inkubeerida üle öö 4ºC juures. Pesta ja blokeerida plaat 200 µl augu kohta 1% BSA'ga toatemperatuuril 1 tunniks. Pesta, lisada plaadile lahustuva retseptori variantide (A1586F, A1587F) või IL-17RCx1 (A1034F) lahjendusvedeliku seeriad (100 µg/ml läbi 0,10 µg/ml) ja inkubeerida toatemperatuuril tund aega.

121 EE - EP B1 Pesta, lisada biotiini sildiga ligand suhtel 10:1 (Il-17A) või 6:1 (Il-17F) ja inkubeerida toatemperatuuril tund aega. Pesta, lisada Streptavidiin mädarõika peroksüdaasi 0,5 µg/ml ja inkubeerida toatemperatuuril tund aega. Pesta, lisada 4 minutiks TMB substraat. Peatada reaktsioon Stopplahuse lisamisega. (NB: Kõik reagendi kogused olid 50 µl augu kohta, kui ei ole märgitud teisiti). Positiivseks tulemuseks peetakse kõrgeid, tavaliselt üle 0,5 OD väärtusi. Tulemused näitasid, et konstrukt 1342 (SEQ ID nr:74) ei seo antud katses IL-17A ja seob nõrgalt IL- 17F. Konstrukt 1341 (SEQ ID nr:72) seob nii IL-17A kui IL-17F väga tugevalt. IL- 17RCx1 seob IL-17A ja IL-17F. Neutralization EIA formaat on järgmine: Katta ELISA plaat lahustuva retseptoriga (A1934F) 1 µg/ml ja inkubeerida üle öö 4ºC juures. Pesta ja blokeerida plaat 200 µl augu kohta 1% BSA'ga toatemperatuuril 1 tunniks. Blokeerimise ajal inkubeerida eraldi plaadil lahustuva retseptori variantide (A1586F, A1587F) lahjendusvedeliku seeriad (100 µg/ml läbi 0,10 µg/ml) koos biotiini sildiga ligandiga suhtel 10:1 (IL-17A) või 6:1 (IL-17F) võrdsetes kogustes ja inkubeerida toatemperatuuril tund aega. Pesta blokeeritud plaat, lisada blokeeritud plaadile retseptor-ligand kompleks ja inkubeerida tund aega toatemperatuuril. Pesta, lisada Streptavidiin mädarõika peroksüdaasi 0,5 µg/ml ja inkubeerida toatemperatuuril tund aega. Pesta, lisada 4 minutiks TMB substraat. Peatada reaktsioon stopplahuse lisamisega. (NB: kõik reagendi kogused olid 50 µl augu kohta, kui ei ole märgitud teisiti). Positiivseks tulemuseks peetakse madalaid, tavaliselt alla 0,5 OD väärtusi. Tulemused näitasid, et konstrukt 1342 (SEQ ID nr:74) neutraliseerib nõrgalt IL-17A sidumist IL-17RCx1'ga ja neutraliseerib tugevalt IL-17F sidumist IL-17RCx1'ga. Konstrukt 1341 (SEQ ID nr:72) neutraliseerib nõrgalt IL-17A sidumist IL-17RCx1 ja neutraliseerib nõrgalt IL-17F sidumist IL-17RCx1'ga. Neutraliseerimine osutab sellele, et valgu variant seob biotinüleeritud ligandit. NÄIDE 34 FACS sidumise katse protokoll 30 Antud leiutise lahustuvate IL-17RC ja IL-17RC/IL-17RA polüpeptiidide IL-17A ja IL- 17F liganditega sidumise võime testimiseks kasutati voolutsütomeetrial põhinevat

122 EE - EP B1 võistleva sidumise katset. BHK rakuliini inkubeerimine sisestas stabiilselt täies pikkuses IL-17RCx4 ligandite IL-17A ja IL-17F juuresolekul ja lahustuv retseptor, mis on suunatud ligandite sidumisele, võimaldab tuvastada ja suhteliselt kvantifitseerida ligandit, mis on seotud raku pinnaga (ja seetõttu selle lahti seotud lahustuva retseptori poolt). Ligandi biotinüleerimine võimaldab FACS tuvastust, kasutades teist streptavidiiniga konjugeeritud fluorofoori. Rakuga seotud ligandi vähenemist lahustuva retseptori tiitrimise suhtes registreeritakse keskmise fluorestsentsi vähenemist rakkudes. Biotinüleeritud ligandid segatakse eraldi 1 µg/ml tiitritava hulga lahustuva retseptoriga värvivas söötmes (HBSS + 1% BSA + 0,1% NaAsiid + 10 mm HEPES) 100 µl koguses ja inkubeeritakse RT'ga 15 minutit. Stabiilselt kogu pikkuses IL-17RCx4 sisestatud BHK rakuliin valmistatakse ette ligand-värvimiseks Versene'i (Invitrogen kat. nr ) resuspensiooni teel, mis tasakaalustab kaks korda 10e5 rakke/100 ml, kuulistab ja resuspendeerib ligand/lahustuva retseptori eelsegus. Värvunud rakud inkubeeritakse 4ºC juures 30 minutit, pestakse ühe korra värvivas söötmes ja värvitakse Streptavidiin-PE'ga (BD Pharmingen kat. nr ) suhtel 1:100. Rakud inkubeeritakse 4ºC juures pimedas 30 minutit, pestakse kaks korda ja resuspendeeritakse suhtel 1:1 värvivas söötmes ja Cytofix'is (BD Bioscience ). Andmete kogumiseks ja analüüsiks kasutatakse BD LSRII voolutsütomeetrit või mõnda teist sarnast vahendit. Joonis 5 kujutab tavapärast diagrammi. Diagramm loodi Prizm tarkvara abil. Y väärtused näitavad MFI normaliseeritud maksimaalset ja minimaalset (100% ja 0%) väärtust, põhinedes ainult ligandiga ja ligandita/lahustuva retseptorita kontrollaukudel, ja seega ligandi rakkudega sidumise protsendil. Arvutiprogramm arvutab välja iga kõvera IC50. NÄIDE 35 Biotinüleeritud inim-il-17a ja IL-17F ja lahustuva IL-17RC/IL-17RA polüpeptiidi spetsiifilise sidumise inhibeerimine 30 Selleks, et tuvastada lahustuva IL-17RC ja IL-17RC/IL-17RA polüpeptiidide võimet siduda käesolevas töös kirjeldatud IL-17A ja IL-17F, kasutatakse sidumiskatset. Sidumisuuringud viiakse läbi ülalkirjeldatud viisil, kuid lisaks kaasatakse sidumisreakstioonis lahustuvad polüpeptiidid, näiteks SEQ ID nr: 157 ja 158. Antud lahustuv polüpeptiid inhibeeris nii inimese IL-17A kui IL-17F sidumist IL-

123 122 EE - EP B1 17RC sisestatud BHK rakkudega samal määral kui lahustuv inimese IL-17RCx1 Fc liitvalk (SEQ ID nr:64). Lahustuvate polüpeptiidide jääk, sealhulgas lahustuvad polüpeptiidid SEQ ID nr:157 ja 158, on toodud tabelis 9. Tabel 9* 5 (järgneb) NÄIDE IL-17RC ja IL-17RC/IL-17RA lahusutvate polüpeptiidide IL-17A ja IL-17F'ga sidumise afiinsus IL-17RCx1, IL-17RA ja IL-17RC/IL-17RA lahustuvat polüpeptiidi (SEQ ID nr:157 ja 158) testiti sidumisafiinsuse kohta nii IL-17A kui IL-17F'ga järgneval viisil: Gt-anti- Hu lgg-fc spetsiifilist Antikeha (Jackson nr ) lahjendati 50 µg/ml ph 5,0 Na atsetaadis ja immobiliseeriti CM5 Biacore kiibile. Protokolli optimiseeriti retseptori kinnipüüdmiseks teoreetilisel sidumismaksimumil enne, kui iga ligandi kontsentratsiooniseeriate süstimist seoste ja lahknevuste jälgimiseks. Lahustuvad retseptoreid ja IL-17RC/IL-17RA polüpeptiide testiti iga ligandi

124 123 EE - EP B1 kontsentratsiooniseeriate sidumises. Pind regenereeriti 2 x 30 sek. süstidega ph 1,75 glütsiiniga tsüklite vahel. Andmeid hinnati Biacore Evaluation tarkvara abil kineetiliste väärtuste kindlaks tegemiseks, mida näidatakse tabelis 10. Tabel 10* Chi2 viitab sidumiskõverate ja hindamissobivuse kõverate vaheliste jääkide ruutude summale. Mida lähemal nullile, seda usaldusväärsemad on meie andmed. Antud andmeid näidatakse suure usaldusväärsusega. Antud andmed demonstreerivad inimese IL-17A ja inimese IL-17F sidumist inimese IL-17RA ja inimese IL-17RC'ga. Täpsemalt näitab inimese IL-17RC sarnast sidumist nii inimese IL-17A kui inimese IL-17F lahknevate tasakaalu konstantidega (KD) 400 pikomolaari (pm) ulatuses. Lahustuv IL-17RC/IL-17RA polüpeptiid seob inimese IL-17A kergelt kõrgema afiinsusega, KD- 40 pm, kui inimese IL-17F, KD~ 140 pm. Inimese IL-17RA andis suurima, 100-voldise erinevusega ligandi afiinsuse lahknevuse inimese IL-17A (KD~ 300 pm) ja inimese

125 124 IL-17F (KD~ 30 nanomolaari (nm)) sidumises. EE - EP B1 NÄIDE 37 Rekombinandi hil-17ra/nih3t3/kz142.8 ja hil-17rcx4/nih3t3/kz142.8 reporteri katserakuliini loomine 5 10 Siinkirjeldatud hiire nih3t3/kz142.8 reporterrakuliini kasutati katserakuliinide loomiseks, mis on rekombinandiks kas inimese IL-17RA (SEQ ID nr:21) või IL- 17RCx4 (SEQ ID nr:166). See saavutati antud rakkude sisestamise läbi koos ekspressiooni konstruktsioonidega, mis sisaldasid iga antud cdna'd. Ekspressioonivektorina kasutati pzmp11, mis sisaldab dihüdrofolaat-reduktaasgeeni. Selliselt valiti sisestajad, kasutades stabiilsete anumate loomiseks 1 µm metotrekstaadiga parandatud kasvusöödet. Saadud katserakuliine nimetati hil- 17RA/NIH3T3/KZ142.8 ja hil-17rcx4/nih3t3/kz NÄIDE Lahustuv IL-17RC/IL-17RA polüpeptiid antagoniseerib rekombinantsete inimese IL-17RCx4/NIH3T3/KZ142.8 rakkude aktiveerimist inimese IL-17A poolt Lahustuva IL-17RC/IL-17RA polüpeptiidi (SEQ ID nr:157 ja 158) võistlemise efektiivsust rekombinantsete hil-17rcx4/nih3t3/kz142.8 rakkude aktiveerimisel inimese IL-17A poolt mõõdeti järgneval viisil: rakkude plaatimine ja ettevalmistus lutsiferaas katseks oli sama, nagu eelpool kirjeldatud. Katse päeval anti neile rakkudele esmalt kolmekordne 2-voldiste dooside seeria üks mõõt lahustuvaid retseptoreid 2-voldi kaupa, nii et lõplik kontsentratsioon sisaldas ülal mainitud lahustuvat polüpeptiidid, IL-17RA ja IL-17RC, alguses 2 µg/ml (mis ligandiga koos annab 1 µg/ml lõplikku kontsentratsiooni). Järgmiseks rakendati üks mõõt IL-17A 1 ng/ml, mis on 2-voldine lõplik kontsentratsioon 0,5 ng/ml, mis tuleneb retseptori ja ligandi kokkusegamisest. Maksimaalne aktiveerimine tuvastati kasutades kolmekordset komplekti, mis sai 0,5 ng/ml IL-17A'd ilma retseptorita. Baasaktiveerimine tuvastati kasutades kolmekordset komplekti, mis sai ainult katsesöödet, mis ei sisaldanud ei ligandit ega lahustuvat retseptorit. Andmeanalüüs tõi esile, et IC50 ülalmainitud rakuliini IL-17A aktiveerimiseks

126 125 EE - EP B1 lahustuva polüpeptiidi poolt oli 7 ng/ml. Ei esinenud piisavat lahustuva IL-17RA või IL-17RC potentsi antud rakuliini aktiveerimise veenvaks antagoniseerimiseks 0,5 ng/ml hil-17a poolt isegi mitte kõrgeima doosi, 1 µg/ml lahustuva retseptoriga. NÄIDE Lahustuv IL-17RC/IL-17RA polüpeptiid antagoniseerib rekombinantsete inimese IL-17RA/NIH3T3/KZ142.8 rakkude aktiveerimise inimese IL-17F poolt Lahustuva IL-17RC/IL-17RA polüpeptiidi (SEQ ID nr:157 ja 158) võistlemise efektiivsust rekombinantsete hil-17rcx4/nih3t3/kz142.8 rakkude (kirjeldatud ülal) aktiveerimisel inimese IL-17F poolt mõõdeti järgneval viisil: rakkude plaatimine ja ettevalmistus lutsiferaas katseks oli sama, nagu eelpool kirjeldatud. Katse päeval anti neile rakkudele esmalt kolmekordne 2-voldiste dooside seeria üks mõõt lahustuvaid retseptoreid 2-voldi kaupa, nii et lõplik kontsentratsioon sisaldas ülal mainitud lahustuvat polüpeptiidid, IL-17RA ja IL-17RC, alguses 4 µg/ml (mis ligandiga koos annab 2 µg/ml lõplikku kontsentratsiooni). Järgmiseks rakendati üks mõõt IL-17A 1 ng/ml, mis on 2-voldine lõplik kontsentratsioon 0,5 ng/ml, mis tuleneb retseptori ja ligandi kokkusegamisest. Maksimaalne aktiveerimine tuvastati kasutades kolmekordset komplekti, mis sai 0,5 ng/ml IL- 17A'd ilma retseptorita. Baasaktiveerimine tuvastati kasutades kolmekordset komplekti, mis sai ainult katsesöödet, mis ei sisaldanud ei ligandit ega lahustuvat retseptorit. Andmeanalüüs tõi esile, et IC50 ülalmainitud rakuliini IL-17A aktiveerimiseks lahustuva polüpeptiidi poolt oli 0,48 µg/ml. Ei esinenud piisavat lahustuva IL-17RA või IL-17RC potentsi antud rakuliini aktiveerimise veenvaks antagoniseerimiseks 20 ng/ml hil-17a poolt isegi mitte kõrgeima doosi, 2 µg/ml lahustuva retseptoriga. NÄIDE 40 Lahustuv IL-17RC/IL-17RA polüpeptiid antagoniseerib rekombinantsete inimese IL-17RA/NIH3T3/KZ142.8 rakkude aktiveerimise inimese IL-17F poolt 30 Lahustuva IL-17RC/IL-17RA polüpeptiidi (SEQ ID nr:157 ja 158) võistlemise efektiivsust rekombinantsete hil-17rcx4/nih3t3/kz142.8 rakkude (kirjeldatud ülal) aktiveerimisel inimese IL-17F poolt mõõdeti järgneval viisil: rakkude

127 EE - EP B1 plaatimine ja ettevalmistus lutsiferaas katseks oli sama, nagu eelpool kirjeldatud. Katse päeval anti neile rakkudele esmalt kolmekordne 5-voldiste dooside seeria üks mõõt lahustuvaid retseptoreid 2-voldi kaupa, nii et lõplik kontsentratsioon sisaldas ülal mainitud lahustuvat polüpeptiidi, IL-17RA ja IL-17RC, alguses 4 µg/ml. Järgmiseks rakendati üks mõõt IL-17F osa A1275F 2 ng/ml, mis on 2- voldine lõplik kontsentratsioon 1 ng/ml, mis tuleneb retseptori ja ligandi kokkusegamisest. Maksimaalne aktiveerimine tuvastati kasutades kolmekordset komplekti, mis sai 1 ng/ml IL-17F'd ilma retseptorita. Baasaktiveerimine tuvastati kasutades kolmekordset komplekti, mis sai ainult katsesöödet, mis ei sisaldanud ei ligandit ega lahustuvat retseptorit. Andmeanalüüs tõi esile, et IC50 ülalmainitud rakuliini IL-17F aktiveerimiseks lahustuva IL-17RA/IL-17RC polüpeptiidi poolt oli 0,8 µg/ml. IL-17RC puhul oli see 6 µg/ml ja IL-17RA ei olnud antagonismi ühegi doosi puhul. NÄIDE Lahustuv IL-17RC/IL-17RA polüpeptiid neutraliseerib nii inimese IL-17A kui IL-17F aktiivsust G-CSF, IL-6 ja IL-8 indutseerimisel Inimese väikese õhutee epiteelrakke (SAEC) töödeldi inimese IL-17A või inimese IL-17F ja 48 tunni järel koguti supernatandid. Supernatantidega sooritati katsed ja näidati nende doosist sõltuvat G-CSF, IL-6 ja IL-8 induktsiooni, mida esitab tabel 11: Tabel 11

128 EE - EP B1 SAEC töödeldi ka 0,01 10 µg/ml doosilise lahustuva IL-17RC/IL-17RA polüpeptiidiga (SEQ ID nr:157 ja 158) koos 10 ng/ml inimese IL-17A või 50 ng/ml inimese IL-17F (mõlemad ligandid ja lahustuvad polüpeptiidid inkubeeriti koos 30 minutit 37ºC juures enne nende lisamist rakkudele), ja 48 tunni järel koguti supernatandid. Nagu esitab tabel 12, supernatandid näitasid G-CSF, IL-6 ja IL-8 vähenemist, tõestades seega, et lahustuv IL-17RC/IL-17RA polüpeptiid suutis tõhusalt neutraliseerida nii inimese IL-17A kui inimese IL-17F nende tsütokiinide indutseerimisel. Märgitakse, et IC50 väärtused ei määratlenud IL-6 neutraliseerimist, kuna lahustuva IL-17RC/IL-17RA polüpeptiidi katses kasutatud madalaimal doosil (0,01 µg/ml) andis neutraliseerimine kõige kõrgemaks tulemuseks ainult ligikaudu 50%. Tabel 12 Lahustuv IL-17A/RC retseptor neutraliseerib huil-17a/f aktiivsust: G-CSF induktsioon huil-17a (10ng/ml) poolt G-CSF induktsioon huil-17f (50ng/ml) poolt IL-8 induktsioon huil-17a (10ng/ml) poolt IL-8 induktsioon huil-17f (50ng/ml) poolt IL-6 induktsioon huil-17a (10ng/ml) poolt IL-6 induktsioon huil-17a (10ng/ml) poolt IL-17A/RC IC50 (µg/ml) 0,14 1,20 0,03 0,57 94% neutraliseeritud 10 µg/ml 49% neutraliseeritud 0,01 µg/ml 72% neutraliseeritud 10 µg/ml 57% neutraliseeritud 0,01 µg/ml NÄIDE Lahustuvate IL-17RC ja IL-17RC/IL-17RA polüpeptiidide efektiivsus inimese hulgiskleroosi proovides Hulgiskleroos (MS) on kompleksne haigus, millel usutakse olevat mitmeid vahendavaid faktoreid, näiteks lümfotsüütiliste ja mononukleaarsete rakkude põletikulised infiltreerijad ja demüelinatsioon läbi kogu kesknärvisüsteemi. Mikrogliiad on makrofaag-tüüpi rakud, mis asustavad kesknärvisüsteemi ja muutuvad aktiivseks vigastuse või nakkuse tõttu. Mikrogliiade rolli peetakse peamiseks mitmete kesknärvisüsteemihaiguste juures, nende hulgas ka MS, ja

129 EE - EP B1 seda võib kasutada haiguse algatuse, arengu ja ravi mehhanismides (Nagal et al., Neurobiol Dis 8: , 2001; Olson et al., J Neurosci Methods 128:33-43, 2003). Esmased närvirakukultuurid, immortaliseeritud inimese mikrogliia rakuliinid ja/või tuntud inim-astroglia rakuliinid sobivad seetõttu kasutuseks mõningate põletikuliste vahendajate mõjude ja nende neutraliseerimisvõimaluste uuringutes antud rakutüüpide kohta. Põletikulised vahendajad (kaasates, IL-1B, IL-4, IL-5, IL- 6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17A ja F, IL-18, IL-23, TNF-a, IFN-g, MIP perekonna liikmed, RANTES, IP-10, MCP-1, G- ja GM-CSF jt, kuid mitte piirdudes nendega) võivad kaasa aidata hulgiskleroosiga seostatavate sümptomite ja patoloogiate esinemisele, kuna neil on mõju põletikuliste radade ja pärisuunaliste efektorrakkude aktiveerimisele. Selleks, et hinnata põletikueelset tegevust IL-17A ja IL-17F puhul ja käesoleva leiutise polüpeptiidide, näiteks IL-17RC/IL-17RA polüpeptiidi (SEQ ID nr:158) võimet neutraliseerida või vähendada seda toimet, töödeldakse kasvatatud närvivõi gliiarakke ühega järgnevatest; tugiaine; rhil-17a, rhil-17f; või rhil-17a+rhil- 17F. Lisaks töödeldakse neid kas leiutise lahustuva polüpeptiidiga või ilma polüpeptiidita, näiteks IL-17RC/IL-17RA polüpeptiid (SEQ ID nr:158). Eraldi kultuuride kogudes lisatakse ringlevad T rakud, mis on isoleeritud inimestest ja aktiveeritud anti-cd3'ga, kasvatatud närvi- ja gliiarakkudele eksogeense IL-17A või IL-17F puudumisel, võimaldades seega kooskasvatamise meetodit, et uurida aktiveeritud T rakkude hävitavaid mõjusid antud rakkudele. T rakke töödeldakse kas koos leiutise polüpeptiidiga (näiteks lahustuv IL-17RC/IL-17RA polüpeptiid (SEQ ID nr:158)) või ilma selleta. Pärast kultuuride aegade varieerimist (1 tunnilt mitmele päevale) supernatandid ja rakud kogutakse ja analüüsitakse põletikuliste vahendajate, sealhulgas ülalnimetatute, tasemeid ja/või ekspressioone ja samuti rakkude ellujäämist. Põletikuliste tsütokiinide ja kemokiinide tase ja närvirakkude suremus on kõrgenenud rhil-17a ja/või IL-17F esinemise korral võrreldes kultuuridega, mida töödeldi ainult tugiainega. Leiutise lahustuva polüpeptiidi, näiteks lahustuva IL-17RC/IL-17RA polüpeptiidi (SEQ ID nr:158) lisamine vähendab tunduvalt põletikuliste vahendajate tootmist ja avaldumist nendes kultuurides ja suurendab närvirakkude ellujäämist. Seetõttu, kuna need ex vivo katsed tõestavad, et leiutise lahustuv polüpeptiid,

130 5 129 EE - EP B1 näiteks lahustuv IL-17RC/IL-17RA polüpeptiid (SEQ ID nr:158) võib vähendada hävitavat ja põletikulist tegevust, mis on seotud inimese hulgiskleroosi patoloogiaga, on ravi selliste polüpeptiididega ootuspäraselt tõhus inimese hulgiskleroosiga seostatavate põletikuliste aspektide, närvirakkude suremuse ja/või demüelinatsiooni puhul. NÄIDE 43 Lahustuva IL-17RC ja IL-17RC/IL-17RA polüpeptiidide efektiivsus inimese reumatoidartriiti ( RA ) ja osteoartriidi ( OA ) proovides Järgnevad mudelid on kavandatud näitama, et inimese sünoviaalsed kultuurid (sealhulgas sünoviaalsed makrofaagid, sünoviaalsed fibroblastid ja liigeste kondrotsüüdid) ja RA või OA patsientide eksplantaadid toodavad rohkem põletikulisi vahendajaid kui tervete inimeste kontrollgrupi kultuurid või eksplantaadid, mis võivad kaasa aidata rakuvälise maatriksi komponentide (nt luu, kõhre jne) degradeerumisele, mis on nende haiguste iseloomulik tunnus. Lisaks on järgnevalt kirjeldatavad kultuuride mudelid kavandatud näitama, et põletikulised vahendajad, mis esinevad RA/OA sünoviaalses vedelikus ja/või aktiveeritud T rakkudes, võivad samuti põhjustada suuremat põletikku ja maatriksi degradeerumist. See põletikuliste vahendajate võimendunud tootmine (kaasates, IL-1B, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17A ja F, IL-18, IL-23, TNF-a, IFN-g, IP-10, RANTS, RANKL, MIP perekonna liikmed, MCP-1, G- ja GM-CSF, lämmastikoksiid jt, kuid mitte piirdudes nendega) aitab kaasa RA ja OAga seostatavatele sümptomitele ja patoloogiale, kuna avaldab mõju põletikuliste radade ja pärisuunaliste efektorrakkude aktiveerimisele. Nimetatud rajad ja komponendid viivad seejärel põletikuliste infiltreerijate, kõhre ja maatriksi kadumise/hävinemiseni, luu kadumise ja maatriks metalloproteaaside, prostaglandiinide ning tsüklooksügenaaside kasvatamiseni. Seetõttu võivad antud mudelid simuleerida RA ja OA hävitavaid põletikulisi aspekte in vitro ja ex vivo katsetes. Lisaks võib jälgida põletikulist ja degradeerivat raja signaalülekannet, kui tervete kontrollgrupi eksplantaate ja sünoviaalsed kultuure kasvatatakse koos mitmete antud põletikuliste komponentidega (nt onkostatiin M, TNF-a, Il-1b, IL-6,

131 EE - EP B1 IL-17A ja F, IL-15 jne) või alternatiivina koos sünoviaalse vedelikuga RA patsientidelt (mis võib sisaldada põletikulisi komponente endogeenselt). Raviained, mis oleks tõhusad inimese RA puhul in vivo, toimiksid ülalnimetatud in vitro ja ex vivo mudelites, inhibeerides ja/või neutraliseerides põletikuliste vahendajate tootmist ja/või esinemist. Antud mudelites kogutakse inimese sünoviaalsed eksplantaadid RA ja OA patsientidelt või tervete inimeste kontrollgrupilt, kellele teostatakse liigese vahetust, või post mortem koekogust, ja töödeldakse kasutades muundamist, mida kirjeldavad Wooley ja Tetlow (Arthritis Res 2:65-70; 2000) ja van 't Hof et al (Rheumatology 39: ; 2000). Uuritakse ka sünoviaalsete fibroblastide, sünoviaalsetest makrofaagide ja liigese kondrotsüütide kultuure. Replitseeritud proove töödeldakse ühega järgnevatest ainetest: tugiaine (PBS); rekombinantne inimese (rh) IL-17A, rhil-17f; või rhil-17a+rhil-17f, ning mõned proovid sisaldavad onkostatiin M, TNF-a, IL-1b, IL-6, IL-17A, IL-17F ja IL-15 kombinatsioone. Lisaks töödeldakse neid kas lahustuva IL-17RC/IL-17RA polüpeptiidiga või ilma polüpeptiididta käesoleva leiutise järgi, näiteks lahustuv IL- 17RC polüpeptiid või lahustuv IL-17RC/IL-17RA polüpeptiid (SEQ ID nr:158). Pärast kultuuride aegade varieerimist (1 tunnilt mitmele päevale) supernatandid ja rakud kogutakse ja analüüsitakse põletikuliste vahendajate ning kõhre/luu/maatriksi biomarkerite tasemeid, sealhulgas ülalnimetatuid. Teist proovide kogu töödeldakse aktiveeritud T rakkudega või sünoviaalse vedelikuga tervetelt kontrollgrupi inimestelt või RA või OA patsientidelt. Lisaks töödeldakse kõiki proove kas leiutise lahustuva polüpeptiidiga, näiteks lahustuv IL-17RC polüpeptiid või lahustuv IL-17RC/IL-17RA polüpeptiid (SEQ ID nr:158), või ilma polüpeptiidita. Pärast kultuuride aegade varieerimist (1 tunnilt mitmele päevale) supernatandid ja rakud kogutakse ja analüüsitakse põletikuliste vahendajate ning kõhre/luu/maatriksi biomarkerite tasemeid, sealhulgas ülalnimetatuid. RA ja OA patsientide proovides või RA/OA sünoviaalse vedeliku, rhil-17a ja/või rhil-17f (eraldi või koos teiste põletikuliste tsütokiinidega) või aktiveeritud T rakkudega töödeldud proovides on põletikuliste tsütokiinide ja kemokiinide ja kõhre/luu/maatriksi degradeerimismarkerite tasemed kõrgemad võrreldes töötlemata terve kontrollgrupi eksplantaatide või töötlemata rakukultuuridega. Leiutise lahustuva polüpeptiidi lisamine vähendab tunduvalt põletikuliste ja

132 131 EE - EP B1 kõhre/luu/maatriksi degradeerumise vahendajate tootmist ja seega lubab oletada tõhusust inimese RA ja OA puhul. NÄIDE Lahustuva IL-17RC ja IL-17RC/IL-17RA polüpeptiidide efektiivsus inimese põletikulise soolehaiguse ( IBD ) proovide limaskesta koeproovi kultuurides See mudel on kavandatud näitama, et kasvatatud soolekude IBD patsientidelt toodab kõrgemaid põletikulise vahendaja tasemeid võrreldes kontrollgrupi terve koega. See põletikuliste vahendajate võimendatud tootmine (kaasa arvates, kuid mitte piirdudes IL-1B, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17A ja F, IL-18, IL-23, TNF-a, IFN-g, MIP perekonna liikmed, MCP-1, G- ja GM-CSF jne) aitab kaasa IBDga seonduvate sümptomitele ja patoloogiale, nagu näiteks Crohn'i tõbi (CD) ja haavandiline koliit (UC), nende mõju kaudu põletikuliste radade ja pärisuunaliste efektorrakkude aktiveerimisele. Antud rajad ja komponendid viivad seejärel in vivo täheldatud koe ja raku kahjustuse/hävinguni. Seega võib antud mudel simuleerida IBD sellist võimendatud põletikulise vahendamise aspekti. Lisaks, kui tervete kontrollgrupist või inimese soole epiteelrakuliinidest (IEC) pärinevat soole kude kasvatatakse koos nende põletikuliste komponentidega, võib täheldada põletikulise raja signaalülekannet ning tunnistusi koe- ja rakukahjustusest. Raviained, mis oleksid tõhusad inimese IBD puhul in vivo, toimiksid ülalkirjeldatult ex vivo või IEC mudelitega, inhibeerides ja/või neutraliseerides põletikuliste vahendajate tootmist ja/või esinemist. Antud mudelis kogutakse koeproovi, soole osalise eemaldamise või post mortem koekogumise teel inimese soolekoest proov IBD patsientidelt või tervetelt kontrollgrupis ja töödeldakse kasutades muundamist, nagu kirjeldavad Alexakise et al. (Gut 53:85-90, 2004). Aseptilistel tingimustel puhastatakse proovid õrnalt suure hulga PBSiga, millele järgneb hakitud koesektsioonide kasvatamine tervikliku koekultuuri söödaga (lisaks antibiootikumid, et ära hoida bakterite ülekasvamist). Sama hakitud koekogu proove töödeldakse ühega järgnevatest: tugiaine (PBS); rekombinantne inimese (rh) IL-17A, rhil-17f; või rhil-17a+rhil-

133 EE - EP B1 17F. Lisaks töödeldakse neid kas leiutise lahustuva polüpeptiidiga või ilma polüpeptiidita, näiteks IL-17RC/IL-17RA polüpeptiid (SEQ ID nr:158). Seda katseprotokolli järgitakse inimese IEC liinide uurimiseks, erandiks on vaid, et rakud käivad läbi olemasolevatest varudest. Pärast kultuuride aegade varieerimist (1 tunnilt mitmele päevale) supernatandid kogutakse ja analüüsitakse põletikuliste vahendajate tasemeid, sealhulgas ülalnimetatuid. IBD patsientide proovides või rhil-17a ja/või F töödeldud proovides on põletikuliste tsütokiinide ja kemokiinide tasemed kõrgemad võrreldes töötlemata tervete kontrollgrupi koeproovidega. Leiutise lahustuvate polüpeptiidide lisamine vähendab tunduvalt põletikuliste vahendajate tootmist ja seega lubab oletada tõhusust inimese IBD puhul. Antud uuringu lisaharuna võib kaasata põletikuliste vahendajate tootmise võrdlusi efektiivset ravi saavatelt IBD patsientidelt võetud koeproovide ja antud hetkel mitte ravimeid võtvate patsientide või ravile mitte vastavate patsientide koeproovide vahel. 15 NÄIDE 45 Lahustuva IL-17RC ja IL-17RC/IL-17RA polüpeptiidide efektiivsus inimese IBD proovide epiteelbarjääri funktsioonis Epiteelse barjääri terviklikkuse säilitamine on kriitiline faktor seedetrakti tervise hoidmisel. Katsetest pärinevad tõendid lubavad oletada, et epiteelbarjääri leke võib kaasa aidata IBD arengule. Soole sidekoes asuvad immuunrakud interakteeruvad tavaliselt soole epiteelrakkudega rakult rakule kontakti kaudu või lahustuvate faktorite tootmise kaudu, et hoida immuunjälgimist ja aidata kaasa epiteelse barjääri rakkude terviklikkusele ja toimimisele. Sellele vaatamata võib pikaajaline või kontrollimata immuunvahendatud põletik kaasa aidata epiteelbarjääri rakkude terviklikkuse või toimimise puudulikkusele. Käesolev uuring on kavandatud mõõtma T rakkudest tuletatud IL-17A ja/või IL-17F otsest mõju (või mõjusid) epiteelbarjääri terviklikkusele. Antud näites eristatakse soole epiteelrakuliinid, näiteks Caco-2 rakud, poolläbilaskvatel membraanidel ja kasvatatud basolateraalsel küljel kas koos T rakkudega või monotsüütidega, mis on tuletatud IBD patsientide või tervete

134 EE - EP B1 inimeste koeproovidest. Epiteelse monokihi terviklikkust jälgitakse aja jooksul, hinnates transepiteelset elektrilist resistentsust või monokihi resistentsust värvaine difusioonile. Kultuuride monokihtide transepiteelse resistentsuse kasv lubab oletada kultuuri T rakkude või monotsüütide poolt tekitatud monokihi katkestust. IL- 17A ja IL-17F inhibiitoreid, näiteks leiutise polüpeptiide nagu lahustuv IL-17RC/IL- 17RA polüpeptiid (SEQ ID nr:158), võib kasutada määramaks suhtelist IL-17A ja IL-17F rolli epiteelse monokihi katkestuses ja testida, kas IL-17A ja IL-17F inhibiitorid oleksid tõhusad epiteelbarjääri terviklikkuse säilitamisel. Aktiveeritud T rakkude poolt indutseeritud epiteelse monokihi katkestuse ärahoidmine antud molekulide poolt võimaldab oletada, et antud leiutise lahustuv IL-17RC ja IL- 17RC/IL-17RA polüpeptiidid võivad olla tõhusad inimese IBD ravimisel. Koos kasvatamise süsteeme võib luua ka kasutades monokihte, mis on moodustatud IBD patsientide esmastest kattekoest, et määratleda, kas need rakud on tundlikumad IL-17A ja IL-17F suhtes, võrrelduna tervetelt inimestelt tuletatud epiteelrakkudega. Kui see on nii, lubaksid need andmed oletada, et IL-17A ja IL- 17F inhibeerimine oleks sobilik strateegia IBD ravimiseks. NÄIDE 46 IL-17A ja IL-17F mõju sidekoe T rakkudele ja monotsüütidele/makrofaagidele normaalsetes ja inimese IBDga proovides Kontrollimatu ja püsiv immuunvahendatud põletik võib kaasa aidata IBDga seotud sümptomitele ja patoloogiale, tekitades sobimatutele või pikaajalistele immuunvastustele koekahjustust või jäävat moonutust. Käesolev mudel võib määratleda võimalikke pärisuunalisi tagajärgi, mis on tingitud soolekoe vahetus tsütokiini keskkonnas esineda võivate haigusega seotud T rakkude ja IL-17A ja IL- 17F monotsüütide mõjust. Raviained, mis oleksid tõhusad inimese IBD in vivo raviks, töötaksid ülalmainitud ex vivo mudelitel, inhibeerides ja/või neutraliseerides põletikuliste vahendajate tootmist ja/või esinemist (kaasates IL-1B, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17A ja F, IL-18, IL-23, TNF-a, IFN-g, MIP perekonna liikmed, MCP-1, G- ja GM- CSF, kuid mitte nendega piirdudes).

135 EE - EP B1 Siinses mudelis on T rakud ja monotsüüdid/makrofaagid koeproovidest isoleeritud koeproove hoolikalt HBSSis kääridega hakkides, töödeldes neid kollageenis ja Dispase IIs ning inkubeerides neid 1 tunni 37 ºC juures loksutis. Rakususpensioon filtreeritakse läbi nailonvõrgu, et eemaldada prügi ja rakuklombid, ning pestakse mitmeid kordi HBSSis. T rakud ja makrofaagid/monotsüüdid võib isoleerida kasutades otsest rakusorteerimist või terade puhastamise/rikastamise protokollidega. Isoleeritud rakud inkubeeritakse koos IL-17A ja IL-17Fga. See indutseerib T rakkude ja makrofaagide/monotsüütide põletikuliste vahendajate tootmise ja viib T rakkude vastuste moonutuse ja kõrgete põletikueelsete vastusteni. Võib läbi viia võrdlusi põletikuliste vahendajate tüüpide vahel, mida toodavad IBD patsientidelt pärinevad rakud ja tervetelt inimestelt pärinevate rakud, ja antud võrdlused lubavad oletada, et IBD patsientide T rakud ja makrofaagid/monotsüüdid toodavad rohkem põletikueelset profiili koos IL-17A ja IL-17Fga. Leiutise lahustuva polüpeptiidi lisamine, näiteks lahustuv IL-17RC polüpeptiid või lahustuv IL-17RC/IL-17RA polüpeptiid (SEQ ID nr:158) IL-17A ja IL- 17F poolt indutseeritud pärisuunaliste põletiku vahendajate tootmise neutraliseerimiseks lubab oletada, et lahustuvad IL-17RC või IL-17RC/IL-17RA polüpeptiidid võivad olla tõhusad IBD patsientide raviks. NÄIDE Lahustuva IL-17RC ja IL-17RC/IL-17RA polüpeptiidide efektiivsus ärritatud soole sündroomi ( IBS ) puhul: kesknärvisüsteemi poolt juhitud patogenees IBS peamise kesknärvisüsteemi patogeneesile keskenduv mudel, mis kasutab stressi stiimuleid IBSle iseloomulike sümptomite esilekutsumiseks. Vastsündinute psühhosotsiaalse stressi mudel mimikeerib mõningaid kliinilisi omadusi, mida seostatakse IBS patsientidega, sealhulgas soolestiku liigvalutundlikkust, kõhulahtisust ja stressitundlikkust. Pesakonna igapäevane eraldamine emadest 180 minutiks iga päev 4-18 päeval pärast sündi viib ema käitumise muutumiseni ja vähendab oluliselt lakkumise/hoolitsemise käitumist. Vastsündinute stressi tulemuseks on püsivad muutused nende kesknärvisüsteemis, mis viib muutunud, stressi poolt esilekutsutud soolestiku ja somaatilise valu tundlikkuseni. Käärsoole motoorne toimimine võimendub nendel loomadel vastusena stressile ja esialgsed andmed näitavad tõendeid soolestiku suurenenud läbilaskvusest (Mayer et al.,

136 5 135 EE - EP B1 2002). Ravi leiutise lahustuva polüpeptiidiga, näiteks lahustuva IL-17RC polüpeptiidi või lahustuva IL-17RC/IL-17RA polüpeptiidiga (SEQ ID nr:158) ja järgnev käärsoole motoorse toimimise analüüs, epiteelne läbilaskvus ja vastus stressistiimulile võivad määrata ravi tõhususe selles IBS loomade mudelis. Antud inhibiitoritega ravile järgnev sümptomite esinemise vähenemine lubab oletada võimalikku tõhusust IBS raviks. NÄIDE 48 Lahustuva IL-17RC ja IL-17RC/IL-17RA polüpeptiidide efektiivsus ärritatud soole sündroomi ( IBS ) puhul: soolestiku poolt juhitud stressiindutseerijad Järgnev mudel keskendub soolestiku poolt juhitud stressiindutseerijatele (nt soolepõletik, nakkus või füüsiline stress). Loomadel läbi viidud uuringud on näidanud, et madalatasemeline põletik või immuunaktiivsus võib olla aluseks soolestiku muundunud liikumisvõimele ja/või aferentsele ja epiteelsele funktsioonile (Mayer et al., 2002). Selles mudelis põhjustatakse igapäevast soolestiku ärritust vastsündinud loomadele (8 21 päeval) päevaste soolesiseste sinepiõli süstidega. Sinepiõli on närvistimulant ja on näidatud, et see põhjustab soolestiku liigvalutundlikkust, mis järgneb soolesisesele manustamisele. Antud mudel mimikeerib IBS põhilisi omadusi, sealhulgas soolestiku ülitundlikkust ja soole käitumise muutusi. Loomadel tekkis samuti kõhulahtisus või -kinnisus, mis on EBS patsientide peamiseks omaduseks (Mayer et al., 2002; Kimball et al., 2005). Leiutise lahustuva polüpeptiidi, näiteks lahustuva IL-17RC polüpeptiidi või lahustuva IL-17RC/IL-17RA polüpeptiidiga (SEQ ID nr:158) võidi anda muutuste määratlemiseks selle mudeliga seotud sümptomite arengus. Soolestiku ülitundlikkuse esinemise või ulatuse vähenemine ja soolestiku muutunud liikumine pärast ravi meie inhibiitoritega lubab oletada IBS ravi võimalikku tõhusust nende molekulidega. NÄIDE 49 lahustuva IL-17A ja IL-17F antagonisti skaleeritava valgutootmisprotsessi kavandamine 30 Lahustuva IL-17RC skaleeritava valgutootmisprotsessi kavandamise strateegiates

137 EE - EP B1 esines mitmeid raskusi seoses ekspressioonisüsteemi leidmisega, mis võimaldaks kõrget valgukontsentratsiooni konditsioneeritud söötmes. Western blot analüüs näitas madalaid valgu sekretsiooni tasemeid valgu kuhjumisega rakus. Käesoleva leiutise lahustuvate polüpeptiidide avastamiseks kavandati, koostati enam kui seitsekümmend erinevat ekspressioonikonstrukti ning testiti nendes ekspressiooni kas BHK rakkudes, CHO rakkudes või HEK 293 rakkudes. Paljusid testiti rohkem kui ühes peremeesrakuliinis. IL-17RC ekspressiooni variante testimiskassetti kuulusid: 1) Alternatiivsed signaaljärjestused, näiteks a) looduslikud; b) otpa; c) hiire immunoglobuliin raske ahela varieeruv piirkond; d) inimese kasvuhormoon; e) hiire IL-17RA. 2) Kaks erinevat looduslikult esinevat splaissvarianti (IL-17RCx1, SEQ ID nr:2; IL-17RCx4, SEQ ID nr:166). 3) IL-17RC rakuvälise domeeni (ECD) ja Fc portsjoni vahel siduva järjestuse lisand, näiteks a) ilma sidujata; b) GlyGlySer'il põhinev 9 aminohappe siduja; ja c) GlyGlySer'il põhinev 20 aminohappe siduja. 4) His-märgistatud monomeersed vormid. 5) Nii amino- kui karboksüülotsa Fc liitvalgud. 6) N-seotud süsivesiku kinnitussaitide eemaldaja. 7) Gln Asn-aminohappe asendajate jaoks. 8) Hübriid-liitvalgud IL-17RA ja IL-17RC vahel. Kõiki nimetatud lahustuva IL-17RC variandi ekspressioonikonstrukte testiti valgu ekspressiooni kohta ajutise sisestamisega HEK 293 rakkudesse. Western blot analüüsi kasutati konditsioneeritud söötmes sekreteeritud valkude tuvastamiseks, võrrelduna rakulüsaatide proovis rakkudes hoitava valguga. Enamik konstrukte avaldasid konditsioneeritud söötmes sekreteeritud valku, mis oli Western blotiga vaevu tuvastatav. Lisaks oli signaal suurem rakulüsaadi proovist kui konditsioneeritud söötme proovist, mis näitas valgu võimet olla tõhusalt sekreteeritud. Neid ekspressioonikonstrukte, mille tulemuseks olid kõrgeimad signaalid konditsioneeritud söötmes, kasutati sisestus-stabiilsete CHO rakkude alustena. Valgutiitreid mõõdeti stabiilsetes CHO alustes ja kus võimalik, analüüsiti puhastatud valku IL-17A ja IL-17F sidumist rakupõhise võistleva sidumiskatsega.

138 137 EE - EP B1 Järgnev tabel näitab valguekspressiooni tulemusi kõrgeimatest ekspressioonikonstruktidest CHO rakkude stabiilsetest alustest. Kui absoluutsed valgukontsentratsiooni mõõdud olid alla tuvastuse taset, märgitakse valgutiitrit < 0,5 mg/ml. 5 IL-17RC ja IL-17RC/RA valguekspressioon koosneb numbri määramisest, kaasatud eksonite lühikirjeldusest, stabiilse CHO rakkude aluse valgutiitrist ja IL- 17A ja IL-17F sidumise võimekusest. Mitte kõiki tabelis 13 toodud variantide järjestusi ei olnud antud uurimuses kaasatud. Tabel 13 Kirjeldus Valgutiiter (mg/l) Sidumine x1 splaissvariant IL17RC eksonid 1-6, 3,0 võimeline blokeerima IL-17A ja IL-17F ja IL-17F eskonid 8-16 (variant 1210) X4 splaissvariant IL-17RC eksonid 1-16 < 0,5 proovi hulk ei ole piisav IL-17RC eksonid 1-6 < 0,5 mitteaktiivne IL-17RC eksonid ,6 mitteaktiivne IL-17RC eksonid 7-16 < 0,5 võimeline blokeerima IL-17A ja IL-17F ja IL-17F IL-17RA eksonid 1-10 IL-17RC eksonid ,5 võimeline blokeerima IL-17A ja IL-17F (variant 1407) IL-17RA eksonid 1-6 IL-17RC eksonid ,5 mitteaktiivne IL-17RA eksonid 7-10 IL-17RA eksonid 1-3 IL-17RC eksonid 4-16 < 0,5 proovi hulk ei ole piisav IL-17RA eksonid 1 IL-17RC eksonid 2-16 < 0,5 proovi hulk ei ole piisav IL-17RA eksonid 1-6 IL-17RC eksonid võimeline blokeerima IL-17A ja IL-17F (variant 1454)

139 138 EE - EP B1 Patendinõudlus 1. Isoleeritud lahustuv polüpeptiid, mis hõlmab IL-17RC eksoneid 8-16 (aminohappejäägid järjestusest SEQ ID nr:2) ja IL-17RA eksoneid 1-6, milles nimetatud lahustuv polüpeptiidid seob spetsiifilistelt IL-17A ja IL-17F Isoleeritud lahustuv polüpeptiid vastavalt punktile 1, mis erineb selle poolest, et polüpeptiid hõlmab aminohappejääke järjestusest SEQ ID nr: Isoleeritud lahustuv polüpeptiid vastavalt punktile 2, mis erineb selle poolest, et polüpeptiid hõlmab järjestust SEQ ID nr: Isoleeritud lahustuv polüpeptiid vastavalt punktile 2, mis erineb selle poolest, et polüpeptiid koosneb aminohappejääkidest järjestusest SEQ ID nr: Isoleeritud lahustuv polüpeptiid vastavalt punktile 3, mis erineb selle poolest, et polüpeptiid koosneb järjestusest SEQ ID nr: Isoleeritud lahustuv polüpeptiid vastavalt punktile 1, mis erineb selle poolest, et polüpeptiid hõlmab aminohappejääke valitud grupist, mis hõlmab järjestusi SEQ ID nr:72 ja SEQ ID nr: Isoleeritud nukleiinhappe molekul, mis kodeerib polüpeptiidi vastavalt ükskõik millisele punktile 1 kuni Nukleiinhappe molekul vastavalt punktile 7, mis erineb selle poolest, et nukleiinhappe molekul hõlmab järjestuses SEQ ID nr:157 näidatud nukleotiidijärjestust. 9. Ekspressioonivektor, mis hõlmab järgnevaid toimivalt seotud elemente: 25 a) transkriptsiooni promootor; b) DNA lõik, mis kodeerib polüpeptiidi vastavalt ükskõik millisele punktile 1 kuni 6; ja c) transkriptsiooni lõpetaja.

140 139 EE - EP B1 10. Isoleeritud rakk, millesse on sisestatud ekspressioonivektor vastavalt punktile 9, milles rakk avaldab polüpeptiidi, mida kodeerib DNA lõik. 11. Meetod polüpeptiidi valmistamiseks, mis hõlmab: 5 a) raku kasvatamist, millesse on sisestatud ekspressioonivektor vastavalt punktile 9, milles rakk avaldab polüpeptiidi, mida kodeerib DNA lõik; ja b) avaldatud polüpeptiidi taastamist. 12. Meetod vastavalt punktile 11, mis erineb selle poolest, et rakuks on eukarüootne rakk ja milles avaldunud polüpeptiid sekreteeritakse rakust Meetod vastavalt punktile 11 ja 12, mis erineb selle poolest, et kodeeritud polüpeptiid hõlmab aminohappe järjestust SEQ ID nr:158 või jääke järjestusest SEQ ID nr: Isoleeritud polüpeptiid vastavalt ükskõik millisele punktile 1 kuni 6, mis erineb selle poolest, et polüpeptiid hõlmab lisaks ka PEGüleerimist Lahustuv polüpeptiid vastavalt ükskõik millisele punktile 1 kuni 6 IL-17Aindutseeritud või IL-17F-indutseeritud imetajate põletiku vähendamiseks või inhibeerimiseks. 16. Lahustuv polüpeptiid vastavalt ükskõik millisele punktile 1 kuni 6 IL-17Aindutseeritud ja IL-17F-indutseeritud imetajate põletiku vähendamiseks Meetod ükskõik millisele punktile 1 kuni 6 vastava lahustuva polüpeptiidi kasutamiseks ravimi valmistamiseks imetajate raviks, kes põevad põletikulist haigust, milles osalevad IL-17A ja/või IL-17F. 18. Kasutamine vastavalt punktile 17, mis erineb selle poolest, et haigus on valitud grupist, kuhu kuuluvad krooniline põletikuline haigus, akuutne põletikuline haigus, autoimmuunhaigus ja krooniline põletikuline hingamisteede haigus Kasutamine vastavalt punktile 18, mis erineb selle poolest, et haiguseks on krooniline põletikuline haigus, mis on valitud grupist, kuhu kuuluvad põletikuline soolehaigus, haavandiline koliit, Crohni tõbi, artriit ja psoriaas.

141 140 EE - EP B1 20. Kasutamine vastavalt punktile 18, mis erineb selle poolest, et haiguseks on autoimmuunhaigus, mis on valitud grupist, kuhu kuuluvad hulgiskleroos, reumatoidartriit ja põletikuline soolehaigus (IBD) Kasutamine vastavalt punktile 18, mis erineb selle poolest, et haiguseks on krooniline põletikuline hingamisteede haigus, mis on valitud grupist, kuhu kuuluvad astma, krooniline obsturktiivne kopsuhaigus (KOK) ja tsüstiline fibroos. 22. Kasutamine vastavalt punktile 17, mis erineb selle poolest, et haigus on valitud grupist, kuhu kuuluvad psoriaas, reumatoidartriit, osteoartriit, haavandiline koliit, Crohni tõbi, ärritunud soole sündroom (IBS), kontaktdermatiit, hulgiskleroos (MS), transplantaadi äratõukereaktsioon, astma, krooniline obstruktiivne kopsuhaigus (KOK), tsüstiline fibroos ja allergiline astma. 23. Kasutamine vastavalt ükskõik millisele punktile 18 kuni 22, mis erineb selle poolest, et lahustuvaks polüpeptiidiks on polüpeptiid, mis on valmistatud vastavalt punktile 13.

142

143

144

145

146

147

148

149

150

151

152

153

154

155

156

157

158

159

160

161

162

163

164

165

166

167

168

169

170

171

172

173

174

175

176

177

178

179

180

181

182

183

184

185

186

187

188

189

190

191

192

Microsoft PowerPoint - Roosimaa.ppt

Microsoft PowerPoint - Roosimaa.ppt ENERGEETILISES METABOLISMIS OSALEVATE GEENIDE EKSPRESSIOON MÜOKARDIS JA HL-1 RAKULIINIS Mart Roosimaa TÜ arstiteaduskond EESTI TEADUSTE AKADEEMIA ÜLIÕPILASTÖÖDE KONKURSI VÕITJATE KONVERENTS 2008 Südamelihas

Rohkem

PowerPoint Presentation

PowerPoint Presentation Pitt-Hopkinsi sündroomi modelleerimine Drosophila melanogaster is Laura Tamberg Juhendajad: Mari Palgi, PhD ja Tõnis Timmusk, PhD 27.10.2014 Drosophila melanogaster Üks esimesi mudelorganisme Thomas Hunt

Rohkem

HÜPER IGM SÜNDROOM Publikatsioon oli võimalik tänu CSL Behring üldisele koolitusgrantile

HÜPER IGM SÜNDROOM Publikatsioon oli võimalik tänu CSL Behring üldisele koolitusgrantile HÜPER IGM SÜNDROOM Publikatsioon oli võimalik tänu CSL Behring üldisele koolitusgrantile HÜPER IGM SÜNDROOM See brosüür on ette nähtud patsientidele ja nende perekondadele ja ei asenda kliinilise immunoloogi

Rohkem

II lisa Ravimi omaduste kokkuvõtte ja pakendi infolehe muudatused, esitatud Euroopa Ravimiameti poolt Käesolev ravimi omaduste kokkuvõte ja pakendi in

II lisa Ravimi omaduste kokkuvõtte ja pakendi infolehe muudatused, esitatud Euroopa Ravimiameti poolt Käesolev ravimi omaduste kokkuvõte ja pakendi in II lisa Ravimi omaduste kokkuvõtte ja pakendi infolehe muudatused, esitatud Euroopa Ravimiameti poolt Käesolev ravimi omaduste kokkuvõte ja pakendi infoleht on esildismenetluse tulemus. Vastavalt vajadusele

Rohkem

Microsoft PowerPoint - Loodusteaduslik uurimismeetod.ppt

Microsoft PowerPoint - Loodusteaduslik uurimismeetod.ppt Bioloogia Loodusteaduslik uurimismeetod Tiina Kapten Bioloogia Teadus, mis uurib elu. bios - elu logos - teadmised Algselt võib rääkida kolmest teadusharust: Botaanika Teadus taimedest Zooloogia Teadus

Rohkem

_JAN_EMEA_PATIENT CLL GUIDE_AW0_17 EST A5.indd

_JAN_EMEA_PATIENT CLL GUIDE_AW0_17 EST A5.indd KLL Juhend patsiendile Krooniline lümfotsüütleukeemia Janssen Pharmaceutica NV. 2017 PHEE/IBR/0917/0002 Sissejuhatus Mis on KLL? Tõenäoliselt on ehmatav kuulda esmakordselt oma diagnoosi krooniline lümfotsüütleukeemia

Rohkem

Luuravi

Luuravi Luuravi 10.01.2015 Edward Laane Multiipelne müeloom (MM) Pahaloomuline vereloome kasvaja, luuüdis paljunevad klonaalsed pahaloomulised plasmarakud ehk müeloomirakud Hüperkaltseemia (C) Neerupuudulikkus(R)

Rohkem

Microsoft PowerPoint - ainevahetus.ppt [Compatibility Mode]

Microsoft PowerPoint - ainevahetus.ppt [Compatibility Mode] Triin Marandi Tartu Forseliuse Gümnaasium EHK METABOLISM organismis toimuvad omavahel ja keskkonnaga seotud keemiliste reaktsioonide kogum erinevad orgaanilised ained väliskeskkonnast sünteesivad ise kehaomased

Rohkem

KEYTRUDA (pembrolizumab) teatmik Teave patsiendile Teave patsiendile Käesoleva ravimi suhtes kohaldatakse täiendavat järelevalvet, mis võimaldab kiire

KEYTRUDA (pembrolizumab) teatmik Teave patsiendile Teave patsiendile Käesoleva ravimi suhtes kohaldatakse täiendavat järelevalvet, mis võimaldab kiire KEYTRUDA (pembrolizumab) teatmik Teave patsiendile Teave patsiendile Käesoleva ravimi suhtes kohaldatakse täiendavat järelevalvet, mis võimaldab kiiresti tuvastada uut ohutusteavet. Te saate sellele kaasa

Rohkem

Traneksaam_ortopeedias

Traneksaam_ortopeedias Traneksaamhape kasutamine Juri Karjagin Tartu Ülikool Tartu Ülikooli Kliinikum Plaan Fibrinolüüsist Traneksaamhape farmakoloogiast Traneksaamhape uuringud Plaaniline kirurgia Erakorraline trauma Toopiline

Rohkem

Tromboos ja kuidas selle vastu võidelda

Tromboos ja  kuidas selle vastu võidelda Kasvaja Rasedus Geneetiline soodumus jne Endoteeli düsfunktsioon (trauma, ateroom) Op ravi Kateetrid, punktsioonid Rudolph Carl Virchow 1821 1902 Staas Immobilistatsioon Laienenud veenid Kasvaja Ülekaal

Rohkem

Dr Maire Kuddu - Keda ohustab pea ja kaelapiirkonna vähk

Dr Maire Kuddu - Keda ohustab pea ja kaelapiirkonna vähk Keda ohustab pea ja kaela piirkonna vähk? Maire Kuddu Põhja-Eesti Regionaalhaigla Onkoloogia-hematoloogia kliinik kiiritusravi keskus 12.10.2015 Pea ja kaela pahaloomulised kasvajad (PKK) Maailmas > 650,000

Rohkem

Microsoft Word - Errata_Andmebaaside_projekteerimine_2013_06

Microsoft Word - Errata_Andmebaaside_projekteerimine_2013_06 Andmebaaside projekteerimine Erki Eessaar Esimene trükk Teadaolevate vigade nimekiri seisuga 24. juuni 2013 Lehekülg 37 (viimane lõik, teine lause). Korrektne lause on järgnev. Üheks tänapäeva infosüsteemide

Rohkem

EMA_2011_ _ET_TRA

EMA_2011_ _ET_TRA II LISA Euroopa Ravimiameti esitatud teaduslikud järeldused ning positiivse arvamuse alused 1 Teaduslikud järeldused Docetaxel Teva Genrics ja sarnaste nimetuste (vt I lisa) teadusliku hindamise üldkokkuvõte

Rohkem

raamat5_2013.pdf

raamat5_2013.pdf Peatükk 5 Prognoosiintervall ja Usaldusintervall 5.1 Prognoosiintervall Unustame hetkeks populatsiooni parameetrite hindamise ja pöördume tagasi üksikvaatluste juurde. On raske ennustada, milline on huvipakkuva

Rohkem

Microsoft PowerPoint - Keskkonnamoju_rus.ppt

Microsoft PowerPoint - Keskkonnamoju_rus.ppt Keskkonnakonverents 07.01.2011 Keskkonnamõju hindamine ja keskkonnamõju strateegiline hindamine on avalik protsess kuidas osaleda? Elar Põldvere (keskkonnaekspert, Alkranel OÜ) Kõik, mis me õpime täna,

Rohkem

lvk04lah.dvi

lvk04lah.dvi Lahtine matemaatikaülesannete lahendamise võistlus. veebruaril 004. a. Lahendused ja vastused Noorem rühm 1. Vastus: a) jah; b) ei. Lahendus 1. a) Kuna (3m+k) 3 7m 3 +7m k+9mk +k 3 3M +k 3 ning 0 3 0,

Rohkem

Solaariumisalongides UVseadmete kiiritustiheduse mõõtmine. Tallinn 2017

Solaariumisalongides UVseadmete kiiritustiheduse mõõtmine. Tallinn 2017 Solaariumisalongides UVseadmete kiiritustiheduse mõõtmine. Tallinn 2017 1. Sissejuhatus Solaariumides antakse päevitusseansse kunstliku ultraviolettkiirgusseadme (UV-seadme) abil. Ultraviolettkiirgus on

Rohkem

Matemaatiline analüüs IV 1 3. Mitme muutuja funktsioonide diferentseerimine 1. Mitme muutuja funktsiooni osatuletised Üleminekul ühe muutuja funktsioo

Matemaatiline analüüs IV 1 3. Mitme muutuja funktsioonide diferentseerimine 1. Mitme muutuja funktsiooni osatuletised Üleminekul ühe muutuja funktsioo Matemaatiline analüüs IV 1 3. Mitme muutuja funktsioonide diferentseerimine 1. Mitme muutuja funktsiooni osatuletised Üleminekul üe muutuja funktsioonidelt m muutuja funktsioonidele, kus m, 3,..., kerkib

Rohkem

geneetika layout.indd

geneetika layout.indd XXX. EVOLUTSIOONIGENEETIKA 1. EVOLUTSIOONITEOORIA Charles Darwin sündis üle 200 aasta tagasi (12.02.1809). Ta ei olnud teadlane klassikalises tähenduses, pigem oli ta loodusuurija (naturalist). Juba 22-aastaselt

Rohkem

Polünoomi juured Juure definitsioon ja Bézout teoreem Vaadelgem polünoomi kus K on mingi korpus. f = a 0 x n + a 1 x n a n 1 x

Polünoomi juured Juure definitsioon ja Bézout teoreem Vaadelgem polünoomi kus K on mingi korpus. f = a 0 x n + a 1 x n a n 1 x 1 5.5. Polünoomi juured 5.5.1. Juure definitsioon ja Bézout teoreem Vaadelgem polünoomi kus K on mingi korpus. f = a 0 x n + a 1 x n 1 +... + a n 1 x + a n K[x], (1) Definitsioon 1. Olgu c K. Polünoomi

Rohkem

Microsoft Word - Document in Unnamed

Microsoft Word - Document in Unnamed RAVIMI OMADUSTE KOKKUVÕTE 1. RAVIMPREPARAADI NIMETUS Nizoral, 2% kreem 2. KVALITATIIVNE JA KVANTITATIIVNE KOOSTIS Üks gramm kreemi sisaldab 20 mg ketokonasooli. INN. Ketoconazolum Abiainete täielik loetelu

Rohkem

EE - EP B1 Pürimidiini uurea derivaadid kinaasi inhibiitoritena 5 Leiutis käsitleb uusi ühendeid, koostisi, meetodeid ja kasutust. Täpsemalt kä

EE - EP B1 Pürimidiini uurea derivaadid kinaasi inhibiitoritena 5 Leiutis käsitleb uusi ühendeid, koostisi, meetodeid ja kasutust. Täpsemalt kä Pürimidiini uurea derivaadid kinaasi inhibiitoritena Leiutis käsitleb uusi ühendeid, koostisi, meetodeid ja kasutust. Täpsemalt käsitleb see ühendeid, mida võib kirjeldada kui heteroaromaatseid karbamiide

Rohkem

Matemaatilised meetodid loodusteadustes. I Kontrolltöö I järeltöö I variant 1. On antud neli vektorit: a = (2; 1; 0), b = ( 2; 1; 2), c = (1; 0; 2), d

Matemaatilised meetodid loodusteadustes. I Kontrolltöö I järeltöö I variant 1. On antud neli vektorit: a = (2; 1; 0), b = ( 2; 1; 2), c = (1; 0; 2), d Matemaatilised meetodid loodusteadustes I Kontrolltöö I järeltöö I variant On antud neli vektorit: a (; ; ), b ( ; ; ), c (; ; ), d (; ; ) Leida vektorite a ja b vaheline nurk α ning vekoritele a, b ja

Rohkem

Tartu Ülikool Loodus- ja tehnoloogiateaduskond Keemia Instituut Bakalaureusetöö Viiruslaadsete osakeste puhastamine ja detekteerimine Maksim Runin Juh

Tartu Ülikool Loodus- ja tehnoloogiateaduskond Keemia Instituut Bakalaureusetöö Viiruslaadsete osakeste puhastamine ja detekteerimine Maksim Runin Juh Tartu Ülikool Loodus- ja tehnoloogiateaduskond Keemia Instituut Bakalaureusetöö Viiruslaadsete osakeste puhastamine ja detekteerimine Maksim Runin Juhendaja: Prof.Ago Rinken Kaasjuhendaja: M.Sc. Oliver

Rohkem

Keskkonnakaitse ja ruumilise planeerimise analüüsist Erik Puura Tartu Ülikooli arendusprorektor

Keskkonnakaitse ja ruumilise planeerimise analüüsist   Erik Puura   Tartu Ülikooli arendusprorektor Keskkonnakaitse ja ruumilise planeerimise analüüsist Erik Puura Tartu Ülikooli arendusprorektor Teemapüstitused eesmärkidena 1. Ruumiline suunamine ja planeerimine edukalt toimiv 2. Valikute tegemine konkureerivate

Rohkem

(Microsoft Word - ÜP küsimustiku kokkuvõte kevad 2019)

(Microsoft Word - ÜP küsimustiku kokkuvõte kevad 2019) Ümbrikupalkade küsimustiku kokkuvõte Ülevaade on koostatud alates 2017. aasta kevadest korraldatud küsitluste põhjal, võimalusel on võrdlusesse lisatud ka 2016. aasta küsitluse tulemused, kui vastava aasta

Rohkem

vv05lah.dvi

vv05lah.dvi IMO 05 Eesti võistkonna valikvõistlus 3. 4. aprill 005 Lahendused ja vastused Esimene päev 1. Vastus: π. Vaatleme esiteks juhtu, kus ringjooned c 1 ja c asuvad sirgest l samal pool (joonis 1). Olgu O 1

Rohkem

Slide 1

Slide 1 Hiiumaa Mesinike Seltsing Mesilasperede talvitumine, soojusrežiim ja ainevahetus talvel Uku Pihlak Tänast üritust toetab Euroopa Liit Eesti Mesindusprogrammi raames Täna räägime: Natuke füüsikast ja keemiast

Rohkem

Markina

Markina EUROOPA NOORTE ALKOHOLITARBIMISE PREVENTSIOONI PRAKTIKAD JA SEKKUMISED Anna Markina Tartu Ülikool Meie ülesanne on: Tuvastada ja välja valida erinevaid programme ja sekkumist, mida on hinnatud ja mille

Rohkem

Microsoft PowerPoint - loeng2.pptx

Microsoft PowerPoint - loeng2.pptx Kirjeldavad statistikud ja graafikud pidevatele tunnustele Krista Fischer Pidevad tunnused ja nende kirjeldamine Pidevaid (tihti ka diskreetseid) tunnuseid iseloomustatakse tavaliselt kirjeldavate statistikute

Rohkem

Sisukord

Sisukord TARTU ÜLIKOOL BIOLOOGIA-GEOGRAAFIATEADUSKOND MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT BIOINFORMAATIKA ÕPPETOOL Priit Palta Hübridiseerimisproovide disaini metoodika geeni koopiaarvu määramiseks Bakalaureusetöö

Rohkem

geneetika layout.indd

geneetika layout.indd XXVI. GEENITEHNOLOOGIA Rakendusgeneetika (ingl. applied genetics) on organismi pärilike tunnuste kasutamine ja muutmine, et saada uute omadustega järglasi. Klassikaliselt on seda koduloomade ja taimede

Rohkem

Soolestiku-aju seosed ASH korral kui tuleviku sihtmärk haigusega toimetulekuks Tõlge Eva Kumpas de Theije, C.G.M., et al., Pathways underlying the gut

Soolestiku-aju seosed ASH korral kui tuleviku sihtmärk haigusega toimetulekuks Tõlge Eva Kumpas de Theije, C.G.M., et al., Pathways underlying the gut Soolestiku-aju seosed ASH korral kui tuleviku sihtmärk haigusega toimetulekuks Tõlge Eva Kumpas de Theije, C.G.M., et al., Pathways underlying the gut-to-brain connection in autism spectrum disorders as

Rohkem

(Microsoft Word aasta kutsehaigestumiste ja t\366\366st p\365hjustatud haigestumiste anal%FC%FCs.doc)

(Microsoft Word aasta kutsehaigestumiste ja   t\366\366st p\365hjustatud haigestumiste anal%FC%FCs.doc) KUTSEHAIGUSED JA TÖÖST PÕHJUSTATUD HAIGUSED. AASTAL. aastal diagnoositi uut kutsehaiguse ja tööst põhjustatud haiguse esmasjuhtu. Nii kutsehaiguste kui tööst põhjustatud haiguste diagnoosimine on võrreldes.

Rohkem

TARTU ÜLIKOOL LOODUS- JA TEHNOLOOGIATEADUSKOND MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT RAKUBIOLOOGIA ÕPPETOOL MAIA-LIISA ANTON HISTOONI H4 N-TERMINAALS

TARTU ÜLIKOOL LOODUS- JA TEHNOLOOGIATEADUSKOND MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT RAKUBIOLOOGIA ÕPPETOOL MAIA-LIISA ANTON HISTOONI H4 N-TERMINAALS TARTU ÜLIKOOL LOODUS- JA TEHNOLOOGIATEADUSKOND MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT RAKUBIOLOOGIA ÕPPETOOL MAIA-LIISA ANTON HISTOONI H4 N-TERMINAALSETE MUTATSIOONIDE MÕJU TRANSKRIPTSIOONIST SÕLTUVALE

Rohkem

6 tsooniga keskus WFHC MASTER RF 868MHz & 4 või 6 tsooniga alaseade SLAVE RF KASUTUSJUHEND 6 tsooniga WFHC RF keskus & 4 või 6 tsooniga alaseade SLAVE

6 tsooniga keskus WFHC MASTER RF 868MHz & 4 või 6 tsooniga alaseade SLAVE RF KASUTUSJUHEND 6 tsooniga WFHC RF keskus & 4 või 6 tsooniga alaseade SLAVE 6 tsooniga keskus WFHC MASTER RF 868MHz & 4 või 6 tsooniga alaseade SLAVE RF KASUTUSJUHEND 6 tsooniga WFHC RF keskus & 4 või 6 tsooniga alaseade SLAVE RF 868MHz 3-6 EE 1. KASUTUSJUHEND 6 tsooniga WFHC

Rohkem

my_lauluema

my_lauluema Lauluema Lehiste toomisel A. Annisti tekst rahvaluule õhjal Ester Mägi (1983) Soran Alt q = 144 Oh se da ke na ke va de ta, ae ga i lust üü ri kes ta! üü ri kes ta! 3 Ju ba on leh tis lei na kas ke, hal

Rohkem

Microsoft Word - Karu 15 TERMO nr 527.doc

Microsoft Word - Karu 15 TERMO nr 527.doc Termoülevaatus nr.57 (57/1. Märts 8) Hoone andmed Aadress Lühikirjeldus Karu 15, Tallinn Termopildid Kuupäev 6.1.8 Tuule kiirus Õhutemperatuur -1,1 o C Tuule suund Osalesid Kaamera operaator Telefoni nr.

Rohkem

AM_Ple_NonLegReport

AM_Ple_NonLegReport 9.1.2019 A8-0475/36 36 Põhjendus BG BG. arvestades, et kahjuks ei leidnud see vastuolu erikomisjonis lahendust; 9.1.2019 A8-0475/37 37 Põhjendus BI BI. arvestades, et niinimetatud Monsanto dokumendid ja

Rohkem

geneetika layout.indd

geneetika layout.indd XVI. VIIRUSEGENEETIKA 1. VIIRUSTE GENEETILINE ORGANISATSIOON 1.1. Viirus: rohkem kui molekul ja vähem kui elusrakk 1.1.1. Viiruste defi nitsioon Viirused ei ole elusorganismid. Nad on obligatoorsed rakusisesed

Rohkem

Non-pharmacological treatment

Non-pharmacological treatment Siinusrütmi säilitava ravimi valik Kliiniline küsimus Kas siinusrütmi säilitavaks raviks tuleks eelistada mõnd konkreetset ravimirühma/ravimit: BBL vs Ic vs III? Olulised tulemusnäitajad Surm, ajuinfarkt,

Rohkem

Microsoft PowerPoint - TallinnLV ppt4.ppt

Microsoft PowerPoint - TallinnLV ppt4.ppt Pneumokokknakkuse esinemine ja immuunprofülaktika Eestis Tervisekaitseinspektsioon Streptococcus pneumoniae avastatud 1881. aastal (dr.george Miller Sternberg ning keemik ja mikrobioloog Louis Pasteur)

Rohkem

TAI_meta_99x148_EST.indd

TAI_meta_99x148_EST.indd METADOONASENDUSRAVI Narkootikumide süstimine seab Sind ohtu nakatuda HI- või hepatiidiviirusega, haigestuda südamehaigustesse (nt endokardiit) või põdeda muid haigusi. Kuna narkootikumide süstimine on

Rohkem

ITI Loogika arvutiteaduses

ITI Loogika arvutiteaduses Predikaatloogika Predikaatloogika on lauseloogika tugev laiendus. Predikaatloogikas saab nimetada asju ning rääkida nende omadustest. Väljendusvõimsuselt on predikaatloogika seega oluliselt peenekoelisem

Rohkem

4. KIRURGIA Üliõpilase andmed. Need väljad täidab üliõpilane Praktikatsükli sooritamise aeg Kirurgia praktikatsükkel Ees- ja perekonnanimi Matriklinum

4. KIRURGIA Üliõpilase andmed. Need väljad täidab üliõpilane Praktikatsükli sooritamise aeg Kirurgia praktikatsükkel Ees- ja perekonnanimi Matriklinum 4. KIRURGIA Üliõpilase andmed. Need väljad täidab üliõpilane Praktikatsükli sooritamise aeg Kirurgia praktikatsükkel Ees- ja perekonnanimi Matriklinumber E-posti aadress Telefoninumber Praktikatsükli läbimine.

Rohkem

Söömishäired lastel ja noortel

Söömishäired lastel ja noortel Söömishäired lastel ja noortel Ere Vasli Lastepsühhiaater SA Tallinna Lastehaigla/ Laste Vaimse Tervise Keskus 24.aprill 2014.a. Söömishäired laste ja noortel Terve ja patoloogiline söömiskäitumine Söömishäired

Rohkem

Microsoft Word - Document in Unnamed

Microsoft Word - Document in Unnamed Pakendi infoleht: teave kasutajale Betaserc 8 mg tabletid Betaserc 16 mg tabletid Betaserc 24 mg tabletid Beetahistiindivesinikkloriid Enne ravimi kasutamist lugege hoolikalt infolehte, sest siin on teile

Rohkem

SANCO/10984/2010-EN Rev. 3

SANCO/10984/2010-EN Rev. 3 ET ET ET EUROOPA KOMISJON Brüssel 4.6.2010 KOM(2010)298 lõplik 2010/0156 (NLE) Ettepanek: NÕUKOGU OTSUS, geneetiliselt muundatud maisi Bt11 (SYN-BTØ11-1) sisaldavate, sellest koosnevate või sellest valmistatud

Rohkem

Vähi läbilöögivalu Teave tervishoiutöötajale

Vähi läbilöögivalu Teave tervishoiutöötajale Vähi läbilöögivalu Teave tervishoiutöötajale Vähi läbilöögivalu (vllv) on mitmekesine 1 Valu on kõige sagedasem sümptom, mida seostatakse vähkkasvajaga või selle raviga. 2 Enamikul vähipatsientidest esineb

Rohkem

2016 aasta märtsi tulumaksu laekumine omavalitsustele See ei olnud ette arvatav Tõesti ei olnud, seda pole juhtunud juba tükk aega. Graafikult näeme,

2016 aasta märtsi tulumaksu laekumine omavalitsustele See ei olnud ette arvatav Tõesti ei olnud, seda pole juhtunud juba tükk aega. Graafikult näeme, 2016 märtsi tulumaksu laekumine omavalitsustele See ei olnud ette arvatav Tõesti ei olnud, seda pole juhtunud juba tükk aega. Graafikult näeme, et märtsis laekus tulumaksu eelmise märtsist vähem ka 2009

Rohkem

Kuidas kaitsta taimi ilma mesilasi kahjustamata ehk mesinikud vs taimekasvatajad

Kuidas kaitsta taimi ilma mesilasi kahjustamata ehk mesinikud vs taimekasvatajad Kuidas kaitsta taimi ilma mesilasi kahjustamata ehk mesinikud vs taimekasvatajad Indrek Keres Eesti Maaülikool Eesti Kutseliste Mesinike Ühing Taimekasvatuse konsulent Mida mesinik ootab taimekasvatajalt

Rohkem

Microsoft Word - essee_CVE ___KASVANDIK_MARKKO.docx

Microsoft Word - essee_CVE ___KASVANDIK_MARKKO.docx Tartu Ülikool CVE-2013-7040 Referaat aines Andmeturve Autor: Markko Kasvandik Juhendaja : Meelis Roos Tartu 2015 1.CVE 2013 7040 olemus. CVE 2013 7040 sisu seisneb krüptograafilises nõrkuses. Turvaaugu

Rohkem

BIOLOOGIA GÜMNAASIUM

BIOLOOGIA GÜMNAASIUM Bioloogia ainekava. III. kursus Pärilikkus ja IV. kursus Evolutsioon ja ökoloogia. Õppe- ja kasvatuseesmärgid Gümnaasiumi bioloogiaõpetusega taotletakse, et õpilane: 1) arendab loodusteaduste- ja tehnoloogiaalast

Rohkem

Microsoft Word - alkohol_K2_SoKo.doc

Microsoft Word - alkohol_K2_SoKo.doc Soovituste koostamise kokkuvõte - SoKo Kliiniline küsimus nr 2 Kas kõigil alkoholi kuritarvitamise ja alkoholisõltuvuse kahtlusega patsientidel tuleb lisaks anamneesile kasutada diagnoosi täpsustamiseks

Rohkem

Projekt Kõik võib olla muusika

Projekt Kõik võib olla muusika Õpikäsitus ja projektiõpe Evelin Sarapuu Ülenurme lasteaed Pedagoog-metoodik TÜ Haridusteadused MA 7.märts 2018 Põlva Õpikäsitus... arusaam õppimise olemusest, eesmärkidest, meetoditest, erinevate osapoolte

Rohkem

Tõenduspõhine hindamine kellele ja milleks? KIRSTI AKKERMANN TÜ PSÜHHOLOOGIA INSTITUUT KOGNITIIVSE JA KÄITUMISTERAAPIA KESKUS

Tõenduspõhine hindamine kellele ja milleks? KIRSTI AKKERMANN TÜ PSÜHHOLOOGIA INSTITUUT KOGNITIIVSE JA KÄITUMISTERAAPIA KESKUS Tõenduspõhine hindamine kellele ja milleks? KIRSTI AKKERMANN TÜ PSÜHHOLOOGIA INSTITUUT KOGNITIIVSE JA KÄITUMISTERAAPIA KESKUS Tõenduspõhine praktika 2 Teadlik, läbimõeldud ja mõistlik olemasolevate teaduslikult

Rohkem

LITSENTSILEPING Jõustumise kuupäev: LITSENTSIANDJA Nimi: SinuLab OÜ Registrikood: Aadress: Telefon: E-post:

LITSENTSILEPING Jõustumise kuupäev: LITSENTSIANDJA Nimi: SinuLab OÜ Registrikood: Aadress: Telefon: E-post: LITSENTSILEPING Jõustumise kuupäev: 01.01.2017 1. LITSENTSIANDJA Nimi: SinuLab OÜ Registrikood: 12750143 Aadress: Telefon: 5210194 E-post: kontakt@sinulab.ee Esindaja: juhatuse liige Eesnimi Perekonnanimi

Rohkem

HIV-nakkuse levik Eestis ETTEKANNE KOOLITUSEL INIMKAUBANDUSE ENNETAMINE- KOOLITUS ÕPETAJATELE NOORSOOTÖÖTAJATELE JA KUTSENÕUSTAJATELE Sirle Blumberg A

HIV-nakkuse levik Eestis ETTEKANNE KOOLITUSEL INIMKAUBANDUSE ENNETAMINE- KOOLITUS ÕPETAJATELE NOORSOOTÖÖTAJATELE JA KUTSENÕUSTAJATELE Sirle Blumberg A HIV-nakkuse levik Eestis ETTEKANNE KOOLITUSEL INIMKAUBANDUSE ENNETAMINE- KOOLITUS ÕPETAJATELE NOORSOOTÖÖTAJATELE JA KUTSENÕUSTAJATELE Sirle Blumberg AIDS-i Ennetuskeskus HIV-nakkuse olukorra analüüs. Ohustatud

Rohkem

Trans-generational immune priming in insects: Vitellogenin and honey bees

Trans-generational immune priming in insects: Vitellogenin and honey bees Putukate vaktsineerimisest rõhuga mesilastel Dalial Freitak Bioloogiliste interaktsioonide Tippkeskus Helsingi Ülikool Haigustekitajad on kõikjal Immunoloogiline mälu põlvkondade vaheline pärandumine

Rohkem

PowerPoint Presentation

PowerPoint Presentation [ hübridiseerimisoligod ja PCR praimerid ] Proov (hübridiseerimisoligod) homogeenne, standardselt märgitult lahuses Target otsitavad nukleiinhappe järjestused, heterogeenne, märkimata tahkel kandjal Hübridiseerimistehnika

Rohkem

Polümedel-M

Polümedel-M Polümedel-M Polümedel-M kujutab endast Polümedeli ja ferromagnetite sümbioosi. Polümeerne materjal (lavsaan) ühendatakse ferritoovsete osakestega. Saadud kilet töödeldakse alguses spetsiaalsete seadmete

Rohkem

Läkaköha toksiini vastaste IgG tüüpi antikehade tase läkaköhaga patsientide hulgas ning kolme aasta jooksul pärast haiguse põdemist

Läkaköha toksiini vastaste IgG tüüpi antikehade tase läkaköhaga patsientide hulgas ning kolme aasta jooksul pärast haiguse põdemist Läkaköha toksiini vastaste IgG tüüpi antikehade tase läkaköhaga patsientidel ning kolme aasta jooksul pärast haiguse põdemist Piia Jõgi 1,2,3, Marje Oona 4, Tanel Kaart 5, Karolin Toompere 4, Tereza Maskina

Rohkem

Microsoft Word - PKT_hindamine_soomullad_2011_LYHI

Microsoft Word - PKT_hindamine_soomullad_2011_LYHI Soostunud ja soomuldade orgaanilise süsiniku sisaldus ja vastavalt sellele 1:1 mullakaardi võimalik korrigeerimine Töö teostajad: Põllumajandusuuringute Keskuse Mullaseire büroo, kontaktisik Priit Penu

Rohkem

Microsoft PowerPoint - Kindlustuskelmus [Compatibility Mode]

Microsoft PowerPoint - Kindlustuskelmus [Compatibility Mode] Olavi-Jüri Luik Vandeadvokaat Advokaadibüroo LEXTAL 21.veebruar 2014 i iseloomustab Robin Hood ilik käitumine kindlustus on rikas ja temalt raha võtmine ei ole kuritegu. Näiteks näitavad Saksamaal ja USA-s

Rohkem

Tartu Ülikool

Tartu Ülikool Tartu Ülikool Code coverage Referaat Koostaja: Rando Mihkelsaar Tartu 2005 Sissejuhatus Inglise keelne väljend Code coverage tähendab eesti keeles otse tõlgituna koodi kaetust. Lahti seletatuna näitab

Rohkem

Microsoft Word - Document in Unnamed

Microsoft Word - Document in Unnamed RAVIMI OMADUSTE KOKKUVÕTE 1. VETERINAARRAVIMI NIMETUS Parofor, 140 mg/ml lahus joogivees, piimas või piimaasendajas manustamiseks sigadele ja vatsaseede eelsel perioodil vasikatele 2. KVALITATIIVNE JA

Rohkem

PowerPoint Presentation

PowerPoint Presentation Tuumormarkerite roll kasvajaliste haiguste diagnostikas ja ravis Marge Kütt AS Ida-Tallinna Keskhaigla kesklabor 12.10.2013, EBÜ koolitus Kasvajamarkeriteks võivad olla: Kasvajaspetsiifilised ained: kasvajaantigeenid,

Rohkem

KAASAV ELU RÜHM “TAKTIILNE“

KAASAV ELU RÜHM “TAKTIILNE“ KAASAV ELU RÜHM HEV ÕPPEVAHEND 17.05.2018 Grupp: Terje Isok Gerli Mikk Veronika Vahi, Merit Roosna, Tallinna Tervishoiu Kõrgkool Juhendajad: Jana Kadastik ja Tiia Artla PROJEKTI EESMÄRK Luua õppetööd

Rohkem

Sotsiaalministri 17. septembri a määrus nr 53 Tervise infosüsteemi edastatavate dokumentide andmekoosseisud ning nende säilitamise tingimused ja

Sotsiaalministri 17. septembri a määrus nr 53 Tervise infosüsteemi edastatavate dokumentide andmekoosseisud ning nende säilitamise tingimused ja Sotsiaalministri 17. septembri 2008. a määrus nr 53 Tervise infosüsteemi edastatavate dokumentide andmekoosseisud ning nende säilitamise tingimused ja kord Lisa 2 Statsionaarse epikriisi andmekoosseis

Rohkem

Praks 1

Praks 1 Biomeetria praks 6 Illustreeritud (mittetäielik) tööjuhend Eeltöö 1. Avage MS Excel is ankeedivastuseid sisaldav andmestik, 2. lisage uus tööleht, nimetage see ümber leheküljeks Praks6 ja 3. kopeerige

Rohkem

Microsoft Word - Kurtna koolitöötajate rahulolu 2012

Microsoft Word - Kurtna koolitöötajate rahulolu 2012 KURTNA KOOLITÖÖTAJATE RAHULOLU-UURINGU TULEMUSED Koostaja: Kadri Pohlak Kurtna 212 Sisukord Sissejuhatus... 3 Rahulolu juhtimisega... 4 Rahulolu töötingimustega... 5 Rahulolu info liikumisega... 6 Rahulolu

Rohkem

AASTAARUANNE

AASTAARUANNE 2014. 2018. aasta statistikatööde loetelu kinnitamisel juunis 2014 andis Vabariigi Valitsus Statistikaametile ja Rahandusle korralduse (valitsuse istungi protokolliline otsus) vaadata koostöös dega üle

Rohkem

Infektsioonide profülaktika ja ravi siirdatud haigetel

Infektsioonide profülaktika ja ravi siirdatud haigetel Infektsioonide diagnostika ja ravi ning vältimise võimalused Vivika Adamson Infektsioonikontrolli teenistus sügis2017 Sissejuhatus Siirdamisjärgsed infektsioonid Infektsioonide ajajoon Bakteriaalsed infektsioonid

Rohkem

IMO 2000 Eesti võistkonna valikvõistlus Tartus, aprillil a. Ülesannete lahendused Esimene päev 1. Olgu vaadeldavad arvud a 1, a 2, a 3,

IMO 2000 Eesti võistkonna valikvõistlus Tartus, aprillil a. Ülesannete lahendused Esimene päev 1. Olgu vaadeldavad arvud a 1, a 2, a 3, IMO 000 Eesti võistkonna valikvõistlus Tartus, 19. 0. aprillil 000. a. Ülesannete lahendused Esimene päev 1. Olgu vaadeldavad arvud a 1, a, a 3, a 4, a 5. Paneme tähele, et (a 1 + a + a 3 a 4 a 5 ) (a

Rohkem

Relatsiooniline andmebaaside teooria II. 6. Loeng

Relatsiooniline andmebaaside teooria II. 6. Loeng Relatsiooniline andmebaaside teooria II. 5. Loeng Anne Villems ATI Loengu plaan Sõltuvuste pere Relatsiooni dekompositsioon Kadudeta ühendi omadus Sõltuvuste pere säilitamine Kui jõuame, siis ka normaalkujud

Rohkem

KUI PATSIENT VAJAB KODUÕDE

KUI PATSIENT VAJAB KODUÕDE KUI PATSIENT VAJAB KODUÕDE ILVE-TEISI REMMEL JUHATAJA OÜ KODUÕDE KODUÕENDUS (HOME NURSING CARE) - KVALIFITSEERITUD ÕENDUSTEENUS, MIDA OSUTATAKSE ÄGEDA HAIGUSE PARANEMISPERIOODIS OLEVA, KROONILIST HAIGUST

Rohkem

EDL Liiga reeglid 1. ÜLDSÄTTED 1.1. EDL Liiga toimub individuaalse arvestuse alusel, kus mängijad on jagatud hooaja EDL Liiga tulemuste põhj

EDL Liiga reeglid 1. ÜLDSÄTTED 1.1. EDL Liiga toimub individuaalse arvestuse alusel, kus mängijad on jagatud hooaja EDL Liiga tulemuste põhj EDL Liiga reeglid 1. ÜLDSÄTTED 1.1. EDL Liiga toimub individuaalse arvestuse alusel, kus mängijad on jagatud hooaja 2017-2018 EDL Liiga tulemuste põhjal nelja liigasse. a. Premium Liiga (9 osalejat) b.

Rohkem

G OSA A VARIANT RESPONDENDILE ISE TÄITMISEKS

G OSA A VARIANT RESPONDENDILE ISE TÄITMISEKS G OSA A VARIANT RESPONDENDILE ISE TÄITMISEKS GS1 Järgnevalt on kirjeldatud lühidalt mõningaid inimesi. Palun lugege iga kirjeldust ja märkige igale reale, kuivõrd Teie see inimene on. Väga Minu Mõnevõrra

Rohkem

Untitled-2

Untitled-2 Tervise Alkeemia Hiina meditsiin on aastatuhandete vanune tarkus sellest, mis on tervis ning kuidas seda luua ja hoida. Tervise Alkeemia keskuse eesmärgiks on aidata taastada harmoonia ja tasakaal inimese

Rohkem

Slide 1

Slide 1 Tandeemsete korduste leidmise programme Triinu Kõressaar 10.11.2004 Kordusjärjestused (1): -Hajuskordusjärjestused SINE LINE LTR transposoonid pseudogeenid segmentide duplikatsioonid Kordusjärjestused

Rohkem

Microsoft Word - Bio G kogu 2008_1

Microsoft Word - Bio  G kogu 2008_1 BIOLOOGIA RIIGIEKSAMITE ÜLESANDEID Gümnaasiumi bioloogia riigieksamite 2000-2007 ülesannete koostamisel osalesid: Sirje Aher, Margus Harak, Helle Järvalt, Urmas Kokassaar, Lea Koppel, Saima Laos, Ene Lehtmets,

Rohkem

Euroopa Liidu Nõukogu Brüssel, 19. juuli 2019 (OR. en) 11128/19 PV CONS 40 SOC 546 EMPL 417 SAN 343 CONSOM 203 PROTOKOLLI KAVAND EUROOPA LIIDU NÕUKOGU

Euroopa Liidu Nõukogu Brüssel, 19. juuli 2019 (OR. en) 11128/19 PV CONS 40 SOC 546 EMPL 417 SAN 343 CONSOM 203 PROTOKOLLI KAVAND EUROOPA LIIDU NÕUKOGU Euroopa Liidu Nõukogu Brüssel, 19. juuli 2019 (OR. en) 11128/19 PV CONS 40 SOC 546 EMPL 417 SAN 343 CONSOM 203 PROTOKOLLI KAVAND EUROOPA LIIDU NÕUKOGU (tööhõive, sotsiaalpoliitika, tervise- ja tarbijakaitseküsimused)

Rohkem

Keemia koolieksami näidistöö

Keemia koolieksami näidistöö PÕLVA ÜHISGÜMNAASIUMI KEEMIA KOOLIEKSAM Keemia koolieksami läbiviimise eesmärgiks on kontrollida gümnaasiumilõpetaja keemiaalaste teadmiste ja oskuste taset kehtiva ainekava ulatuses järgmistes valdkondades:

Rohkem

TARTU ÜLIKOOL LOODUS- JA TÄPPISTEADUSTE VALDKOND MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT BIO- JA SIIRDEMEDITSIINI INSTITUUT Allan Tobi CendR-peptiidiga

TARTU ÜLIKOOL LOODUS- JA TÄPPISTEADUSTE VALDKOND MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT BIO- JA SIIRDEMEDITSIINI INSTITUUT Allan Tobi CendR-peptiidiga TARTU ÜLIKOOL LOODUS- JA TÄPPISTEADUSTE VALDKOND MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT BIO- JA SIIRDEMEDITSIINI INSTITUUT Allan Tobi CendR-peptiidiga suunatud terapeutiliste hõbeda nanoosakeste mõju eesnäärmekartsinoomi

Rohkem

(Microsoft Word - \334levaade erakondade finantsseisust docx)

(Microsoft Word - \334levaade erakondade finantsseisust docx) Ülevaade erakondade finantsmajanduslikust olukorrast seisuga 31.12.2010 Ülevaate eesmärgiks on kirjeldada erakondade rahalist seisu, mis annab informatsiooni nende tugevusest või nõrkusest, mis omakorda

Rohkem

ANOVA Ühefaktoriline dispersioonanalüüs Treeningu sagedus nädalas Kaal FAKTOR UURITAV TUNNUS Mitmemõõtmeline statistika Kairi Osula 2017/kevad

ANOVA Ühefaktoriline dispersioonanalüüs Treeningu sagedus nädalas Kaal FAKTOR UURITAV TUNNUS Mitmemõõtmeline statistika Kairi Osula 2017/kevad ANOVA Ühefaktoriline dispersioonanalüüs Treeningu sagedus nädalas Kaal FAKTOR UURITAV TUNNUS Factorial ANOVA Mitmefaktoriline dispersioonanalüüs FAKTOR FAKTOR Treeningu sagedus nädalas Kalorite kogus Kaal

Rohkem

Word Pro - digiTUNDkaug.lwp

Word Pro - digiTUNDkaug.lwp / näide: \ neeldumisseadusest x w x y = x tuleneb, et neeldumine toimub ka näiteks avaldises x 2 w x 2 x 5 : x 2 w x 2 x 5 = ( x 2 ) w ( x 2 ) [ x 5 ] = x 2 Digitaalskeemide optimeerimine (lihtsustamine)

Rohkem

Praks 1

Praks 1 Biomeetria praks 6 Illustreeritud (mittetäielik) tööjuhend Eeltöö 1. Avage MS Excel is oma kursuse ankeedivastuseid sisaldav andmestik, 2. lisage uus tööleht, nimetage see ümber leheküljeks Praks6 ja 3.

Rohkem

Microsoft PowerPoint - radiobiol2.ppt [Compatibility Mode]

Microsoft PowerPoint - radiobiol2.ppt [Compatibility Mode] Ioniseeriva kiirguse bioloogiline toime Inimene on pidevalt eksponeeritud kiirgusele Aine ja kiirguse vastasmõju faasid. Kiirguse molekulaarne toime ja kromosoomide aberratsioonid Kiirguse otsene toime

Rohkem

prakt8.dvi

prakt8.dvi Diskreetne matemaatika 2012 8. praktikum Reimo Palm Praktikumiülesanded 1. Kas järgmised graafid on tasandilised? a) b) Lahendus. a) Jah. Vahetades kahe parempoolse tipu asukohad, saame graafi joonistada

Rohkem

IGA ravitulemuse saavutamine ON PÕHJUS TÄHISTAMISEKS Varajase ja olulise molekulaarse ravivastuse saavutamine tähendab seda, et teie Ph+ KML allub rav

IGA ravitulemuse saavutamine ON PÕHJUS TÄHISTAMISEKS Varajase ja olulise molekulaarse ravivastuse saavutamine tähendab seda, et teie Ph+ KML allub rav IGA ravitulemuse saavutamine ON PÕHJUS TÄHISTAMISEKS Varajase ja olulise molekulaarse ravivastuse saavutamine tähendab seda, et teie Ph+ KML allub ravile. 1-3 Vaadake, mida saate oma järgmise ravivastuse

Rohkem

Eesti Energia muutuvas keskkonnas Olavi Tammemäe Keskkonnajuht

Eesti Energia muutuvas keskkonnas Olavi Tammemäe Keskkonnajuht Eesti Energia muutuvas keskkonnas Olavi Tammemäe Keskkonnajuht 2 Keskkonnanõuete muutumine ajas Eesti saab EL liikmeks koos regulatsiooniga + leevendused LCPD nõuded peamistele suurtele käitistele NECD

Rohkem

Kuidas kehtestada N&M

Kuidas kehtestada N&M Kehtestav suhtlemine Kuidas ennast kehtestada, kui Su alluv on naine/mees? Tauri Tallermaa 15. mai 2019 Suhtlemine Kui inimene suhtleb teise inimesega keele vahendusel, leiab aset miski, mida me mujal

Rohkem

Osakogumite kitsendustega hinnang Kaja Sõstra 1 Eesti Statistikaamet Sissejuhatus Valikuuringute üheks oluliseks ülesandeks on osakogumite hindamine.

Osakogumite kitsendustega hinnang Kaja Sõstra 1 Eesti Statistikaamet Sissejuhatus Valikuuringute üheks oluliseks ülesandeks on osakogumite hindamine. Osakogumite kitsendustega hinnang Kaja Sõstra 1 Eesti Statistikaamet Sissejuhatus Valikuuringute üheks oluliseks ülesandeks on osakogumite hindamine. Kasvanud on nõudmine usaldusväärsete ja kooskõlaliste

Rohkem

Antennide vastastikune takistus

Antennide vastastikune takistus Antennide vastastikune takistus Eelmises peatükis leidsime antenni kiirgustakistuse arvestamata antenni lähedal teisi objekte. Teised objektid, näiteks teised antennielemendid, võivad aga mõjutada antenni

Rohkem

Tootmine_ja_tootlikkus

Tootmine_ja_tootlikkus TOOTMINE JA TOOTLIKKUS Juhan Lehepuu Leiame vastused küsimustele: Mis on sisemajanduse koguprodukt ja kuidas seda mõõdetakse? Kuidas mõjutavad sisemajanduse koguprodukti muutused elatustaset? Miks sõltub

Rohkem

Microsoft PowerPoint - MKarelson_TA_ ppt

Microsoft PowerPoint - MKarelson_TA_ ppt Teaduspoliitikast Eestis kus me asume maailmas Mati Karelson 5/18/2006 1 TEADMISTEPÕHINE EESTI TEADUS TEHNOLOOGIA INNOVATSIOON 5/18/2006 2 TEADUS INIMRESSURSS INFRASTRUKTUUR KVALITEET 5/18/2006 3 TEADUSARTIKLITE

Rohkem

PowerPoint Presentation

PowerPoint Presentation Loote kasvupeetuse diagnostika Tiina Angerjas AS ITK Naistekliinik Mis on kasvupeetus (KP)? Loode ei saa saavutada oma geneetiliselt determineeritud potentsiaalset kaalu KP esineb kuni 10% populatsioonist

Rohkem

Sissejuhatus GRADE metoodikasse

Sissejuhatus GRADE metoodikasse Sissejuhatus GRADE metoodikasse Eriline tänu: Holger Schünemann ja GRADE working group www.gradeworkinggroup.org Kaja-Triin Laisaar TÜ peremeditsiini ja rahvatervishoiu instituut kaja-triin.laisaar@ut.ee

Rohkem